用于靶向递送应用的成纤维细胞激活蛋白配体的制作方法

用于靶向递送应用的成纤维细胞激活蛋白配体
1.前言
技术领域
2.本发明涉及成纤维细胞激活蛋白(fap)的配体，用于在疾病部位主动递送各种有效载荷(例如细胞毒性药物、放射性核素、荧光团、蛋白质和免疫调节剂)。特别地，本发明涉及用于靶向应用，特别是与疾病或病症(例如癌症、炎症或以fap过表达为特征的另一种疾病)有关的诊断方法和/或治疗或手术方法的fap配体的开发。


背景技术：

3.化疗仍然广泛应用于癌症患者和其他疾病的治疗。常规抗癌化疗剂作用于细胞存活的基本机制而无法区分健康细胞和恶性细胞。此外，这些药物在全身施用后不能有效地蓄积到疾病部位。非特异性作用机制和在肿瘤部位的低效定位是常规化疗不可持续性副作用和较差疗效的原因。
4.非常需要开发能够在全身施用后选择性地定位于疾病部位的靶向药物。产生此类药物的策略表现为治疗有效载荷(如细胞毒性药物或放射性核素)与疾病标志物特异性配体的化学缀合。疾病特异性单克隆抗体、肽和小配体已被认为是开发靶向药物产品的可选配体。与较大分子(如肽和抗体)相比，小配体用于靶向应用具有几个优势：更快速且有效的肿瘤穿透、更低免疫原性和更低生产成本。
5.前列腺特异性膜抗原特异的小有机配体、叶酸受体和碳酸酐酶ix在癌症的临床前模型和患者中显示出优异的生物分布特征。这些配体已与细胞毒性药物和放射性核素缀合以产生用于治疗癌症的小分子药物缀合物和小分子放射性缀合物产品(smdc和smrc)。177-镥-psma-617表示晚期smrc的实例，目前正在一项iii期试验中研究其用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌(mcrpc)患者(vision试验)。
6.成纤维细胞激活蛋白(fap)是膜结合明胶酶，其促进肿瘤生长和进展并在癌症相关成纤维细胞中过表达。由于fap在正常器官中低表达，所以它代表开发靶向smdc和smrc的理想靶标。
7.wo2019154886和wo2019154859描述了杂环化合物作为成纤维细胞激活蛋白-α抑制剂，用于治疗不同癌症类型。wo2019118932描述了取代的含n环状化合物作为成纤维细胞激活蛋白α抑制剂，用于治疗不同的病理状况。wo2019083990描述了成像和放射治疗靶向成纤维细胞激活蛋白-α(fap-α)化合物作为fap-α抑制剂，用于成像与fap-α相关的疾病和治疗增殖性疾病，并指出其中描述的4-异喹啉酰基和8-喹啉酰基衍生物的特征在于极低的fap亲和力。wo2013107820描述了用于治疗增殖性病症(例如癌症)和由组织重塑或慢性炎症(例如骨关节炎)指示的疾病的取代的吡咯烷衍生物。wo2005087235描述了吡咯烷衍生物作为二肽基肽酶iv抑制剂用于治疗ii型糖尿病。wo2018111989描述了包含成纤维细胞激活蛋白(fap)抑制剂、二价接头和例如近红外(nir)染料的缀合物，可用于去除癌症相关的成纤维细胞、体外细胞群成像和治疗癌症。
8.tsutsumi等人(药物化学杂志(j med chem)1994)描述了一系列α-酮杂环化合物的制备和体外脯氨酰内肽酶(pep)抑制活性。hu等人(生物有机化学与医药化学通讯(bioorg med chem lett)2005)描述了各种n-烷基gly-boro-pro衍生物对fap和其他两种二肽基肽酶的结构-活性关系。edosada等人(生物化学杂志(j biol chem)2006)描述了fap的二肽底物特异性和ac-gly-boropro fap选择性抑制剂的开发。gilmore等人(生物化学与生物物理学研究通讯(biochem biophys res commun)2006)描述了一系列二肽脯氨酸二苯基膦酸盐对dpp-iv和fap的设计、合成和动力学测试。tran等人(生物有机化学与医药化学通讯(bioorg med chem lett)2007)描述了各种n-酰基-gly-、n-酰基-sar-和n-blocked-boropro衍生物对抗fap的构效关系。tsai等人(药物化学杂志(j med chem)2010)描述了构效关系研究，这些研究获得许多对dpp-iv、dpp-ii、dpp8和dpp9具有出色的选择性的fap抑制剂。ryabtsova等人(生物有机化学与医药化学通讯(bioorg med chem lett)2012)描述了一系列n-酰化甘氨酰-(2-氰基)吡咯烷的fap抑制特性的合成和评价。poplawski等人(药物化学杂志(j med chem)2013)描述了n-(吡啶-4-羰基)-d-ala-boropro作为有效的选择性fap抑制剂。jansen等人(美国化学会药物化学通讯(acs med chem lett)2013)描述了基于n-(4-喹啉酰基)-gly-(2-氰基吡咯烷)支架的fap抑制剂。jansen等人(医学化学通讯(med chem commun)2014)基于利格列汀支架的fap抑制剂的构效关系。jansen等人(医学化学通讯(med chem commun))描述了具有低微摩尔效力的基于黄嘌呤的fap抑制剂。jansen等人(药物化学杂志(j med chem)2014)描述了基于n-4-喹啉酰基-gly-(2s)-cyanopro支架的fap抑制剂的构效关系。jackson等人(肿瘤形成(neoplasia)2015)描述了fap假肽抑制剂的开发。meletta等人(分子(molecules)2015)描述了使用基于硼酸的fap抑制剂作为动脉粥样硬化斑块的非侵入性成像示踪剂。等人(药物化学杂志(j med chem)2017)描述了用于靶向应用的含有fap特异性抑制剂的聚合物缀合物的制备。loktev等人(核医学杂志(j nucl med)2018)描述了基于fap特异性酶抑制剂的碘化和dota偶联放射性示踪剂的开发。lindner等人(核医学杂志(j nucl med)2018)描述了fap抑制剂用作治疗诊断示踪剂的修饰和优化。giesel等人(核医学杂志(j nucl med)2019)描述了作为fap抑制剂的基于喹啉的pet示踪剂的临床成像性能。
9.本发明待解决的问题
10.本发明的目的在于提供适用于靶向应用的改进的成纤维细胞激活蛋白(fap)结合物(配体)。该结合物应适合于抑制fap和/或将有效载荷(例如治疗剂或诊断剂)靶向递送至以fap过表达为特征的受疾病或病症折磨或有患该疾病或病症风险的部位。优选地，结合物应该与fap形成稳定的复合物，表现出增加的亲和力、增加的抑制活性、从复合物中解离的速度较慢和/或在疾病部位的停留时间延长。


技术实现要素：

11.本发明人已发现适用于靶向应用的成纤维细胞激活蛋白(fap)的新型有机配体。根据本发明的化合物(也称为配体或结合物)包含具有以下结构的小结合部分a：
[0012][0013]
根据本发明的化合物可以由以下通式i表示，
[0014][0015]
其单独的非对映异构体、其水合物、其溶剂化物、其晶型、其单独的互变异构体或其药学上可接受的盐，其中a是结合部分；b是共价键或包含共价附接部分a和c的原子链的部分；并且c是有效载荷部分。
[0016]
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含所述化合物和药学上可接受的赋形剂。
[0017]
本发明进一步提供了所述化合物或药物组合物用于通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法或对人体或动物体实施的诊断方法；以及通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法或对人体或动物体实施的诊断方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗或诊断有效量的所述化合物或药物组合物。
[0018]
本发明进一步提供了所述化合物或药物组合物用于治疗或预防患有或具有患疾病或病症风险的受试者的方法；以及用于治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向患有或具有患所述疾病或病症风险的受试者施用治疗或诊断有效量的所述化合物或药物组合物。
[0019]
本发明进一步提供了所述化合物或药物组合物用于对患有或具有患疾病或病症风险的受试者实施的引导手术的方法；以及用于引导手术的方法，该方法包括向患有或具有患疾病或病症风险的受试者施用治疗或诊断有效量的所述化合物或药物组合物。
[0020]
本发明进一步提供了所述化合物或药物组合物用于诊断疾病或病症的方法，该方法对人体或动物体实施并且涉及核医学成像技术，例如正电子发射断层扫描(pet)；以及用于诊断疾病或病症的方法，该方法对人体或动物体实施并且涉及核医学成像技术，例如正电子发射断层扫描(pet)，并且包括向有需要的受试者施用治疗或诊断有效量的所述化合物或药物组合物。
[0021]
本发明进一步提供了所述化合物或药物组合物用于将治疗剂或诊断剂靶向递送至患有或具有患疾病或病症风险的受试者的方法；以及用于将治疗或诊断有效量的所述化合物或药物组合物靶向递送至患有或具有患疾病或病症风险的受试者的方法。
[0022]
优选地，上述疾病或病症以fap的过表达为特征并且独立地选自癌症、炎症、动脉
粥样硬化、纤维化、组织重塑和瘢痕疙瘩病症，优选地其中癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、耐多药结肠癌、直肠癌、结直肠癌、转移性结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞、膀胱癌、胆管癌、肾透明细胞癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、cup(原发灶不明癌)、胸腺癌、硬纤维瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、肾癌和前列腺癌。更优选地，疾病或病症选自黑色素瘤和肾细胞癌。
附图说明
[0023]
图1：化合物(a)esv6-fluo(26)和(b)haberkorn-fluo(23)的化学结构和lc/ms图谱。
[0024]
图2：重组hfap的质量控制：a)sds-page；b)尺寸排阻色谱(superdex 200increase 10/300gl)。
[0025]
图3：化合物esv6-fluo(26)和haberkorn-fluo(23)与hfap的共洗脱pd-10实验。hfap与小配体esv6-fluo和haberkorn-fluo之间形成稳定复合物。
[0026]
图4：通过荧光偏振测定人成纤维细胞激活蛋白(hfap)的小有机配体的亲和力。与先前描述的配体haberkorn-fluo(23)(kd为0.89nm)相比，esv6-fluo(26)对hfap的亲和力更高(kd为0.78nm)。
[0027]
图5：小有机配体存在下的hfap抑制实验。与先前描述的配体haberkorn配体(h6)(24.6nm)相比，esv6配体(p3)显示出较低ic50(20.2nm)。
[0028]
图6：来自hfap的esv6-fluo(26)和haberkorn-fluo(23)的解离速率测量。与haberkorn-fluo(回归系数＝
–
0.075112)相比，esv6-fluo解离的速度较慢(回归系数＝
–
0.093564)。
[0029]
图7：irdye 750缀合物在静脉内施用后(150nmol/kg剂量)在荷有sk-mel-187黑色素瘤异种移植物的balb/c nu/nu小鼠的近红外荧光成像中的靶向性能评价。(a)不同时间点(注射后5min、20min和1h)的活体动物图像。(b)提供2h时的离体器官图像。与haberkorn-irdye750(17)相比，化合物esv6-irdye750(18)，高亲和力fap配体“esv6”的衍生物，显示出更高的肿瘤与肝脏、肿瘤与肾脏和肿瘤与肠摄取比。qcooh-irdye750(16)(非靶向对照)在体内不定位于sk-mel-187病灶。
[0030]
图8：(a)esv6-valcit-mmae(21)和haberkorn-valcit-mmae(20)在sk-mel-187荷瘤小鼠中的治疗活性评估。数据点表示平均肿瘤体积
±
sem(每组n＝3)。箭头表示不同治疗的iv感染。与haberkorn-valcit-mmae相比，esv6-valcit-mmae，高亲和力fap配体“esv6”的药物缀合物衍生物，显示出更有效的抗肿瘤作用。(b)通过评价实验期间动物体重的变化(％)评估不同治疗的耐受性。与haberkorn-valcit-mmae相比，esv6-valcit-mmae表现出较低急性毒性。
[0031]
图9：不同小有机配体存在下的hfap抑制实验。与化合物24(33.46nm，较低抑制)相比，实施例2的化合物p4显示出较低ic
50
(16.83nm，较高抑制)。
[0032]
图10：通过荧光偏振(fp)测定人和鼠成纤维细胞激活蛋白的小有机配体的亲和力。(a)与缀合物25(kd＝1.02nm)相比，缀合物15显示出对hfap(kd＝0.68nm)具有更高亲和力。(b)与缀合物25(kd＝30.94nm)相比，缀合物15显示出对mfap(kd＝11.61nm)具有更高亲
和力。与缀合物25相比，缀合物15表现出对hfap具有优异的结合特性，并且对鼠抗原具有更优的交叉反应性。(c)缀合物15和25的结构。
[0033]
图11：小分子配体缀合物15与hfap(a)和mfap(b)的共洗脱pd-10实验。在蛋白质和小配体缀合物15之间形成稳定的复合物，使得两个分子一起共洗脱。
[0034]
图12：通过共聚焦显微镜和facs分析评价缀合物15(10nm)在sk-rc-52.hfap、ht-1080.hfap和野生型肿瘤细胞上的选择性蓄积。(a)sk-rc-52.hfap在不同时间点(t＝0和1h)与化合物一起温育的图像显示缀合物15在细胞膜上蓄积。(b)sk-rc-52野生型在与化合物温育后的图像显示在细胞膜上没有蓄积(阴性对照)。(c)对sk-rc-52野生型(深灰色峰)和sk-rc-52.hfap(浅灰色峰)的facs分析显示缀合物15(10nm)的fap特异性细胞结合。(d)ht-1080.hfap在不同时间点(t＝0和1h)与化合物一起温育的图像显示缀合物15在细胞膜和胞液内的蓄积。(e)ht-1080野生型与化合物温育后的图像显示细胞膜和胞液中没有蓄积(阴性对照)。(f)对ht-1080野生型(深灰色峰)和ht-1080.hfap(浅灰色峰)的facs分析显示缀合物15(10nm)的fap特异性细胞结合。
[0035]
图13：缀合物15在静脉内施用(40nmol)后在荷有sk-rc-52.hfap肾细胞癌异种移植物的balb/c nu/nu小鼠中的靶向性能评价。提供施用后1h时的离体器官图像。静脉内注射后1小时，该化合物在体内快速且均匀地定位于肿瘤部位，具有高肿瘤对器官选择性。
[0036]
图14：放射性化合物的放射性hplc图谱。(a)用
177
lu(r.t.11min)标记后缀合物9的放射性hplc图谱。(b)游离
177
lu(2min)的放射性hplc图谱。放射性标记后，缀合物9显示为单峰，转化率》99％。
[0037]
图15：缀合物9(其包括
177
lu放射性有效载荷)在荷有sk-rc-52.hfap肾细胞癌异种移植物的balb/c nu/nu中的生物分布实验。(a)静脉内施用缀合物9(剂量＝50nmol/kg；0.5-2mbq)后不同时间点(10min、1h、3h和6h)时肿瘤和健康器官中的％id/g和肿瘤与器官比分析。(b)以不同剂量(125nmol/kg、250nmol/kg、500nmol/kg和1000nmol/kg；0.5-2mbq)静脉内施用
177
lu缀合物9后3h，肿瘤和健康器官中的％id/g和肿瘤与器官比分析。可以观察到剂量依赖性反应，并且可以在250nmol/kg和500nmol/kg之间达到目标饱和度。(c)静脉内施用
177
lu溶液(阴性对照；1mbq)后3h肿瘤和健康器官中的％id/g和肿瘤与器官比分析。
[0038]
图16：irdye 750缀合物18在静脉内施用(剂量为150nmol/kg)后在荷有sk-mel-187(右侧腋下)和k-rc-52.hfap(左侧腋下)异种移植物的balb/c小鼠的近红外荧光成像中的靶向性能评价。(a)注射前(t＝0)和静脉内注射后30分钟的活体动物图像。(b)提供60分钟时的离体器官图像。化合物esv6-irdye750(18)蓄积于sk-rc-52.hfap和sk-mel-187肿瘤，与sk-mel-187相比，由于fap表达更高，因此在sk-rc-52.hfap肿瘤中蓄积更高。
[0039]
图17：不同小有机配体存在下的hfap抑制实验。与实施例2，p4相比，缀合物28显示出较低的fap抑制特性。缀合物29，在氰基吡咯烷头段和吡啶环之间包括l-丙氨酸构成单元，在测定中测试的浓度下不抑制fap蛋白水解活性。
[0040]
图18：irdye 750缀合物18在静脉内施用(剂量为150nmol/kg)后在荷有ht-1080.hfap和sk-rc-52.wt异种移植物的balb/c nu/nu小鼠的近红外荧光成像中的靶向性能评价。提供1h时的离体器官图像。化合物esv6-irdye750(18)选择性地蓄积于表现出fap表达的ht-1080.hfap肿瘤并且在sk-rc-52.wt中不蓄积。
[0041]
图19：(a)缀合物30在静脉内施用(40nmol)后在荷有sk-rc-52.hfap(右侧腋下)和
sk-rc-52.wt(左侧腋下)异种移植物的balb/c nu/nu小鼠中的靶向性能。提供施用后1小时的离体器官图像。该化合物在静脉内注射后1小时在体内快速、均匀和选择性地定位于表现出fap表达的肿瘤，具有优异的肿瘤对器官选择性。(b)esv6-alexa fluor 488(30)的结构。
[0042]
图20：(a)缀合物30在静脉内施用(40nmol)后在荷有ht-1080.hfap(右侧腋下)和sk-rc-52.wt(左侧腋下)异种移植物的balb/c nu/nu小鼠中的靶向性能评价。提供施用后1h的离体器官图像。该化合物在静脉内注射后1小时在体内快速、均匀和选择性地定位于表现出fap表达的肿瘤，具有优异的肿瘤对器官选择性。(b)esv6-alexa fluor 488(30)的结构。
[0043]
图21：(a)sk-rc-52.hfap荷瘤小鼠中esv6-valcit-mmae(21)和qcoh-valcit-mmae(19)治疗活性的评估。数据点表示平均肿瘤体积
±
sem(每组n＝4)。从第8天开始，连续6天静脉内施用化合物(尾静脉注射)。与分子的非靶向形式qcooh-valcit-mmae(19)相比，esv6-valcit-mmae(21)，高亲和力fap配体“esv6”的药物缀合衍生物，显示出更有效的抗肿瘤作用。(b)通过评价实验期间动物体重的变化(％)评估不同治疗的耐受性。(c)esv6-valcit-mmae(21)和qcooh-valcit-mmae(19)的结构。
[0044]
图22：(a)esv6-valcit-mmae(21)、l19-il2及其组合在sk-rc-52.hfap荷瘤小鼠中的治疗活性评估。数据点表示平均肿瘤体积
±
sem(每组n＝4)。在第8、10、12天静脉内施用(尾静脉注射)esv6-valcit-mmae。在第9、11、13天静脉内施用(尾静脉注射)l19-il2。与l19-2单独使用相比，esv6-valcit-mmae与l19-il2联合使用显示出非常有效的抗肿瘤作用(4/4完全肿瘤消退)。(b)通过评价实验期间动物体重的变化(％)评价不同治疗的耐受性。
[0045]
图23：小分子-药物缀合物esv6-valcit-mmae(21)在右侧腋下荷有sk-rc-52.hfap和左侧腋下荷有sk-rc-52.wt的balb/c nu/nu小鼠中的定量生物分布实验。该化合物在fap阳性sk-rc-52肿瘤中选择性蓄积(即，在肿瘤部位18％id/g，静脉内施用后6小时)。相反，esv6-valcit-mmae未在fap阴性sk-rc-52野生型肿瘤中蓄积。缀合物在健康器官中的摄取可忽略不计(低于1％id/g)。
[0046]
图24：缀合物27(其包括
69
ga有效载荷)在小鼠血清中的稳定性研究。温育后0和6小时处理样品的hplc和lc/ms图谱显示具有正确质量的单峰(预期质量：1028.30。ms(es )m/z 514.3(m 2h))
[0047]
图25：缀合物15的结构、色谱图和lc/ms分析。ms(es )m/z1348.36(m 1h)

。
[0048]
图26：esv6-valcit-mmae(21)的结构、色谱图和lc/ms分析。ms(es )m/z 1118.05(m 2h)
2
。
[0049]
图27：esv6-dotaga(8)的结构、色谱图和lc/ms分析。ms(es )m/z 960.39(m h)

。
[0050]
图28：实施例2，p4的结构、色谱图和lc/ms分析。ms(es )m/z460.21(m h)

。
具体实施方式
[0051]
本发明人已经鉴定了适用于靶向应用的成纤维细胞激活蛋白(fap)的小分子结合物。根据本发明的结合物提供对fap的高抑制、对fap的高亲和力和/或适用于将有效载荷(例如治疗剂或诊断剂)靶向递送至以fap过表达为特征的受疾病或病症折磨或具有患该疾病或病症风险的部位。根据本发明的结合物与fap形成稳定的复合物，显示出增加的亲和力、增加的抑制活性、较慢的从复合物解离速率和/或延长的在疾病部位的停留时间。根据
本发明的结合物还可以具有增加的肿瘤与肝脏、肿瘤与肾脏和/或肿瘤与肠的摄取比；更有效的抗肿瘤作用(例如，通过平均肿瘤体积增加来测量)和/或较低的毒性(例如，通过评估体重变化(％)来评估)。根据本发明的结合物还可以对人和鼠成纤维细胞激活蛋白具有高的或改进的亲和力和/或对鼠抗原的交叉反应性。本发明的结合物优选地获得fap特异性细胞结合；fap在细胞膜上选择性蓄积；fap在胞液内选择性蓄积。根据本发明的结合物可以进一步优选地、快速且均匀地定位于体内肿瘤部位，具有高肿瘤对器官选择性，特别是对于黑色素瘤和/或肾细胞癌。根据本发明的包含放射性有效载荷(例如，
177
lu)的结合物优选地获得剂量依赖性反应，目标饱和度达到250nmol/kg至500nmol/kg，在静脉施用后达到和/或保持长达12h，更优选地1至9h，还更优选地3至6h。
[0052]
如上所述，本发明提供了一种化合物、其单独的非对映异构体、其水合物、其溶剂化物、其晶型、其单独的互变异构体或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含具有以下结构的部分a：
[0053][0054]
如上所述，根据本发明的化合物可以由式i表示：
[0055][0056]
其中b是共价键或包含将a共价附接至c的原子链的部分；并且c可以是原子、分子或颗粒，和/或是治疗剂或诊断剂。
[0057]
因此，根据本发明的化合物可以包含具有以下结构的部分：
[0058][0059]
其中b是共价键或包含原子链共价结合的原子的部分。
[0060]
部分a
[0061]
不希望受任何理论束缚，设想这些出乎意料的技术效果与小结合部分a的特定结构相关，其中喹啉环在8-位被含氮基团(例如氨基或酰胺基)取代：
[0062][0063]
先前已经表明，化合物的较高靶蛋白亲和力导致体内肿瘤停留时间更长(wichert等人，自然化学(nature chemistry)7,241
–
249(2015))。与现有技术的化合物相比，本发明的化合物对于fap具有增加的亲和力、较慢的解离速率，因此也被认为在治疗或诊断相关水平上具有在疾病部位延长的停留时间，优选地注射后超过1h，更优选地超过6小时。优选地，在5min、10min、20min、30min、45min、1h、2h、3h、4h、5h或6h后达到最高富集；和/或注射后持续一段时间或至少5min、10min、20min、30min、45min、1h、2h、3h、4h、5h或6h，更优选地超过6h在疾病部位的富集保持在治疗或诊断相关水平。
[0064]
优选地，结合部分a具有以下结构a1；更优选地以下结构a2，其中m为0、1、2、3、4或5，优选为1：
[0065][0066][0067]
部分b
[0068]
部分b是共价键或包含例如通过一个或多个共价键将a共价附接至有效载荷c的原子链的部分。部分b可以是可切割的或不可切割的、双官能或多官能部分，其可用于连接一个或多个有效载荷和/或结合物部分以形成本发明的靶向缀合物。在一些实施方案中，化合物的结构每个分子独立地包含多于一个部分a，优选地2、3、4、5、6、7、8、9或10个部分a；和/或多于一个部分c，优选地2、3、4、5、6、7、8、9或10个部分c。优选地，化合物的结构每个分子包含2个部分a和1个部分c；或1个部分a和2个部分c。
[0069]
当部分b中存在可切割的接头单元时，释放机制可与细胞毒性有效载荷连接的抗体特异性的释放机制相同。实际上，结合部分的性质在这方面是独立的。因此，设想了ph依赖性[leamon,c.p.等人(2006)生物缀合化学(bioconjugate chem.),17,1226；casi,g.等人(2012)美国化学会志(j.am.chem.soc.),134,5887]、还原性[bernardes,g.j.等人(2012)angewandte chemie英文国际版(angew.chem.int.ed.engl.),51.941；yang,j.等人
(2006)美国科学院院报(proc.natl.acad.sci.usa),103,13872]和酶促释放[doronina s.o.等人(2008)生物缀合化学(bioconjugate chem),19,1960；sutherland,m.s.k.(2006)生物化学杂志(j.biol.chem),281,10540]。在特定环境下，当结合部分或有效载荷(例如硫醇、醇)上存在官能团时，可以建立无接头连接，从而释放完整的有效载荷，这大大简化了药代动力学分析。
[0070]
部分b可以包含下表1中所示的单元或由其组成，其中式中所示的取代基r和rn可以适当地独立地选自h、卤素、取代的或未取代的(杂)烷基、(杂)烯基、(杂)炔基、(杂)芳基、(杂)芳基烷基、(杂)环烷基、(杂)环烷基芳基、杂环基烷基、肽、寡糖或类固醇基团。优选地，r、r1、r2和r3中的每一个独立地选自h、oh、sh、nh2、卤素、氰基、羧基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基，它们各自是被取代的或未被取代的。适当地，r和rn独立地选自h、或c1-c7烷基或杂烷基。更适当地，r和rn独立地选自h、甲基或乙基。
[0071]
表1
[0072][0073]
部分b、单元b
l
和/或单元bs可以适当地包含二硫键作为可切割键，因为这些键对水解是稳定的，同时在体内靶标处提供合适的药物释放动力学，并且可以提供药物部分(包括硫醇基团)的无痕切割。
[0074]
部分b、单元b
l
和/或单元bs可以是极性的或带电荷的，以提高缀合物的水溶性。例如，接头可以包含一种或多种已知水溶性低聚物(例如肽、寡糖、糖胺聚糖、聚丙烯酸或其盐、聚乙二醇、聚羟乙基(甲基)丙烯酸酯、聚磺酸酯等)的约1个至约20个、适当地约2个至约
10个残基。适当地，接头可以包含极性或带电荷的肽部分，其包含例如2至10个氨基酸残基。氨基酸可以指任何天然或非天然氨基酸。肽接头适当地包括游离硫醇基团，优选地n-末端半胱氨酸，用于与药物部分上的硫醇基团形成所述可切割的二硫键。任何含有l-或d-氨基酸的肽均是合适的；这种类型的特别合适的肽接头是asp-arg-asp-cys和/或asp-lys-asp-cys。
[0075]
在这些和其他实施方案中，部分b、单元b
l
和/或单元bs可以包含可切割的或不可切割的肽单元，该肽单元被特别定制，使得其将被细胞表面或靶组织的细胞外区域上的一种或多种蛋白酶从药物部分选择性地酶切。肽单元的氨基酸残基链长度适当地在从单个氨基酸至约八个氨基酸残基的范围内。适用于本发明的大量特异性可切割肽序列可以被设计并优化它们对特定肿瘤相关酶(例如蛋白酶)的酶促切割的选择性。用于本发明的可切割肽包括那些针对蛋白酶mmp-1、2或3，或组织蛋白酶b、c或d优化的肽。特别合适的是可被组织蛋白酶b切割的肽。组织蛋白酶b是普遍存在的半胱氨酸蛋白酶。它是细胞内酶，除了在病理情况下，例如转移性肿瘤或类风湿性关节炎。可被组织蛋白酶b切割的肽的实例是含有序列val-cit。
[0076]
在任何上述实施方案中，部分b，特别是单元b
l
适当地进一步包含可以或不可以存在于接头之后的自牺牲(self-immolative)部分。自牺牲接头也称为电子级联接头。这些接头在肽的酶促切割后经历消除和断裂，以释放活性药物，优选地游离形式。在不存在能够切割接头的酶的情况下，缀合物在细胞外是稳定的。然而，在暴露于合适的酶后，接头被切割，引发自发的自牺牲反应，导致切割自牺牲部分与药物共价连接的键，从而影响药物以未衍生化或药理学活性形式释放。在这些实施方案中，自牺牲接头通过酶促切割肽序列与结合部分偶联，该肽序列为酶切割酰胺键以启动自牺牲反应提供底物。适当地，药物部分通过药物悬垂的化学反应性官能团(例如伯胺或仲胺、羟基、巯基或羧基)与接头的自牺牲部分连接。
[0077]
自牺牲接头的实例是pabc或pab(对氨基苄氧基羰基)，将药物部分附接至缀合物中的结合部分(carl等人(1981)药物化学杂志(j.med.chem.)24:479-480；chakravarty等人(1983)药物化学杂志(j.med.chem.)26:638-644)。连接肽单元的羧基末端和pab的对氨基苄基的酰胺键可以是底物并且可被某些蛋白酶切割。芳香胺成为电子供体并引发电子级联，导致离去基团的排出，在消除二氧化碳后释放游离药物(de groot等人(2001)有机化学杂志(journal of organic chemistry)66(26):8815-8830)。在wo2005/082023中描述了另外的自牺牲接头。
[0078]
在又其他实施方案中，接头包含可被存在于细胞表面或靶组织的细胞外区域上的葡糖醛酸酶切割的葡糖醛酸基。已经表明溶酶体β-葡萄糖醛酸酶在人癌症的坏死区域以高局部浓度在细胞外释放，这提供了靶向化疗的途径(bosslet,k.等人癌症研究(cancer res.)58,1195-1201(1998))。
[0079]
在任何上述实施方案中，部分b适当地还包含间隔单元。间隔单元可以是单元bs，其可以例如通过酰胺、胺或硫醚键被连接至结合部分a。间隔单元的长度能够使例如可切割肽序列与切割酶(例如组织蛋白酶b)接触以及还适当地水解可切割肽与自牺牲部分x偶联的酰胺键。间隔单元可以例如包含二价基团，例如亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、烷氧基(例如聚乙烯氧基、peg、聚亚甲氧基)和烷氨基(例如聚乙烯氨基)的重复单元，或二酸酯和酰胺，
包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
[0080]
在其中描述的任何实施方案中，*表示与部分a的附接点或其到部分a的最短路径包含的原子少于
·
到部分a的最短路径包含的原子的附接点，视情况而定；并且
·
表示与部分c的附接点或其到部分c的最短路径包含的原子少于*到部分c的最短路径包含的原子的附接点，视情况而定。这同样适用于存在反应性部分l而不是有效载荷部分c的情况。以下符号和全部内容均具有特定基团或原子(例如，r)与其他部分的附接点的含义：
[0081][0082]
如果相关的结构是肽单聚体或寡聚体，则每个*表示附接点，其到部分a的最短路径包含的原子少于
·
到部分a的最短路径包含的原子；并且每个
·
表示附接点，其到部分c的最短路径包含的原子少于*到部分c的最短路径包含的原子，条件是当n》1并且在ra、rb和rc中的任何一个上指示相应的连接点时，它可以独立地存在于肽单体单元中的一个或多个中，优选地存在于距离相应结构中指示的另一个附接点最远的肽单体单元中。
[0083]
在本文所述的任何实施方案中，术语“肽”、“二肽”、“三肽”、“四肽”等是指具有由蛋白质和/或非蛋白质氨基酸形成的骨架的肽单体或寡聚物。如本文所用，术语“氨酰基”或“氨基酸”通常是指任何蛋白质或非蛋白质氨基酸。优选地，在其中公开的任何实施方案中，蛋白质或非蛋白质氨基酸的侧链残基由ra、rb和rc中的任一个表示，其各自选自以下列表：
[0084][0085][0086]
其中r、r1、r2和r3中的每一个独立地选自h、oh、sh、nh2、卤素、氰基、羧基、烷基、环
烷基、芳基和杂芳基，其各自被取代或未被取代；
[0087]
每个x独立地选自nh、nr、s、o和ch2，优选为nh；以及
[0088]
每个n和m独立地为整数，优选地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
[0089]
优选地，在其中公开的任何实施方案中，蛋白质或非蛋白质氨基酸的侧链残基由ra、rb和rc中的任一个表示，
[0090]
它们中的每一个均可以是3元、4元、5元、6元或7元环的一部分。例如，所述蛋白质或非蛋白质氨基酸的侧链α、β和/或γ位置可以是例如以下氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)中的环结构的一部分，该环结构选自氮杂环丁烷环、吡咯烷环和哌啶环：
[0091][0092]
它们中的每一个可以独立地是不饱和结构的一部分(即其中不存在与各自基团ra、rb和rc成对的h原子)，例如：
[0093][0094]
进一步优选的非蛋白氨基酸可以选自以下列表：
[0095][0096]
部分b以及根据本发明的化合物的特别优选的实施方案在所附权利要求中示出。
[0097]
优选地，b由以下通式ii-v中的任一个表示，其中：
[0098][0099]
每个x为独立地选自0至100、优选为0至50、更优选为0至30的范围的整数，又更优选地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；
[0100]
每个y为独立地选自0至30的范围的整数，优选地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，16、17、18、19和20；
[0101]
每个z为独立地选自0至5的范围的整数，优选地选自0、1、2、3和4；以及
[0102]
*表示与部分a的附接点；和
[0103]
·
表示与部分c的附接点，其中：
[0104]
(a)bs和/或b
l
是包含独立地选自由以下组成的组的结构单元或由其组成的基团：亚烷基、环亚烷基、芳基亚烷基、杂芳基亚烷基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、芳基亚烯基、杂芳基亚烯基、杂亚烯基、杂环亚烯基、亚炔基、杂亚炔基、亚芳基、杂亚芳基、氨基酰基、氧化烯、氨基亚烷基、二酸酯、二烷基硅氧烷、酰胺、硫代酰胺、硫醚、硫酯、酯、氨基甲酸酯、腙、噻唑烷、亚甲基烷氧基氨基甲酸酯、二硫化物、亚乙烯基、亚胺、亚胺酰胺、磷酰胺、糖类、磷酸酯、磷酰胺、氨基甲酸酯、二肽、三肽、四肽，其各自被取代或未被取代；和/或
[0105]
(b)bs和/或b
l
是包含独立地选自由以下组成的组的结构单元或由其组成的基团：
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110][0111]
其中r、r1、r2和r3中的每一个独立地选自h、oh、sh、nh2、卤素、氰基、羧基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基，其各自被取代或未被取代；
[0112]
r4和r5中的每一个独立地选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基，其各自被取代或未被取代；
[0113]
ra、rb和rc中的每一个独立地选自蛋白质或非蛋白质氨基酸的侧链残基，其各自可以被进一步取代；
[0114]
每个x独立地选自nh、nr、s、o和ch2，优选为nh；
[0115]
n和m中的每一个独立地为0至100、优选为0至50、更优选为0至30的整数，又更优选地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
[0116]
其中每个*表示附接点，其到部分a的最短路径包含的原子少于
·
到部分a的最短路径包含的原子；并且每个
·
表示附接点，其到部分c的最短路径包含的原子少于*到部分c的最短路径包含的原子；和/或
[0117]
(c)一个或多个b
l
独立地包含以下结构单元中的一个或多个或由其组成：
[0118]
[0119][0120]
其中在上述各结构中，n为1、2、3或4；以及
[0121]
每个*表示附接点，其到部分a的最短路径包含的原子少于
·
到部分a的最短路径包含的原子；每个
·
表示附接点，其到部分c的最短路径包含的原子少于*到部分c的最短路径包含的原子，条件是当n》1并且在ra、rb和rc中的任何一个上指示相应的附接点时，它可以独立地存在于肽单体单元中的一个或多个中，优选地存在于距离相应结构中指示的另一个附接点最远的肽单体单元中；和/或
[0122]
(d)b
l
和bs中的一个或多个独立地选自以下结构：
[0123][0124]
*
–
val-ala
–
·
；*
–
val-lys
–
·
；*
–
val-arg
–
·
，
[0125]
其中每个*表示附接点，其到部分a的最短路径包含的原子少于
·
到部分a的最短路径包含的原子；并且每个
·
表示附接点，其到部分c的最短路径包含的原子少于*到部分c的最短路径包含的原子；和/或
[0126]
(e)y为1、2或3；和/或至少一个b
l
进一步包含独立地选自以下结构的可切割接头基团：
[0127][0128]
每个*表示附接点，其到部分a的最短路径包含的原子少于
·
到部分a的最短路径包含的原子；并且每个
·
表示附接点，其到部分c的最短路径包含的原子少于*到部分c的最短路径包含的原子。
[0129]
优选地，b可以如上定义和/或具有以下结构：
[0130]
[0131]
其中b's和b”s各自独立地选自由以下组成的组：
[0132][0133]
每个b
l
独立地选自由以下组成的组：
[0134][0135]
每个n为0、1、2、3、4或5；
[0136]
每个m为0、1、2、3、4或5；
[0137]
每个x'为0、1或2；
[0138]
每个x’'为0、1或2；
[0139]
每个y为0、1或2；以及
[0140]
z为1或2，
[0141]
其中r、r1、r2、r3、ra、rb、rc、x、*和
·
如上所定义。
[0142]
更优选地，根据本发明的化合物具有由下式中的一个表示的结构：
[0143]
[0144]
[0145]
[0146][0147]
部分c
[0148]
本发明中的部分c表示有效载荷，其通常可以是任何原子(包括h)、分子或颗粒。优选地，部分c不是氢原子。
[0149]
有效载荷可以是用于放射性标记的螯合剂。适当地，不释放放射性核素。螯合剂是本领域技术人员熟知的，例如，包括螯合剂，例如硫胶体、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、乙二胺四乙酸(edta)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n”,n”'-四乙酸(dota)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷,n-(戊二酸)-n',n”,n”'-三乙酸(dotaga)、1,4,7-三氮杂环壬烷-n,n',n
”‑
三乙酸(nota)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-n,n',n”,n”'-四乙酸(teta)，或所附权利要求中所述的任何优选的螯合剂结构。
[0150]
有效载荷可以是包含放射性同位素或由其组成的放射性基团，该放射性同位素包括例如
223
ra、
89
sr、
94m
tc、
99m
tc、
186
re、
188
re、
203
pb、
67
ga、
68
ga、
47
sc、
111
in、
97
ru、
62
cu、
64
cu、
86
y、
88
y、
90
y、
121
sn、
161
tb、
153
sm、
166
ho、
105
rh、
177
lu、
123
i、
124
i、
125
i、
131
i、
18
f、
211
at、
225
ac、
89
sr、
225
ac、
117m
sn和
169
e。优选地，正电子发射体，例如
18
f和
124
l，或伽马发射体，例如
99m
tc、
111
in和
123
i，用于诊断应用(例如，用于pet)，而β-发射体，例如
89
sr、
13
1i和
177
lu，优选用于治疗应用。α-发射体，例如
211
at、
225
ac和
223
ra也可用于治疗。在一个优选实施方案中，放射性同位素是
89
sr
或
223
ra。在进一步优选的实施方案中，放射性同位素是
68
ga。
[0151]
有效载荷可以是放射性同位素，优选为以上列出的同位素，以及螯合剂，优选为以上列出的螯合剂或所附权利要求9(a)中所述的任何优选的螯合剂结构；或选自权利要求9(c)中所列结构的基团。
[0152]
有效载荷可以是荧光基团，优选地选自呫吨染料、吖啶染料、噁嗪染料、花青染料、苯乙烯基染料、香豆素染料、卟啉染料、荧光金属-配体-复合物、荧光蛋白、纳米晶体、苝染料、硼-二吡咯亚甲基染料和酞菁染料，更优选地选自权利要求9(d)中列出的结构。
[0153]
有效载荷可以是细胞毒剂和/或细胞抑制剂。此类试剂可以抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞的破坏。细胞毒剂的实例包括放射性同位素、化疗剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其合成类似物和衍生物。细胞毒剂可以选自由奥瑞他汀、dna小沟区结合剂、dna小沟区烷化剂、烯二炔、lexitropsin、倍癌霉素(duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素(puromycin)、多拉司他汀(dolastatin)、美登醇(maytansinoid)和长春花生物碱或其两种或更多种的组合。优选的细胞毒性和/或细胞抑制有效载荷部分在权利要求9(e)中列出。
[0154]
在一个实施方案中，有效载荷选自由以下组成的组：拓扑异构酶抑制剂、烷化剂(例如，氮芥类；乙撑亚胺类(ethylenimes)；烷基磺酸盐类；三氮烯类；哌嗪类；和亚硝基脲类)、抗代谢物(例如，巯嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶)、抗生素(例如，蒽环类、放线菌素、博来霉素、阿霉素、光辉霉素、放线菌素)、有丝分裂破坏剂(例如，植物生物碱——例如长春新碱和/或微管拮抗剂——例如紫杉醇)、dna甲基化剂、dna嵌入剂(例如，卡铂和/或顺铂、道诺霉素和/或多柔比星和/或博来霉素和/或沙利度胺)、dna合成抑制剂，dna-rna转录调节剂、酶抑制剂、基因调节剂、激素反应调节剂、缺氧选择性细胞毒素(例如，替拉扎明)、表皮生长因子抑制剂、抗血管剂(例如，呫吨酮5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸)、辐射激活的前药(例如，硝基芳基甲基季铵(nmq)盐)或生物还原药物或其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，有效载荷(即，部分c)不衍生自蒽环类，优选地不衍生自pnu 159682。
[0155]
化疗剂可以选自由以下组成的组：厄洛替尼硼替佐米氟维司群索坦(su11248)、来曲唑甲磺酸伊马替尼ptk787/zk 222584、奥沙利铂5-fu(5-氟尿嘧啶)、亚叶酸、雷帕霉素(西罗莫司，)、拉帕替尼(gsk572016)、洛那法尼(sch 66336)、索拉非尼(bay43-9006)和吉非替尼ag1478、ag1571(su 5271；sugen)或其两种或更多种的组合。
[0156]
化疗剂可以是烷化剂——例如塞替派、和/或环磷酰胺；烷基磺酸盐——例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和/或哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶——例如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和/或乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和/或甲基蜜胺类(methylamelamines)——例如六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenepbosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和/或三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯(acetogenin)——例如布拉他辛(bullatacin)和/或布拉他辛酮(bulatacinone)；喜树碱；苔藓抑素；callystatin；隐藻素
类(cryptophycins)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类-例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和/或尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲类——例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和/或雷莫司汀(ranimnustine)；dynemicin；二膦酸盐类——例如氯膦酸盐；埃斯波霉素(esperamicin)；新制癌素发色团；aclacinomysins、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-l-正亮氨酸、多柔比星——例如吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和/或脱氧多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类——例如丝裂霉素c、霉酚酸、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类——例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物——例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物——例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物——例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类——例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类——例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂——例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；lonidainine；大环缩肽类，例如美登素(maytansine)和安丝霉素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢菌素类——例如维拉库林a(verracurin a)、杆孢菌素a(roridin a)和/或蛇形菌素(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加息托
星(gacytosine)；阿糖胞苷；环磷酰胺；塞替派；紫衫烷类——例如紫杉醇、abraxane和/或多西他赛(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物——例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；novantrone；替尼泊苷；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；xeloda；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a类——例如视黄酸；卡培他滨；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸、衍生物或它们的两种或更多种的组合。
[0157]
有效载荷可以是微管蛋白干扰物，包括但不限于：紫衫烷类——例如紫杉醇和多西他赛、长春花生物碱、盘皮海绵内酯(discodermolide)、埃坡霉素a和b、脱氧埃坡霉素、隐藻素类、curacin a、考布他汀a-4-磷酸盐、bms 247550、bms 184476、bms 188791；lep、rpr 109881a、epo 906、txd 258、zd 6126、长春氟宁(vinflunine)、lu 103793、多拉司他汀10、e7010、t138067和t900607、秋水仙碱、非那西汀(phenstatin)、查耳酮类、印丹诺辛(indanocine)、t138067、oncocidin、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春氟宁、软海绵素b、异高软海绵素b、er-86526、比洛尼素(pironetin)、海绵抑素1、spiket p、隐藻素1、lu103793(cematodin或西马多丁(cemadotin))、根霉素、sarcodictyin、艾榴塞洛素、laulilamide、vp-16和d-24851以及任何上述的药学上可接受的盐、酸、衍生物或它们的两种或更多种的组合。
[0158]
有效载荷可以是dna嵌入剂，包括但不限于：吖啶、放线菌素、蒽环类、苯并噻吩并吲唑类、匹克酮(pixantrone)、克立那托(crisnatol)、溴他利星(brostallicin)、ci-958、多柔比星(阿霉素)、放线菌素d、柔红霉素(道诺霉素)、博来霉素、伊达比星、米托蒽醌、环磷酰胺、美法仑、丝裂霉素c、比折来新(bizelesin)、依托泊苷、米托蒽醌、sn-38、卡铂、顺铂、放线菌素d、安吖啶、daca、吡唑并吖啶(pyrazoloacridine)、伊立替康和托泊替康以及任何上述的药学上可接受的盐、酸、衍生物或它们的两种或更多种的组合。
[0159]
有效载荷可以是起到调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂——例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，包括但不限于，他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、ly117018、奥那司酮(onapristone)和/或法乐通托瑞米芬以及任何上述的药学上可接受的盐、酸、衍生物或它们的两种或更多种的组合。有效载荷可以是抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，该芳香酶调节肾上腺中雌激素产生——例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、福美斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、来曲唑和和/或阿那曲唑以及上述药学上可接受的盐、酸、衍生物或任何两种或更多种的组合。
[0160]
有效载荷可以是抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林和/或曲沙他滨(troxacitabine)以及任何上述的药学上可接受的盐、酸、衍生物或它们的两种或更多种的组合。
[0161]
有效载荷可以是蛋白质或抗体。优选地，有效载荷是细胞因子(例如，白介素，例如il2、il10、il12、il15；tnf超家族的成员；或干扰素，例如干扰素γ)。
[0162]
任何有效载荷均可以以未经修饰或经修饰的形式使用。可以使用其中一些未经修
饰而一些经修改的有效载荷的组合。例如，有效载荷可以经化学修饰。一种形式的化学修饰是羰基基团——例如醛的衍生化。
[0163]
在优选的实施方案中，部分c是澳瑞他汀(auristatin，即具有衍生自澳瑞他汀化合物家族成员的结构)或澳瑞他汀衍生物。更优选地，部分c具有根据下式的结构：
[0164][0165]
其中：
[0166]r1d
独立地为h或c
1-c6烷基；优选为h或ch3；
[0167]r2d
独立地为c
1-c6烷基；优选为ch3或ipr；
[0168]r3d
独立地为h或c
1-c6烷基；优选为h或ch3；
[0169]r4d
独立地为h、c
1-c6烷基、coo(c
1-c6烷基)、con(h或c
1-c6烷基)、c
3-c
10
芳基或c
3-c
10
杂芳基；优选为h、ch3、cooh、cooch3或噻唑基；
[0170]r5d
独立地为h、oh、c
1-c6烷基；优选为h或oh；以及
[0171]r6d
独立地为c
3-c
10
芳基或c
3-c
10
杂芳基；优选为任选取代的苯基或吡啶基。
[0172]
更优选地，部分c衍生自mmae或mmaf。
[0173]
在优选的实施方案中，部分c具有根据下式的结构：
[0174][0175]
其中：
[0176]
n为0、1、2、3、4或5；优选为1；
[0177]r1e
独立地为h、cooh、芳基-cooh或杂芳基-cooh；优选为cooh；
[0178]r2e
独立地为h、cooh、芳基-cooh或杂芳基-cooh；优选为cooh；
[0179]
每个r
3e
独立地为h、cooh、芳基-cooh或杂芳基-cooh；优选为cooh；
[0180]r4e
独立地为h、cooh、芳基-cooh或杂芳基-cooh；优选为cooh；以及
[0181]
x为o、nh或s；优选为o。
[0182]
在优选的实施方案中，部分c具有根据下式的结构：
[0183][0184]
其中：
[0185]
n为0、1、2、3、4或5；优选为1
[0186]r1f
独立地为h、cooh、芳基-cooh或杂芳基-cooh；优选为cooh；
[0187]r2f
独立地为h、cooh、芳基-cooh或杂芳基-cooh；优选为cooh；
[0188]r3f
独立地为h、cooh、芳基-cooh或杂芳基-cooh；优选为cooh；以及
[0189]
x为o、nh或s；优选为o
[0190]
部分c以及根据本发明的化合物的特别优选的实施方案在所附权利要求中示出。
[0191]
优选的化合物是具有根据表2或3的结构的那些，它们的单独的非对映异构体、水合物、溶剂化物、晶型、单独的互变异构体或它们的药学上可接受的盐。
[0192]
其他方面
[0193]
一方面，本文公开了如上定义的通式i的化合物、其单独的非对映异构体、其水合物、其溶剂合物、其晶型、其单独的互变异构体或其药学上可接受的盐，其中：a是具有如上定义的结构的结合部分；b是共价键或包含共价附接部分a和c的原子链的部分；并且c是有效载荷部分。
[0194]
在另一方面，b由如上定义的任何通式ii-v表示，其中每个bs独立地表示间隔基团；每个b
l
独立地表示可切割的或不可切割的接头基团；每个x为独立地选自以下范围的整数：0至100，优选为0至50，更优选为0至30，又更优选地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；每个y为独立地选自0至30范围内的整数，优选地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，16、17、18、19和20；每个z为独立地选自0至5范围的整数，优选地选自0、1、2、3和4；并且*表示与部分a的附接点；以及
·
表示与部分c的附接点。
[0195]
在根据前述方面中任一项的另一方面中，结合部分具有如上定义的结构a1。
[0196]
在根据前述方面中任一项的另一方面中，bs和/或b
l
是包含独立地选自由以下组成的组的结构单元或由其组成的基团：亚烷基、环亚烷基、芳基亚烷基、杂芳基亚烷基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、芳基亚烯基、杂芳基亚烯基、杂亚烯基、杂环亚烯基、亚炔基、杂亚炔基、亚芳基、杂亚芳基、氨基酰基、氧化烯、氨基亚烷基、二酸酯、二烷基硅氧烷、酰胺、硫代酰胺、硫醚、硫酯、酯、氨基甲酸酯、腙、噻唑烷、亚甲基烷氧基氨基甲酸酯、二硫化物、亚乙烯基、亚胺、亚胺酰胺、磷酰胺、糖类、磷酸酯、磷酰胺、氨基甲酸酯、二肽、三肽、四肽，其各自被取代或未被取代。
[0197]
在根据任何前述方面的另一方面中，bs和/或b
l
是如所附权利要求5(b)中定义的基团。在根据任何前述方面的一个优选方面中，一个或多个b
l
如所附权利要求5(c)中所定义。在根据任何前述方面的一个优选方面中，b
l
和bs中的一个或多个如所附权利要求5(d)中所定义。在根据前述任何方面的一个优选方面中，y为1、2或3；和/或至少一个如所附权利要求5(e)中定义的b
l
。在根据前述任何方面的一个优选方面中，b如所附权利要求6中所定义。
[0198]
在根据任何前述方面的另一方面中，化合物如所附权利要求7中所定义。
[0199]
在根据任何前述方面的另一方面中，部分c如所附权利要求8和/或9中所定义。
[0200]
在根据任何前述方面的另一方面中，化合物具有选自以下的结构：缀合物1；缀合物2；缀合物3；缀合物4；缀合物5；缀合物6；缀合物7；缀合物8；缀合物9；缀合物10；缀合物11；缀合物12；缀合物13；缀合物14；缀合物15；和esv6-fluo。
[0201]
还公开了一种药物组合物，其包含根据任何前述方面的化合物和药学上可接受的赋形剂。此类药物组合物还公开用于：(a)通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法，或对人体或动物体实施的诊断方法；或(b)治疗或预防患有或具有患疾病或病症风险的受试者
的方法；或(c)对患有或具有患疾病或病症风险的受试者实施的引导手术的方法；或(d)诊断疾病或病症的方法，该方法对人体或动物身实施并且涉及核医学成像技术，例如正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)；或(e)将治疗剂或诊断剂靶向递送至患有或具有患疾病或病症风险的受试者的方法，其中在前述(b)-(e)中的每一项中，所述疾病或病症独立地选自癌症、炎症、动脉粥样硬化、纤维化、组织重塑和瘢痕疙瘩病症，优选地其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、耐多药结肠癌、直肠癌、结直肠癌、转移性结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞、膀胱癌、胆管癌、肾透明细胞癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、cup(原发灶不明癌)、胸腺癌、硬纤维瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、肾癌和前列腺癌；优选地，其中该化合物在治疗或诊断相关水平上在疾病部位具有延长的停留时间，优选地注射后超过1h，更优选地超过6h。
[0202]
治疗
[0203]
本文所述的化合物可用于治疗疾病。治疗可以是治疗性和/或预防性治疗，目的是预防、减少或停止非期望的生理变化或病症。与未接受治疗的预期生存期相比，治疗可以延长生存期。
[0204]
由该化合物治疗的疾病可以是任何可能从治疗获益的疾病。这包括慢性和急性病症或疾病，包括易患该病症的那些病理状况。
[0205]
术语“癌症”和“癌性”以其最广泛的意义使用，意指哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。肿瘤包含一种或多种癌细胞。
[0206]
在治疗癌症时，观察到的治疗效果可以是癌细胞数量减少；肿瘤大小减小；抑制或延缓癌细胞浸润到外周器官；抑制肿瘤生长；和/或缓解与癌症相关的一种或多种症状。
[0207]
在动物模型中，可以通过治疗期间对肿瘤的物理测量和/或通过确定癌症的部分和完全缓解来评估疗效。对于癌症疗法，疗效可以例如通过评估疾病进展时间(ttp)和/或确定缓解率(rr)来测量。
[0208]
与本发明相关的治疗方法的特别优选的实施方案在所附权利要求中示出。
[0209]
本文还公开了例如通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法，或对人体或动物体实施的诊断方法，该方法涉及向有需要的受试者施用治疗或诊断有效量的本文所述的化合物或药物组合物的步骤。更具体地，本文公开了用于治疗(例如，通过治疗或预防)患有或具有患疾病或病症风险的受试者的方法；或通过对患有或具有患疾病或病症风险的受试者实施的引导手术；用于诊断疾病或病症的方法，例如，对人体或动物体实施和/或涉及核医学成像技术(例如正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect))的诊断方法；用于将治疗剂或诊断剂靶向递送至患有或具有患疾病或病症风险的受试者的方法。在前述方法中，所述疾病或病症可以独立地选自癌症、炎症、动脉粥样硬化、纤维化、组织重塑和瘢痕疙瘩病症，优选地其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、耐多药结肠癌、直肠癌、结直肠癌、转移性结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞、膀胱癌、胆管癌、肾透明细胞癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、cup(原发灶不明癌)、胸腺癌、硬纤维瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、肾癌和前列腺癌。当用于本文公开的方法中时，该化合物在治疗或诊断相关水平上在疾病部位具有延长的停留时间，优选地注射后超过1h，更优选
地超过6h。
[0210]
药物组合物
[0211]
本文所述的化合物可以是药物组合物的形式，该药物组合物可以在人和兽医学中用于人或动物，并且通常包含任何一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是熟知的，并且例如在雷明顿制药科学，mack出版公司(a.r.gennaro编辑1985)中描述。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践进行选择。药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除此之外任何合适的结合物、润滑剂、混悬剂、包衣剂、增溶剂。
[0212]
药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。还可以使用抗氧化剂和混悬剂。
[0213]
根据不同的递送系统，可能有不同的组合物/制剂要求。例如，药物组合物可以配制成使用微型泵或通过粘膜途径施用，例如，作为用于吸入或可摄取溶液的鼻喷雾剂或气雾剂，或肠胃外，其中将组合物配制成可注射形式，用于递送，例如，通过静脉内、肌内或皮下途径。可选地，该制剂可以设计成通过多种途径施用。
[0214]
如果试剂将通过胃肠道粘膜施用，它应该能够在通过胃肠道的过程中保持稳定；例如，它应该能抵抗蛋白水解降解，在酸性ph下稳定，并且能抵抗胆汁的去污作用。
[0215]
适当时，药物组合物可以通过以下方式施用：吸入，以栓剂或阴道栓剂的形式，以洗剂、溶液、乳膏、软膏或撒粉剂的形式外用，通过使用皮肤贴剂，以含有赋形剂(例如淀粉或乳糖)的片剂形式口服，或以单独或与赋形剂混合的胶囊或珠剂(ovule)形式，或以酏剂、含有调味剂或着色剂的溶液或悬浮液的形式，或药物组合物可以肠胃外注射，例如静脉内、肌内或皮下注射。对于肠胃外施用，组合物最好以无菌水溶液的形式使用，其中可以含有其他物质，例如，足够的盐或单糖使溶液与血液等渗。对于口腔或舌下施用，组合物可以以片剂或锭剂的形式施用，其可以以常规方式配制。
[0216]
本发明的化合物可以以药学上可接受的盐或活性盐的形式施用。药学上可接受的盐是本领域技术人员熟知的，例如，包括berge等人，药物科学杂志(j.pharm.sci.),66,1-19(1977)提及的那些。盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐。
[0217]
施用(递送)途径可以包括但不限于以下的一种或多种：口服(例如作为片剂、胶囊或作为可摄入溶液)、外用、粘膜(例如作为用于吸入的鼻喷雾剂或气雾剂)、鼻腔、肠胃外(例如通过注射形式)、胃肠道、脊柱内、腹腔、肌内、静脉内、宫内、眼内、皮内、颅内、气管内、阴道内、脑室内、脑内、皮下、眼科(包括玻璃体内或前房内)、经皮、直肠、口腔、阴道、硬膜外、舌下。
[0218]
通常，医生将确定最适合个体受试者的实际剂量。任何特定患者的具体剂量水平和施用频率可以变化，并且取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物
组合、特定病症的严重程度以及接受治疗的个体。
[0219]
制剂可以包装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需要加入无菌液体载体，例如水，用于施用。即用注射溶液和混悬剂由前述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。示例性单位剂量制剂包含活性成分的每日剂量或每日单位次剂量或其适当部分。
[0220]
前体化合物
[0221]
在本发明的一方面，本文公开了一种化合物、其单独的非对映异构体、其水合物、其溶剂化物、其晶型、其单独的互变异构体或其盐，其中该化合物(前体化合物)包含能够与缀合配偶体反应并形成共价键的部分a和反应性部分l。在缀合(即，反应并形成共价键)时，前述前体化合物与前述缀合配偶体结合，这反过来又成为有效载荷部分c。缀合配偶体可以是原子、分子、颗粒、治疗剂和/或诊断剂。优选地，缀合物是治疗剂和/或诊断剂，并且可以对应于上文关于根据本发明的缀合物已经详细描述的有效载荷部分。
[0222]
优选地，前体化合物包含具有以下结构的部分：
[0223][0224]
其中b是共价键或包含共价键合原子的原子链的部分。
[0225]
前体化合物可以由下式vi表示：
[0226][0227]
其中b是共价键或包含将a共价附接至l的原子链的部分。
[0228]
部分a优选地具有结构a1或a2，其中m为0、1、2、3、4或5。
[0229]
部分b优选地具有与上文关于根据本发明的缀合物详细描述的相同的结构。
[0230]
部分l优选地在反应时能够形成酰胺、酯、氨基甲酸酯、腙、噻唑烷，亚甲基烷氧基氨基甲酸酯、二硫化物、亚烷基、环亚烷基、芳基亚烷基、杂芳基亚烷基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、芳基亚烯基、杂芳基亚烯基、杂亚烯基、杂环亚烷基、亚炔基、杂亚炔基、亚芳基、杂亚芳基、氨基酰基、氧化烯、氨基亚烷基、二酸酯、二烷基硅氧烷、酰胺、硫代酰胺、硫醚、硫酯、酯、氨基甲酸酯、腙、噻唑烷、亚甲基烷氧基氨基甲酸酯、二硫化物、亚乙烯基、亚胺、酰亚胺酰胺、磷酰胺、糖类、磷酸酯、磷酰胺、氨基甲酸酯、二肽、三肽或四肽连接基团。如本领域技术人员将理解的，根据上述列表提供能够与缀合配偶体反应以形成连接基团的反应基团存在多种可能性，并且它们均涵盖在本公开中。
[0231]
部分b可以是可切割的或不可切割的、双官能或多官能部分，其可用于连接一个或多个反应性和/或结合物部分以形成本发明的缀合物前体。在一些实施方案中，化合物的结构独立地每个分子包含多于一个部分a，优选地2、3、4、5、6、7、8、9或10个部分a；和/或多于
一个部分l，优选地2、3、4、5、6、7、8、9或10个部分l。优选地，化合物的结构每个分子包含2个部分a和1个部分l；或1个部分a和2个部分l。
[0232]
部分l优选地选自：h、nh2、n3、cooh、sh、hal、
[0233][0234][0235]
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；每个m独立地为0、1、2、3、4或5；每个hal为f、cl、br或i；以及每个r4独立地选自羧基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基，其中前述中的每一个是取代的或未取代的、卤素和氰基。
[0236]
优选的化合物是具有根据表3的结构的那些，它们的单独的非对映异构体、水合物、溶剂化物、晶型、单独的互变异构体或它们的盐。
[0237]
用于制备缀合物的方法
[0238]
在本发明的一方面，本文公开了一种用于制备缀合物的方法，该方法包括将如上所述的前体化合物与缀合配偶体缀合的步骤。优选地，前体化合物通过与其反应形成共价键而与缀合配偶体缀合。优选地，如此获得的缀合物是如本说明书别处所述的缀合物。
[0239]
缀合配偶体可以是原子、分子、颗粒、治疗剂和/或诊断剂。优选地，缀合物是治疗剂和/或诊断剂，并且可以对应于上文关于根据本发明的缀合物已经详细描述的有效载荷部分。
[0240]
优选地，该方法还包括将缀合物配制成药物组合物或诊断组合物。药物或诊断组合物可以在人和兽医学中用于人或动物，并且通常包含任何一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是熟知的，并且例如在雷明顿制药科学，mack出版公司(a.r.gennaro编辑1985)中描述。载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践进行选择。药物或诊断组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除此之外任何合适的结合物、润滑剂、混悬剂、包衣剂、增溶剂。以上“药物组合物”部分中公开的所有制剂详细信息和方面也完全适用于此。
[0241]
一般技术
[0242]
除非另有说明，否则本发明的实施采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，gennaro,a.r.，编辑(1990)雷明顿制药科学，第18版，mack出版公司；
hardman,j.g.、limbird,l.e.和gilman,a.g.，编辑(2001)治疗学的药理学基础(the pharmacological basis of therapeutics)，第10版，mcgraw-hill co.；colowick,s.等人，编辑，酶学方法(methods in enzymology)，学术出版公司；weir,d.m.和blackwell,c.c.，编辑(1986)实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)，第i-iv卷，blackwell科学出版社；maniatis,t.等人，编辑(1989)分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)，第2版，第i-iii卷，冷泉港实验室出版社；ausubel,f.m.等人，编辑(1999)分子生物学简短方案(short protocols in molecular biology)，第4版，john wiley&sons；ream等人，编辑(1998)分子生物学技术：强化实验室课程(molecular biology techniques:an intensive laboratory course)，学术出版社；newton,c.r.和graham,a.，编辑(1997)pcr(生物技术系列导论)(pcr(introduction to biotechniques series))，第2版，springer verlag。
[0243]
化学合成
[0244]
本文所述的化合物可以通过化学合成技术制备。
[0245]
对于本领域技术人员而言，在化合物的合成过程中可能需要保护和去保护敏感官能团是显而易见的。这可以通过常规技术实现，例如，如t w greene和p g m wuts,john wiley和sons公司(1991)的“有机合成中的保护基团”以及p.j.kocienski在“保护基团”，georg thieme verlag(1994)中所述。
[0246]
在某些反应过程中，存在的任何立体中心可能在某些条件下被差向异构化，例如如果在与具有包含碱敏感基团的光学中心的底物的反应中使用碱。如本领域熟知的，通过选择反应顺序、条件、试剂、保护/去保护方案等应该可以避免诸如此类的潜在问题。
[0247]
定义
[0248]
抗体。术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、贴面抗体、抗体片段和小免疫蛋白(sip)(参见国际癌症杂志(int.j.cancer)(2002)102,75-85)。抗体是由免疫系统产生的能够识别和结合特定抗原的蛋白质。靶抗原通常具有多个结合位点，也称为表位，可被多种抗体上的cdr识别。每种特异性结合不同表位的抗体具有不同结构。因此，一种抗原可能具有多于一种的相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的分子，该抗原结合位点免疫特异性地结合目的靶标的抗原或其部分。抗体可以是任何类型——例如igg、ige、igm、igd和iga)——任何类别——例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2——或其亚类。抗体可以来自或可以源自鼠、人、兔或来自其他物种。
[0249]
抗体片段。术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双体；线性抗体；单域抗体，包括dab、骆驼v
hh
抗体和软骨鱼的ignar抗体。抗体及其片段可以被基于可选的非免疫球蛋白支架、肽适体、核酸适体、包含位于非肽骨架上的多肽环的结构化多肽、天然受体或其结构域的结合分子取代。
[0250]
衍生物。衍生物包括化合物的化学修饰。这种修饰的实例包括用卤素基团、烷基基团、酰基基团或氨基基团等取代氢。修饰可以增加或减少一种或多种氢键相互作用、电荷相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用和/或偶极相互作用。
[0251]
类似物。该术语包括此类化合物的任何对映异构体、外消旋体和立体异构体，以及所有药学上可接受的盐和水合物。
[0252]
除非另有说明，否则以下定义适用于与本发明化合物和含有此类化合物的组合物有关的化学术语。
[0253]
烷基是指支链或无支链的饱和烃基。适当地，烷基基团包含1至100，优选3至30个碳原子，更优选5至25个碳原子。优选地，烷基是指甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。
[0254]
烯基是指含有一个或多个碳-碳双键的支链或无支链烃基。适当地，烯基基团包含2至30个碳原子，优选5至约25个碳原子。
[0255]
炔基是指含有一个或多个碳-碳三键的支链或无支链烃基。适当地，炔基基团包含约3至约30个碳原子，例如约5至约25个碳原子。
[0256]
卤素是指氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
[0257]
环烷基是指脂环部分，适当地具有3、4、5、6、7或8个碳原子。该基团可以是桥环或多环系统。更常见的环烷基是单环的。该术语包括对例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基、双环[2.2.2]辛基等基团的提及。
[0258]
芳基是指芳族碳环系统，适当地包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环碳原子。芳基可以是多环系统，具有两个或更多个环，其中至少一个是芳族的。该术语包括对例如苯基、萘基芴基、薁基、茚基、蒽基等基团的提及。
[0259]
本文的前缀(杂)表示该基团的一个或多个碳原子可以被氮、氧、磷、硅或硫所取代。杂烷基基团包括例如烷氧基和烷硫基。本文的杂环烷基或杂芳基基团可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，其中至少一个选自氮、氧、磷、硅和硫。特别地，3元至10元环或环系统，更特别是5元或6元环，其可以是饱和的或不饱和的。例如，选自环氧乙烷基、吖丙啶基、1，2-氧杂硫杂环戊烷基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、噻吩基、噻蒽基、异苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2h-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、异噻唑基、二噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、吗啉基、硫代吗啉基，尤其是硫代吗啉基、吲哚嗪基、1,3-二氧-1,3-二氢-异吲哚基、3h-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆基、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4h-喹啉基、异喹啉基、喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、肉桂基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、哌啶基、菲咯啉基、呋喃基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、色烯基、异色满基、色满基、3,4-二氢-2h-异喹啉-1-酮、3,4-二氢-2h-异喹啉基等。
[0260]“取代的”表示所述部分中的一个或多个，尤其是至多5个，更尤其是1、2或3个氢原子被相应数量的取代基相互独立地取代。如本文所用，术语“任选取代的”包括取代的或未取代的。当然，应当理解，取代基仅位于它们在化学上可能的位置，本领域技术人员能够在无需不适当努力的情况下决定(实验上或理论上)特定取代是否可能。例如，如果与具有不饱和(例如烯)键的碳原子结合，则具有游离氢的氨基或羟基可能不稳定。优选地，术语“取代的”表示所述部分中的一个或多个，尤其是至多5个，更尤其是1、2或3个氢原子彼此独立地被相应数量的取代基取代，该取代基选自oh、sh、nh2、卤素、氰基、羧基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基。此外，本文所述的取代基本身可以被任何取代基取代，但受上述对本领域技术
人员认可的适当取代的限制。优选地，任何上述取代基可以进一步被任何上述取代基取代，每个取代基可以进一步被任何上述取代基取代。
[0261]
取代基可以适当地包括卤素原子和卤代甲基基团，例如cf3和ccl3；含氧基团，例如氧代、羟基、羧基、羧烷基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、芳氧基、芳酰和芳酰氧基；含氮基团，例如氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氰基、叠氮化物和硝基；含硫基团，例如硫醇、烷硫醇、磺酰基和亚砜；本身可以被取代的杂环基团基团；本身可以被取代的烷基；以及本身可以被取代的芳基基团，例如苯基和取代的苯基。烷基包括取代和未取代的苄基。
[0262]
当两个或更多个部分被描述为“各自独立地”选自原子或基团的列表时，这表示这些部分可以相同或不同。因此每个部分的身份独立于一个或多个其他部分的身份。
[0263]
为了便于参考，本文公开的一些化合物的数量和结构总结在下表2、3和4中。如有疑问，请对照以下数字和结构。
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272]
[0273]
[0274]
[0275]
[0276]
[0277]
[0278]
[0279]
[0280]
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291]
[0292]
[0293]
[0294]
[0295]
[0296]
[0297]
[0298]
[0299]
[0300]
[0301]
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313]
[0314]
[0315]
[0316]
[0317]
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
[0323]
[0324]
[0325]
[0326][0327]
材料与方法
[0328]
一般说明和程序
[0329]
产率是指色谱纯化的化合物。
[0330]
质子(1h)核磁共振(nmr)谱在bruker av400(400mhz)光谱仪上记录。使用残留溶剂作为内标，以ppm给出偏移。耦合常数(j)以hz为单位报告，以下缩写用于表示分裂：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰。
[0331]
质谱(lc-esi-ms)在agilent 6100系列单四极杆ms系统和agilent 1200系列lc系统上记录，使用infinitylab poroshell 120ec-c18柱，4.6mm
×
56mm，流速为2ml min-1
，线性梯度的溶剂a和b(a＝含0.1％甲酸[fa]的millipore水，b＝含0.1％甲酸[fa]的mecn)。
[0332]
高分辨率质谱(hrms)和分析型反相超高效液相色谱(uplc)在与配备pda uv检测器的waters acquity uplc h-class系统耦合的waters xevo g2-xs qtof上记录，使用acquity uplc beh c18柱，1.7μm，2.1mm
×
50mm，流速为0.6ml min-1
，线性梯度的溶剂a和b(a＝含0.1％fa的millipore水，b＝含0.1％fa的mecn)。
[0333]
制备型反相高效液相色谱(rp-hplc)在agilent 1200系列系统上进行，使用phenomenex5μm nx-c18半制备色谱柱，150mm
×
10mm，流速为5ml min-1
，线性梯度的溶剂a和b(a＝含0.1％三氟乙酸[tfa]的millipore水，b＝含0.1％三氟乙酸[tfa]的mecn)。
[0334]
比较例1：(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-6-(3-(4-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-5-羰基)哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺(“haberkorn-fluo”，23)的合成
[0335]
步骤1：6-羟基-4-喹啉羧酸(h1)
[0336]
将6-甲氧基喹啉-羧酸(250mg,1.08mmol,1.0eq)在hbr 48wt.％的h2o(5ml)中的溶液在130℃下加热2h，然后在真空下浓缩以获得橙色粉末状产物(292mg，1.08mmol，定量产率)。ms(es

)m/z 271(m h)

。
[0337]
步骤2：1-boc-4-(3-羟丙基)哌嗪(h2)
[0338]
将无水k2co3(815mg，5.91mmol，1.1eq)加入1-boc-哌嗪(1.0g,5.37mmol,1.0eq)在无水thf(15ml)中的溶液中，然后加入3-溴代-1-丙醇(530μl，5.91mmol，1.1eq)并将反应混合物在室温下搅拌72h。减压除去挥发物，用水稀释残留物，用etoac萃取(两次)，并且合并的有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过快速色谱(dcm/meoh，98:2至90:10)纯化，得到标题化合物，为无色油状物(1.2g，4.91mmol，91％产率)。ms(es

)m/z 245(m h)

。
[0339]
步骤3：3-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)丙基6-(3-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-羧酸酯(h3)
[0340]
将搅拌的h1(100mg,0.37mmol,1.0eq)、h2(180mg,0.74mmol,2.0eq)和三苯膦(193mg,0.74mmol,2.0eq)在无水thf(25ml)中的溶液用偶氮二甲酸二异丙酯(diad；145μl,0.74mmol,2.0eq)处理。反应在室温下搅拌1h，然后真空浓缩并通过快速色谱(dcm/meoh，95:5至90:10)直接纯化，得到标题化合物，为白色粉末(100mg,0.156mmol,42％产率)。ms(es

)m/z 642(m h)

。
[0341][0342]
方案1.制备对比例1化合物“haberkorn-fluo”(23)的合成路线
[0343]
步骤4：6-(3-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-羧酸(h4)
[0344]
向搅拌的h3(100mg,0.156mmol,1.0eq)在thf(5ml)中的溶液加入lioh(13mg,0.312mmol,2.0eq)在h2o(2ml)中的溶液并在室温下搅拌反应2h。将混合物用水稀释，用etoac萃取，用nh4cl s.s.洗涤，经na2so4干燥并过滤，得到白色粉末状产物(60mg，0.144mmol，92％产率)。ms(es

)m/z 416(m h)

。
[0345]
步骤5：1-哌嗪羧酸,4-[3-[[4-[[[2-[(2s)-2-氰基-4,4-二氟-1-吡咯烷基]-2-氧代乙基]氨基]羰基]-6-喹啉基]氧基]丙基]-,1,1-二甲基乙基酯(h5)
[0346]
向搅拌的h4(15mg,0.036mmol,1.0eq)、hatu(20mg,0.054mmol,1.5eq)和hobt(7.3mg,0.054mmol,1.5eq)在dcm(3ml)中的溶液加入(s)-1-(2-氨基乙酰基)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈(10mg,0.054mmol,1.5eq)在dmf(1.0ml)和dipea(25μl,0.144mmol,4eq)中的溶液并在室温下搅拌反应9h。将混合物真空蒸发，溶解于dmso中并通过rp-hplc纯化，得到白色固体产物(6.0mg，0.01mmol，28％产率)。ms(es

)m/z 587(m h)

。
[0347]
步骤6：(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺(h6)
[0348]
将搅拌的h5(5.0mg,8.0μmol,1.0eq)和4-甲基苯磺酸一水合物(6.8mg,40μmol,
5.0eq)在mecn(3ml)中的溶液在55℃下加热2h。将混合物在真空下浓缩，并将产物原样用于后续步骤。白色粉末(8.0mg，8.0μmol，定量产率)。ms(es

)m/z 487(m h)

。
[0349]
步骤7：(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-6-(3-(4-(3',6'-二羟基-)3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-5-羰基)哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺(“haberkorn-fluo”，23)
[0350]
向搅拌的h6(4.5mg,4.0μmol,1.0eq.)和tea(1.1μl,8.0μmol,2.0eq)在dmf(1ml)中的溶液加入nhs-荧光素(2.8mg,6.0μmol,1.5eq)并在室温下搅拌反应9h。将混合物通过rp-hplc直接纯化，得到橙色粉末产物(0.9mg，1.0μmol，26％产率)。ms(es

)m/z 845(m h)

(比较例1b；见图1b)。
[0351]
实施例2：(s)-n1-(4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)-n4-(2-(2-(2-(3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-5-基)硫脲基)乙氧基)乙氧基)乙基)琥珀酰亚胺(“esv6-fluo”,26)的合成
[0352]
步骤1：5,8-二氧杂-2,11-二氮杂十二烷酸,12-[(3',6'-二羟基-3-氧螺[异苯并呋喃-1(3h),9'-[9h]呫吨]-6-基)氨基]-12-硫代-,1,1-二甲基乙基酯(p1)
[0353]
向搅拌的n-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(173μl,0.731mmol,1.5eq)在thf(20ml)中的溶液加入5-异硫氰酸荧光素(190mg，0.487mmol，1.0eq)并将反应在室温下搅拌12h。将混合物真空浓缩并且粗产物通过快速色谱(dcm/etoac 9:1至8:2)直接纯化，得到橙色粉末状化合物(200mg，0.314mmol，64％产率)。ms(es

)m/z 638(m h)

。
[0354]
步骤2：硫脲,n-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]-n'-(3',6'-二羟基-3-氧螺[异苯并呋喃-1(3h),9'-[9h]呫吨]-5-基)-(p2)
[0355]
向冷却至0℃的搅拌的p1(150mg，0.235mmol，1.0eq)在dcm(10ml)中的溶液加入在et2o(5ml)中的hcl 4m。将反应缓慢搅拌温热至室温2h，然后在真空下浓缩并与et2o共蒸发数次直至获得橙色粉末(135mg，0.235mmol，定量产率)。ms(es

)m/z 538(m h)

。
[0356][0357]
方案2.esv6 fluo(26)的制备合成路线
[0358]
步骤3：(s)-8-氨基-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)喹啉-4-甲酰胺(p3)
[0359]
将市售的8-氨基-喹啉-4-羧酸(19.0mg,100μmol,1.0eq)、dipea(70.0μl,400μmol,4.0eq)和hatu(38.0mg,100μmol,1.0eq)溶解于1:1dcm/dmf混合物(2ml)中。15min后，加入(s)-1-(2-氨基乙酰基)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈三氟乙酸酯(30.3mg，100μmol，1.0eq)在dcm中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1h，用水洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩，得到棕色粗产物，为粘性油状物。将残留物通过快速色谱(dcm/meoh 91:1至90:10)纯化，得到纯产物，为褐色油状物(24.8mg，68.9μmol，69％产率)。ms(es

)m/z 360(m h)

。
[0360]
步骤4：(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(p4)
[0361]
将三乙胺(20.8μl，150μmol，2.0eq)和4-二甲氨基吡啶(0.91mg，10.0μmol，0.1eq)加入p3(26.8mg，70.0μmol，1.0eq)在dcm中的冷却溶液(0℃)中，然后滴加琥珀酸酐(15.0mg，150μmol，2.0eq)。使反应混合物温热至室温。将反应混合物置于预热的40℃油浴中直至观察到完全转化。蒸发溶剂并通过rp-hplc纯化残留物，得到纯产物，为白色粉末(9.42mg，20.0μmol，28％产率)。ms(es

)m/z 460(m h)

。图28显示了实施例2，p4的结构、色谱图和lc/ms分析。ms(es )m/z 460.21(m h)

。
[0362]
步骤5：(s)-n1-(4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰
基)喹啉-8-基)-n4-(2-(2-(2-(3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-5-基)硫脲基)乙氧基)乙氧基)乙基)琥珀酰胺(“esv6-fluo”,26)
[0363]
在1:1dcm/dmf混合物(2ml)和dipea(7.20μl,40.0μmol,2.0eq)中得到p2(22.0mg,40.0μmol,2.0eq)和hatu(15.6mg,40.0μmol,2.0eq)。将所得混合物在室温下搅拌15min。加入在dcm中的p4(9.42mg，20.0μmol，1.0eq)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并通过制备型rp-hplc纯化残留物，得到纯产物，为黄色固体(2.50mg，10.0μmol，25％产率)。ms(es

)m/z 979(m h)

(图1a)。
[0364]
下面列出了根据本发明的其他缀合物。
[0365]
缀合物1：(2s,5r,8r,11r)-2-(((1-(6-(((s)-1-(((r)-1-((4-((5r,8s,11r,12s)-11-((r)-仲丁基)-12-(2-((r)-2-((1s,2s)-3-(((1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-6-氧代己基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)甲基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-8-(3-胍基丙基)-4,7,10,13,16-戊氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸
[0366][0367]
缀合物2：(2s,5r,8r,11r)-8-(4-氨基丁基)-2-(((1-(6-(((s)-1-(((r)-1-((4-((5r,8s,11r,12s)-11-((r)-仲丁基)-12-(2-((r)-2-((1s,2s)-3-(((1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-6-氧代己基)甲基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4,7,10,13,16-戊氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸
[0368][0369]
缀合物3：(2s,5r,8r,11r)-2-(((1-(6-(((s)-1-(((r)-1-((4-((5r,8s,11r,12s)-11-((r)-仲丁基)-12-(2-((r)-2-((1s,2s)-3-(((1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-6-氧代己基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)甲基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-8-(3-胍基丙基)-4,7,10,13,16-戊氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸
[0370][0371]
缀合物4：n
6-(4-((3-((3-(((2r)-1-(((14r,16r,33r,2s,4s,10e,12z,14s)-8
6-氯-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪酮-3(2,3)-环氧乙烷-8(1,3)-苯环十四烷-10,12-二烯-4-基)氧基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基)-3-氧代丙基)硫代)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基)环己烷-1-羰基)-n
2-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰基)-d-天冬氨酰-d-精氨酰-d-天冬氨酰-d-赖氨酸
[0372][0373]
缀合物5：(2r,5r,8r,11r)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-2-((1-(14-((4-(4,7-二甲基-3,8,11-三氧代-11-((2s,4s)-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-4-(((1s,3r,4as,9s,9ar,10as)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1h-吡喃并[4',3':4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氢并四苯-2-基)-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷基)苯基)氨基甲酰基)-15-甲基-3,12-二氧代-7,10-二氧杂-4,13-二氮杂十六烷基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)-8-(3-胍基丙基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸
[0374][0375]
缀合物6：(10r,13r,16r,19r)-1-((3ar,4r,5s,10br)-4-乙酰氧基-3a-乙基-9-((3s,5s,7s,9s)-5-乙基-5-羟基-9-(甲氧羰基)-1,4,5,6,7,8,9,10-八氢-2h-3,7-甲醇[1]氮杂环十一烷基[5,4-b]吲哚-9-基)-5-羟基-8-甲氧基-6-甲基-3a,3a1,4,5,5a,6,11,12-八氢-1h-吲哚嗪[8,1-cd]咔唑-5-基)-10-羧基-13-(羧甲基)-19-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺)-16-(3-胍基丙基)-1,4,12,15,18-五氧代-5-氧杂-8,9-二硫杂-2,3,11,14,17-五氮杂异戊二烯-21-油酸
[0376][0377]
缀合物7：2,2',2
”‑
(10-(2-((2-(3-(((2s,5r,8r,11r)-8-(4-氨基丁基)-2-羧基-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷基)硫代)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸
[0378][0379]
缀合物8：2,2',2
”‑
(10-(1-羧基-4-((2-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸
[0380][0381]
缀合物9：用177-镥标记的2,2',2
”‑
(10-(1-羧基-4-((2-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸
[0382][0383]
缀合物10：用225-锕标记的2,2',2
”‑
(10-(1-羧基-4-((2-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸
[0384][0385]
缀合物11：用64-铜标记的2,2',2
”‑
(10-(1-羧基-4-((2-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸
[0386][0387]
缀合物12：用68-镓标记的(s)-3-((s)-2-氨基-6-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺)己酰胺)-4-(((r)-1-羧基-2-巯基乙基)氨基)-4-氧代丁酸
[0388][0389]
缀合物13：(s)-3-((s)-2-氨基-6-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺)己酰胺)-4-(((r)-1-羧基-2-巯基乙基)氨基)-4-氧代丁酸
[0390][0391]
缀合物14：用99m-锝标记的(s)-3-((s)-2-氨基-6-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺)己酰胺)-4-(((r)-1-羧基-2-巯基乙基)氨基)-4-氧代丁酸
[0392][0393]
缀合物15：(2r,5s,8s,11s)-8-(4-氨基丁基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-2-(((1-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-5-基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)甲基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸
[0394][0395]
实施例3：荧光素标记结合物“esv6-fluo”(26)的表征
[0396]
人fap的表达
[0397]
多组氨酸标记的人成纤维细胞激活蛋白(hfap)的氨基酸序列：
[0398]
lrpsrvhnseentmraltlkdilngtfsyktffpnwisgqeylhqsadnnivlynietgqsytilsnrtmksvnasnyglspdrqfvylesdysklwrysytatyyiydlsngefvrgnelprpiqylcwspvgsklayvyqnniylkqrpgdppfqitfngrenkifngipdwvyeeemlatkyalwwspngkflayaefndtdipviaysyygdeqyprtinipypkagaknpvvrifiidttypayvgpqevpvpamiassdyyfswltwvtdervclqwlkrvqnvsvlsicdfredwqtwdcpktqehieesrtgwaggffvstpvfsydaisyykifsdkdgykhihyikdtvenaiqitsgkweainifrvtqdslfyssnefeeypgrrniyrisigsyppskkcvtchlrkercqyytasfsdyakyyalvcygpgipistlhdg
rtdqeikileenkelenalkniqlpkeeikklevdeitlwykmilppqfdrskkyplliqvyggpcsqsvrsvfavnwisylaskegmvialvdgrgtafqgdkllyavyrklgvyevedqitavrkfiemgfidekriaiwgwsyggyvsslalasgtglfkcgiavapvssweyyasvyterfmglptkddnlehyknstvmaraeyfrnvdyllihgtaddnvhfqnsaqiakalvnaqvdfqamwysdqnhglsglstnhlythmthflkqcfslsdhhhhhh
[0399]
将人成纤维细胞激活蛋白(hfap；uniprotkb-q12884(sepr_human)aminoacids 25-760)克隆到pcdna3.1( )中，其5'-末端具有分泌序列，3'-末端具有6x多组氨酸标签，并且通过瞬时基因表达在cho细胞中表达。转染混合物组合如下：0.625μg质粒dna，2.5μg聚乙烯亚胺(pei)，用于106个细胞，细胞密度为4
×
106个细胞/ml。细胞在37℃、5％co2、120rpm下温育6天。通过离心(4500rpm 30min，4℃)收获细胞，并将1ml(干体积)完全his-标签纯化树脂加入过滤的上清液中，并在室温下以120rpm的速度温育2小时。树脂用800ml洗涤缓冲液(咪唑10mm，pbs/nacl 250mm)洗涤，并且hfap用250mm咪唑pbs/nacl 250mm洗脱。在分光光度计上检查洗脱级分(1.5ml)在280nm处的吸光度。合并富含hfap的级分并对hepes缓冲液(50mm hepes，100mm nacl，ph＝7.4)进行透析。
[0400]
重组hfap样品通过sds-page和尺寸排阻色谱法进行分析(见图2：a)sds-page；b)尺寸排阻色谱法(superdex 200increase 10/300gl))，并且酶活性在抑制试验中得到证实(见“体外人fap酶ic
50
测定”部分)。
[0401]
通过荧光偏振测量对人fap的亲和力(图4)
[0402]
荧光偏振测量在384孔板(非结合，ps，f底，黑色，高体积，30μl终体积)中进行。用缓冲液(50mm tris，100mm nacl，1mm edta，ph＝7.4)连续稀释人fap(4μm)储备溶液，而结合物的终浓度保持在10nm。在黑暗中通过荧光偏振在37℃下温育30min后进行测量(图4)。与先前描述的配体haberkorn-fluo(kd为0.89nm)相比，esv6-fluo对hfap的亲和力更高(kd为0.78nm)。
[0403]
体外人fap酶ic50测定(图5)
[0404]
在室温下在微量滴定读板器上测量人fap对z-gly-pro-amc底物的酶活性，在360nm的激发波长和465nm的发射波长下监测荧光。反应混合物在30μl的总体积中含有20μm底物、20nm人fap、测定缓冲液(50mm tris，100mm nacl，1mm edta，ph＝7.4)和抑制剂(范围为10-6
和10-11
m)。ic
50
值被定义为在加入底物之前，在37℃下与酶预温育30min后，酶活性降低50％所需的抑制剂浓度。
[0405]
在dmso中制备抑制剂储备溶液(200mm)。在实验开始之前，将储备液在分析缓冲液中进一步稀释至10-6
m，从中制备1:2连续稀释液。所有测量重复三次。
[0406]
图5显示了在小有机配体存在下hfap抑制实验的结果。与先前描述的配体haberkorn配体(24.6nm)相比，esv6配体的ic50(20.2nm)较低。
[0407]
配体-蛋白质复合物的色谱共洗脱实验(图3)
[0408]
在上样复合物之前，用分析缓冲液(50mm tris，100mm nacl，1mm edta，ph＝7.4)预平衡pd-10柱。人fap(2μm)和荧光素标记的结合物(6μm)在黑暗中在37℃下温育30min。上样混合物并使用测定缓冲液冲洗柱。将流出物收集在96孔板中，并立即在tecan微量滴定读板器上测量荧光，在485nm的激发波长和535nm的发射波长下监测荧光。通过使用nanodrop 2000/2000c分光光度计测量280nm处的吸光度来估计蛋白量。
[0409]
图3显示了小分子配体esv6-fluo和haberkorn-fluo与hfap的共洗脱pd-10实验的
结果。hfap与小配体esv6-fluo和haberkorn-fluo之间形成稳定的复合物。
[0410]
解离速率测量(图6)
[0411]
确定k
off
值的荧光偏振测量在384孔板(非结合，ps，f底，黑色，高体积，30μl终体积)中进行。测量在2.0nm荧光素标记的结合物与人fap以1.0μm恒定浓度在黑暗中在37℃下预温育后进行。通过加入大量过量的相应的无荧光素结合物(分别在实施例2的步骤3中获得的化合物p3和在比较例1的步骤6中获得的化合物h6，各自终浓度为20μm)，诱导荧光素标记化合物的解离。
[0412]
图6显示了来自hfap的esv6-fluo和haberkorn-fluo的解离速率测量结果。与haberkorn-fluo(回归系数＝
–
0.075112)相比，esv6-fluo解离的速度较慢(回归系数＝
–
0.093564)。
[0413]
本技术中的比较例1的化合物(“haberkorn-fluo”)可以被认为是现有技术公开的代表，特别是现有技术(wo 2019/154886和wo 2019/154859)中描述的配体fapi-04的结构。上述结果表明，根据本发明的化合物不仅与hfap形成稳定的复合物，而且出乎意料地显示出与现有技术相比显著增加的亲和力(较低kd)、增加的抑制活性(较低ic
50
)和较慢解离速率。
[0414]
实施例4：肿瘤模型中的比较实验
[0415]
第1部分
–
缀合物的制备
[0416]
(8-氨基喹啉-4-羰基)甘氨酸叔丁酯的合成
[0417][0418]
方案3.(8-氨基喹啉-4-羰基)甘氨酸叔丁酯的制备合成的合成路线
[0419]
将dipea(185μl,1.063mmol,4eq)滴加至搅拌的甘氨酸叔丁酯盐酸盐(89mg,0.532mmol,2.0eq)、8-氨基喹啉-4-羧酸(50mg,0.266mmol,0.1eq)和hatu(111mg,0.292mmol,1.1eq)在300μl dmf和3ml dcm中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1h。将混合物真空浓缩，并且粗产物直接通过快速色谱(dmc/meoh，100％至9.5∶0.5)纯化，得到(8-氨基喹啉-4羰基)甘氨酸叔丁酯，为棕色油状物(70mg，0.232mmol,87.5％)。ms(es )m/z 302.14(m h)

[0420]
4-((4-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸的合成
[0421]
[0422]
方案4. 4-((4-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸的合成路线
[0423]
将4-二甲氨基吡啶(14mg,0.116mmol,0.5eq)加入搅拌的(8-氨基喹啉-4-羰基)甘氨酸叔丁酯(70mg,0.232mmol,1.0eq)和二氢呋喃-2,5-二酮(232mg,2.324mmol,10.0eq)在thf(3ml)中的溶液中。将反应在50℃加热6h。将混合物真空浓缩，在dcm中稀释并用水洗涤。将有机相在真空下浓缩并通过快速色谱(dmc/meoh 9:1至7:3)纯化以得到棕色油状物的化合物(50mg,0.125mmol,83.3％)。ms(es )m/z 402.16(m h)

[0424]
树脂上cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc的合成
[0425][0426]
scheme 5.树脂上cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc的合成路线
[0427]
市售的在tentagel树脂(500mg,0.415mmol,rapp polymere)上预负载的fmoc-cys(trt)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀，用dmf中的20％哌啶(1
×
1min
×
5ml和2
×
10min
×
5ml)去除fmoc基团并且树脂用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤。肽以指定的顺序用fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-lys(nhboc)-oh和fmoc-asp(tbu)-oh延伸。为此，将fmoc保护的氨基酸(2.0eq)、hbtu(2.0eq)、hobt(2.0eq)和dipea(4.0eq)溶解于dmf(5ml)中。使混合物在0℃下静置10min，然后在温和搅拌下与树脂反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，用dmf中的20％哌啶(1
×
1min
×
5min和2
×
10min
×
5ml)去除fmoc基团。去保护步骤之后进行用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤步骤，然后与下一个氨基酸偶联。
[0428]
(2r,5s,8s,11r)-8-(4-氨基丁基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((羧甲基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-2-(巯基甲基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸的合成
[0429][0430]
方案6.(2r,5s,8s,11r)-8-(4-氨基丁基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((羧甲基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-2-(巯基甲基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸(sh-cys-asp-lys-asp-qcooh)的制备合成路线
[0431]
将树脂上cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc(50mg,0.025mmol)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀。肽用4-((4-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(20mg,0.05mmol,2.0eq)、hatu(19mg,0.05mmol,2.0eq)和dipea(17μl,0.1mmol,4.0eq)延伸并在温和搅拌下反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，通过将树脂与tfa(15％)、tis(2.5％)和h2o(2.5％)在dcm中的混合物在室温下搅拌4h来切割化合物。树脂用甲醇(2
×
5ml)洗涤，合并的切割和洗涤溶液在真空下浓缩。粗产物经反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(2.4mg，0.003mmol，12％)。ms(es )m/z 807.45(m h)

[0432]
(2r,5s,8s,11s)-8-(4-氨基丁基)-5,11-双(羧甲基)-16-(4-(3-((4-((2-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-(巯基甲基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸的合成
[0433][0434]
方案7.(2r,5s,8s,11s)-8-(4-氨基丁基)-5,11-双(羧甲基)-16-(4-(3-((4-((2-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-(巯基甲基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸(sh-cys-asp-lys-asp-hk)的制备合成路线
[0435]
将树脂上cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc(60mg,0.03mmol)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀。肽用(s)-4-(4-(3-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸(17.5mg,0.03mmol,1.0eq)、hatu(22mg,0.06mmol,2.0eq)和dipea(200μl,1.2mmol,40eq)延伸并在温和搅拌下反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，通过将树脂与tfa(15％)、tis(2.5％)和h2o(2.5％)在dcm中的混合物在室温下搅拌4h来切割化合物度。树脂用甲醇(2
×
5ml)洗涤，合并的切割和洗涤溶液在真空下浓缩。粗产物经反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(1mg,0.95μmol,0.3％)。ms(es )m/z 1048.39(m h)

[0436]
(2r,5s,8s,11s)-8-(4-氨基丁基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-2-(巯基甲基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸的合成
[0437]
[0438]
方案8.(2r,5s,8s,11s)-8-(4-氨基丁基)-5,11-双(羧甲基)-16-((4-((2-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-2-(巯基甲基)-4,7,10,13,16-五氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷酸(sh-cys-asp-lys-asp-esv6)的制备合成路线
[0439]
将树脂上cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc(80mg,0.04mmol)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀。肽用(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(37mg,0.08mmol,2eq)、hatu(30mg,0.08mmol,2.0eq)和dipea(28μl,0.16mmol,4.0eq)溶胀并在温和搅拌下反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，通过将树脂与tfa(15％)、tis(2.5％)和h2o(2.5％)在dcm中的混合物在室温下搅拌4h来切割化合物。树脂用甲醇(2
×
5ml)洗涤，合并的切割和洗涤溶液在真空下浓缩。粗产物经反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(1mg,0.95μmol,0.3％)。ms(es )m/z 921.29(m h)

[0440]“qcooh-irdye750”的合成
[0441]
将sh-cys-asp-lys-asp-qcooh(140μg,0.174μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(800μl)中。以无水dmf溶液(200μl)形式加入irdye750马来酰亚胺(200μg,0.174μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到绿色固体(0.06μmol，40％)。ms(es )m/z 978(m 2h)
2
[0442][0443]
缀合物16：“qcooh-irdye750”的结构。
[0444]“haberkorn-irdye750”的合成
[0445]
将sh-cys-asp-lys-asp-hk(181μg,0.174μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(800μl)中。以无水dmf溶液(200μl)形式加入irdye750马来酰亚胺(200μg,0.174μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到绿色固体(0.06μmol，40％)。ms(es )m/z 1099.8(m 2h)
2
[0446][0447]
缀合物17：“haberkorn-irdye750”的结构。
[0448]
esv6-irdye750的合成
[0449]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(160μg,0.174μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(800μl)中。以无水dmf溶液(200μl)形式加入irdye750马来酰亚胺(200μg,0.174μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到绿色固体(0.08μmol，50％)。ms(es )m/z 1036.3(m 2h)
2
[0450][0451]
缀合物18：esv6-irdye750的结构。
[0452]“qcooh-valcit-mmae”的合成
[0453]
将sh-cys-asp-lys-asp-qcooh(612μg,0.760μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-valcit-pab-mmae(1000μg,0.760μmol,1.0eq)。
将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(322μg，20％)。ms(es )m/z 2124.03(m h)

[0454][0455]
缀合物19：“qcooh-valcit-mmae”的结构。
[0456]“haberkorn-valcit-mmae”的合成
[0457]
将sh-cys-asp-lys-asp-hk(795μg,0.760μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以及无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-valcit-pab-mmae(1000μg,0.760μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(322μg，20％)。ms(es )m/z 2364.18(m h)

[0458][0459]
缀合物20：“haberkorn-valcit-mmae”的结构。
[0460]“esv6-valcit-mmae”的合成
[0461]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(700μg,0.760μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-valcit-pab-mmae(1000μg,0.760μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(322μg，20％)。ms(es )m/z 2236.07(m h)

software)用于数据分析(常规双因素anova，然后进行bonferroni检验)。
[0473]
具体地，图8显示了esv6-valcit-mmae和haberkorn-valcit-mmae在sk-mel-187荷瘤小鼠中治疗活性的评估。数据点表示平均肿瘤体积
±
sem(每组n＝3)。(a)箭头表示不同治疗的iv感染。esv6-valcit-mmae是高亲和力fap配体“esv6”的药物缀合物衍生物，与haberkorn-valcit-mmae相比，显示出更有效的抗肿瘤作用。(b)显示了不同治疗的耐受性，通过评估实验期间动物体重的变化(％)来评估。与haberkorn-valcit-mmae相比，esv6-valcit-mmae表现出较低急性毒性。
[0474]
实施例5：用于放射性标记的缀合物的制备
[0475]“haberkorn-dota”的合成
[0476]
将(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺(15mg,0.030mol,1.0eq)、hatu(13mg,0.039mmol,1.1eq)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸三叔丁酯(19mg,0.039mmol,1.1eq)溶解于dcm/mdf(800μl/50μl)中。滴加dipea(18μl,0.101mmol,3eq)并将反应在室温下搅拌1h。粗产物用tfa(40％)处理过夜，通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(4mg，15％)。ms(es )m/z 873.4(m h)

[0477][0478]
缀合物22：“haberkorn-dota”的结构。
[0479]“esv6-dota”合成(8)
[0480]
将(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(15mg,0.032mmol,1.0eq)溶解于无水dmso(400μl)中。加入二环己基碳二亚胺(9mg，0.042mmol，1.3eq)和n-羟基琥珀酰亚胺(4.5mg，0.039mmol，1.3eq)，并且反应在室温下避光搅拌过夜。加入100μl含有2,2’,2
”‑
(10-(4-((2-氨基乙基)氨基)-1-羧基-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(20mg，0.039mmol，1.2eq)的pbs溶液并将反应搅拌2h。粗产物经反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(2.4mg,8％)。ms(es )m/z 960.39(m h)

[0481][0482]
缀合物8：“esv6-dota”的结构。
[0483]
图27显示了esv6-dotaga(8)的结构、色谱图和lc/ms分析。ms(es )m/z 960.39(m h)

。
[0484]
实施例6：实施例6：化合物p4和化合物24之间的比较实验
[0485]
第1部分
–
化合物24的制备
[0486]
7-(苯基氨基)喹啉-4-羧酸的合成
[0487][0488]
方案9. 7-(苯基氨基)喹啉-4-羧酸的合成路线
[0489]
将7-溴喹啉-4-羧酸(30mg,0.119mmol,1.0eq)加入压力瓶中搅拌的苯胺(111mg,1.19mmol,198μl,10.0eq)在甲苯(1ml)和二噁烷(500μl)中的溶液。将溶液脱气5分钟(氩真空循环)，然后加入brettphos钯环(10mg，0.0119mmol，0.1eq)和叔丁醇钾(53mg，0.476mmol，4.0eq)并将反应在110℃下温热4h并通过lc/ms进行检查。将粗产物吸附在二氧化硅上并通过快速色谱(dmc/meoh 9:1至2:8)纯化，得到橙色油状物化合物(31mg，0.119mmol，100％)。ms(es )m/z 265.09(m h)

[0490]
(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-7-(苯基氨基)喹啉-4-甲酰胺(化合物24)的合成
[0491][0492]
方案10.(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-7-(苯基氨基)喹啉-4-甲酰胺(化合物24)的制备合成路线
[0493]
将7-(苯基氨基)喹啉-4-羧酸(31mg,0.119mmol,1.0eq)、(s)-4,4-二氟-1-甘氨酰吡咯烷-2-甲腈(24mg,0.129mmol,1.1eq)和hatu(89mg,0.234mmol,2eq)加入dmf(200μl)和二氯甲烷(1ml)溶液中。滴加dipea(45mg,0.352mmol,61μl,3eq)并将反应在室温下搅拌15分钟。蒸发dcm，并且粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到黄色固体(3.5mg,0.008mmol),6.9％)。ms(es )m/z 436.15(m 1h)
1
[0494]
第2部分
–
体外实验
[0495]
hfap的体外抑制测定
[0496]
在室温下在微量滴定读板器上测量在不同小有机配体(来自实施例2的化合物p4；化合物24)的存在下，人fap对z-gly-pro-amc底物的酶活性，在360nm的激发波长和465nm的发射波长下监测荧光。反应混合物含有20μm底物、20nm人fap(恒定)、测定缓冲液(50mm tris、100mm nacl、1mm edta，ph＝7.4)和抑制剂(10-6
至10-11
m连续稀释，1:2)，总体积为20μl。ic
50
值被定义为加入底物后酶活性降低50％所需的抑制剂浓度)。
[0497]
图9显示了与化合物24(33.46nm，较低抑制)相比，来自实施例2的化合物p4显示出较低ic
50
(16.83nm，较高抑制)。
[0498]
实施例7：缀合物15和25的合成及其表征
[0499]
第1部分
–
缀合物的制备
[0500]
缀合物15的合成
[0501][0502]
方案11.缀合物15的结构
[0503]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(2mg,2.171μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(800μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入荧光素-5-马来酰亚胺(1.8mg,4.343μmol,2.0eq)。将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到黄色固体(420nmol，19.3％)。ms(es )m/z 1348.36(m 1h)
1
[0504]
图25显示了缀合物15的结构、色谱图和lc/ms分析。ms(es )m/z 1348.36(m 1h)

。
[0505]
缀合物25的合成
[0506][0507]
方案12.缀合物25的结构。
[0508]
将sh-cys-asp-lys-asp-hk(1mg,0.954μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(800μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入荧光素-5-马来酰亚胺(817μg,1.909μmol,2.0eq)。将反应搅拌3h。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到黄色固体(373nmol，39.1％)。ms(es )m/z 1476.47(m 1h)
1
[0509]
第2部分
–
体外实验
[0510]
通过荧光偏振(fp)测量人和小鼠fap的亲和力
[0511]
荧光偏振实验在384孔板(非结合，ps，f底，黑色，高体积，30μl终体积)中进行。人fap(4μm)和鼠fap(5μm)储备溶液用缓冲液(50mm tris、100mm nacl、1mm edta，ph＝7.4)连续稀释，而结合物的终浓度保持在10nm。在tecan微量滴定读板器上测量荧光各向异性。实验重复三次，并使用prism 7拟合平均各向异性值。
[0512]
图10a显示了与缀合物25(kd＝1.02nm)相比，缀合物15对hfap具有更高亲和力(kd＝0.68nm)。图10b显示了与缀合物25(kd＝30.94nm)相比，缀合物15对mfap具有更高亲和力(kd＝11.61nm)。与缀合物25相比，缀合物15对hfap具有优异的结合特性，并且对鼠抗原具有更好的交叉反应性。
[0513]
配体-蛋白质复合物的色谱共洗脱实验
[0514]
在上样复合物之前，用分析缓冲液(50mm tris、100mm nacl、1mm edta，ph＝7.4)预平衡pd-10柱。将不同蛋白质(hfap＝2μm,mfap＝5μm)和缀合物15(100nm)的混合物温育并上样至色谱柱上。使用测定缓冲液冲洗混合物。将流出物收集在96孔板中，并立即在tecan微量滴定读板器上测量荧光强度，在485nm的激发波长和535nm的发射波长下监测荧光。通过使用nanodrop 2000/2000c分光光度计测量280nm处的吸光度来估计蛋白质的浓度。
[0515]
图11显示了小分子配体缀合物15与hfap(a)和mfap(b)的共洗脱pd-10实验的结果。在蛋白质和小配体缀合物15之间形成了稳定的复合物，使得两个分子一起共洗脱。
[0516]
第3部分
–
动物实验
[0517]
细胞培养
[0518]
解冻后，将sk-rc-52.hfap和sk-rc-52细胞保持在补充有胎牛血清(10％，fbs)和抗生素-抗真菌剂(1％，aa)的rpmi培养基中在37℃和5％co2下培养。对于传代，细胞在达到90％汇合度时使用胰蛋白酶-edta 0.05％分离，并以1:4的稀释度重新接种。
[0519]
解冻后，将ht-1080.hfap和ht-1080细胞保持在补充有胎牛血清(10％，fbs)和抗生素-抗真菌剂(1％，aa)的dmem培养基中在37℃和5％co2下培养。对于传代，细胞在达到90％汇合度时使用胰蛋白酶-edta 0.05％分离，并以1:4的稀释度重新接种。
[0520]
对sk-rc-52.hfap、sk-rc-52、ht-1080.hfap和ht-1080的共聚焦显微镜分析
[0521]
将sk-rc-52.hfap和sk-rc-52细胞接种到4孔盖玻片室板中，密度为每孔104个细胞，在补充有10％fcs、aa和hepes(10mm)的rpmi培养基(1ml)中，并使其在标准培养条件下生长24小时。hoechst 33342核染料用于染色核结构。
[0522]
用含有缀合物15(100nm)的新鲜培养基替换培养基。在配备aobs装置的sp8共聚焦显微镜(leica microsystems)上随机选择菌落成像。
[0523]
将ht-1080.hfap和ht-1080细胞以每孔104个细胞的密度接种到4孔盖玻片室板中，在补充有10％fcs、aa和hepes(10mm)的dmem培养基(1ml)中，并使其在标准培养条件下生长24小时。hoechst 33342核染料用于染色核结构。
[0524]
用含有缀合物15(100nm)的新鲜培养基替换培养基。在配备aobs装置的sp8共聚焦显微镜(leica microsystems)上随机选择菌落成像。
[0525]
图12显示了通过共聚焦显微镜和facs分析评价缀合物15(10nm)对sk-rc-52.hfap、ht-1080.hfap和野生型肿瘤细胞的选择性蓄积。(a)sk-rc-52.hfap在不同时间点(t＝0和1h)与化合物温育的图像显示缀合物15在细胞膜上的蓄积。(b)sk-rc-52野生型在与化合物温育后的图像显示细胞膜上没有蓄积(阴性对照)。(c)对sk-rc-52野生型(深灰色峰)和sk-rc-52.hfap(浅灰色峰)的facs分析显示缀合物15(10nm)的fap特异性细胞结合。(d)ht-1080.hfap在不同时间点(t＝0和1h)与化合物温育的图像显示缀合物15在细胞膜和胞液内蓄积。(e)ht-1080野生型与化合物温育后的图像显示细胞膜和胞液中没有蓄积(阴性对照)。
[0526]
facs分析
[0527]
使用accutase从培养板分离sk-rc-52.hfap、sk-rc-52.wt、ht-1080.wt和ht-1080.hfap，计数并悬浮至终浓度为1.5
×
106个细胞/ml fcs在pbs ph 7.4中的1％v/v溶液。将3
×
105个细胞(200μl)的等分试样离心并重悬于在pbs ph 7.4(200μl)中的1％v/v fcs溶液中的缀合物15(15nm)溶液中，并在冰上温育1h。用200μl 1％v/v的fcs在pbs ph 7.4(200μl)中的溶液洗涤细胞一次，离心，重悬于1％v/v的fcs在pbs ph 7.4(300μl)中的溶液中并在cytoflex细胞仪(beckman coulter)上分析。原始数据用flowjo 10.4软件处理。
[0528]
结果在图12f中示出：对ht-1080野生型(深灰色峰)和ht-1080.hfap(浅灰色峰)的facs分析显示缀合物15的fap特异性细胞结合(10nm)。
[0529]
动物研究
[0530]
所有动物实验均按照瑞士动物福利法律法规进行，许可证号为zh04/2018，由des kantons z
ü
rich授予。
[0531]
皮下sk-rc-52.hfap肿瘤的植入
[0532]
sk-rc-52.hfap细胞生长至80％汇合度并用0.05％胰蛋白酶-edta分离。将细胞重悬于hbss培养基中，终浓度为5
×
107个细胞/ml。在雌性无胸腺balb/c nu/nu小鼠(6-8周龄)的右侧皮下注射5
×
106个细胞(100μl悬浮液)的等分试样。
[0533]
离体实验
[0534]
皮下sk-rc-52.hfap荷瘤小鼠静脉内注射缀合物15(40nmol，在无菌pbs中，ph 7.4)。静脉内注射1h后co2窒息处死动物，切除器官和肿瘤，在oct培养基中速冻并于-80℃下保存。切割低温恒温器切片(7μm)并用荧光固定介质(dako omnis,agilent)对细胞核进行染色。使用axioskop2 mot plus显微镜(zeiss)获得图像，并通过imagej 1.53软件进行分析。
[0535]
图13显示了在静脉内施用(40nmol)后评价缀合物15在荷有sk-rc-52.hfap肾细胞癌异种移植物的balb/c nu/nu小鼠中的靶向性能的结果。提供施用后1h的离体器官图像。静脉内注射后1小时，化合物在体内快速且均匀地定位于肿瘤部位，具有高肿瘤对器官选择性。
[0536]
实施例8：缀合物9的合成和表征
[0537]
第1部分
–
缀合物的制备
[0538]
缀合物9用177-镥标记的(2,2',2
”‑
(10-(1-羧基-4-((2-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸的合成
[0539][0540]
方案13.缀合物9的结构
[0541]
将缀合物8溶解于乙酸盐缓冲液(1m，ph＝4)中至终浓度为1μg/μl。用250μl乙酸盐缓冲液(1m，ph＝4)稀释缀合物8的储备溶液(25μg，25μl)。加入
177
lucl3溶液(250μl，25mbq)并将混合物在95℃下加热15分钟。通过加入无菌pbs(1975μl,ph＝7.4)稀释标记混合物，并通过放射性hplc(5-10μl，0.5-1mbq，在水中的0.1％tfa作为溶剂a和在乙腈中的0.1％tfa作为溶剂b)监测标记效率。程序：0-8min，20％-65％溶剂b和流速1ml/min)。实现了向缀合物9的定量转化(放射性标记效率》99％，图14)。
[0542]
图14a显示了缀合物9在用
177
lu标记后(r.t.11min)的放射性hplc谱。图14b显示了游离
177
lu(2min)的放射性hplc谱。放射性标记后，缀合物9显示为单峰，转化率》99％。
[0543]
第2部分
–
动物实验
[0544]
sk-rc-52.hfap中的放射性标记和生物分布实验
[0545]
如实施例7所述，将sk-rc-52.hfap肿瘤细胞植入雌性balb/c nu/nu小鼠中，并使其生长三周，平均体积为250mm3。将小鼠随机分组(每组n＝4)并静脉内注射放射性标记的缀合物9(50、125、250、500或1000nmol/kg；0.5-2mbq)。在注射后10分钟、1h、3h和6h，通过co2窒息处死小鼠，提取器官，称重并用packard cobraγ-计数器测量放射性。值表示为％id/g
±
sd(图15)。在此期间自由提供饲料和水。
[0546]
图15显示了缀合物9(其包括
177
lu放射性有效载荷)在荷有sk-rc-52.hfap肾细胞
癌异种移植物的balb/c nu/nu中的生物分布实验结果。(a)在静脉内施用缀合物9(剂量＝50nmol/kg；0.5-2mbq)后不同时间点(10min、1h、3h和6h)的肿瘤和健康器官中的％id/g和肿瘤器官比分析。(b)以不同剂量(125nmol/kg、250nmol/kg、500nmol/kg和1000nmol/kg；0.5-2mbq)静脉内施用
177
lu缀合物9后3h，肿瘤和健康器官中的％id/g和肿瘤器官比分析。可以观察到剂量依赖性效应，并且可以在250nmol/kg和500nmol/kg之间达到目标饱和度。(c)静脉内注射
177
lu溶液(阴性对照；1mbq)后3h肿瘤和健康器官中的％id/g和肿瘤器官比分析。
[0547]
实施例9：化合物27-32的合成
[0548]
69-镓标记的2,2',2
”‑
(10-(1-羧基-4-((2-(4-((4-((2-((r)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸，缀合物27的合成
[0549][0550]
将缀合物8溶解于乙酸盐缓冲液(1m,ph＝4)中，终浓度为1μg/μl。
[0551]
用250μl乙酸盐缓冲液(1m，ph＝4)稀释缀合物8的储备溶液(100μg，100μl)。加入gacl3溶液(183μg，在183μl hcl中)并将混合物在90℃下加热15分钟。通过lc/ms检查反应。ms(es )m/z 1027.30(m h)

[0552]
(6-甲氧基喹啉-4-羰基)甘氨酸甲酯的合成
[0553][0554]
方案14.(6-甲氧基喹啉-4-羰基)甘氨酸甲酯的合成路线
[0555]
将6-甲氧基喹啉-4-羧酸(200mg，0.985mmol，1.0eq)、hbtu(400mg，1.03mmol，1.05eq)、hobt(167mg，1.05mmol，1.15eq)和甘氨酸甲酯盐酸盐(107mg，将1.08mmol，1.1eq)溶解于5ml dmf中并在室温下搅拌。滴加dipea(613μl,4.42mmol,4.5eq)并通过lc/ms检查反应直至完成。粗产物通过色谱(dcm:meoh 100:0至80:20，10min)直接纯化，得到淡黄色固体(40mg，0.145mmol，14.7％)。ms(es )m/z275.1(m 1h)。
[0556]
(6-甲氧基喹啉-4-羰基)甘氨酸盐的合成
[0557][0558]
方案15.(6-甲氧基喹啉-4-羰基)甘氨酸盐的合成路线
[0559]
将(6-甲氧基喹啉-4-羰基)甘氨酸甲酯(30mg，0.109mmol，1.0eq)溶解于1m lioh溶液的2ml thf/h2o(1:1)中并在室温下搅拌6小时。完成后，用1m hcl猝灭碱直至达到微酸性ph值，并将粗产物冻干，得到白色固体(定量产率)。ms(es )m/z 261.08(m 1h)
1
[0560]
(s)-n-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-6-甲氧基喹啉-4-甲酰胺，缀合物28的合成
[0561][0562]
方案16.(s)-n-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-6-甲氧基喹啉-4-甲酰胺的制备合成路线
[0563]
将(6-甲氧基喹啉-4-羰基)甘氨酸盐(28mg,0.109mmol,1.0eq)、(s)-吡咯烷-2-甲腈(16mg,0,120mmol,1.1eq)和hatu(62mg,0.164mmol,1.5eq)溶解于2ml dmf中并在室温下搅拌悬浮液。滴加dipea(47μl,2.62mmol,24eq)，并通过lc/ms检查反应直至完成。粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)直接纯化并冻干，得到黄色固体(2mg,5.91μmol,5.4％)。ms(es )m/z 339.14(m 1h)
1
[0564]
((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
[0565][0566]
方案17.((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氨基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯的制备合成路线
[0567]
将(s)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈(50mg，0,379mmol，1eq)、(叔丁氧羰基-l-丙氨酸(154mg，0.75mmol，2.0eq)和hatu(288mg，0.75mmol,2eq)溶解于4ml dmf中并在室温下搅拌悬浮液。滴加dipea(335μl,1.893mmol,5eq)，并通过lc/ms检查反应直至完成。在真空下除去dmf并将粗产物在dcm中稀释。有机相用水和1m hcl洗涤，然后干燥，得到白色泡沫状物
(115mg，0.379mmol，定量产率)。ms(es )m/z 304.14(m 1h)
1
[0568]
(s)-1-(l-丙氨酰)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈的合成
[0569][0570]
方案18.(s)-1-(l-丙氨酰)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈的制备合成路线
[0571]
将((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(115mg,0,379mmol,1eq)溶解于2ml的dcm中，并滴加tfa(203μl，7eq)，反应在室温下搅拌并通过lc/ms检测直至完成。粗产物在dcm中稀释，并且产物用1m hcl萃取。然后用1m naoh猝灭酸性水相，用dcm萃取产物并干燥，得到淡黄色油状物(30mg，0.147mmol，38.7％)。ms(es )m/z 204.07(m 1h)
1
[0572]
((4-(((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
[0573][0574]
方案19.((4-(((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的制备合成路线
[0575]
将(s)-1-(l-丙氨酰)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈(30mg,0,147mmol,1eq)、2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)异烟酸(74mg,0.295mmol,2.0eq)和hatu(112mg,0.295mmol,2eq)溶解于1ml dmf中并在室温下搅拌悬浮液。滴加dipea(102μl,0.590mmol,4eq)，并通过lc/ms检查反应直至完成。真空除去dmf，粗产物在dcm中稀释并通过色谱(dcm:meoh 99:1至70:30，15min)纯化，得到黄色固体(15mg.0.034mmol,19.7％)。ms(es )m/z 438.19(m 1h)
1
[0576]
2-(氨基甲基)-n-((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)异烟酰胺的合成
[0577][0578]
方案20.2-(氨基甲基)-n-((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)异烟酰胺的制备合成路线
[0579]
将((4-(((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(15mg,0.034mmol,1.0eq)溶解于400μl的dcm中并滴加tfa(200μl，20％体积)。将反应在室温下搅拌并通过lc/ms检查直至完成。将粗产物在500μl 1:1的水：乙腈溶液中干燥和冻干，得到黄色粉末(4mg，11.86μmol，34.8％)。ms(es )m/z 338.14(m 1h)
1
[0580]
4-(((4-(((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)吡啶-2-基)甲基)氨基)-4-氧代丁酸，缀合物29的合成
[0581][0582]
方案21.4-(((4-(((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)吡啶-2-基)甲基)氨基)-4-氧代丁酸的制备合成路线
[0583]
将2-(氨基甲基)-n-((s)-1-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-1-氧代丙-2-基)异烟酰胺(4mg,11.86μmol,1.0eq)溶解于500μl的thf中。加入dmap(6mg,48μmol,4.0eq)和琥珀酸酐(3.5mg,35.6μmol,3.0eq)，将反应在室温下搅拌并通过lc/ms检查直至完成。将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)直接纯化并冻干，得到黄色固体(1.3mg,2.97μmol,25％)。ms(es )m/z 438.15(m 1h)
1
[0584]
esv6-alexa fluor 488，缀合物30的合成
[0585][0586]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(293μg,0.32μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(300μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入alexa fluor
tm
488c5马来酰亚胺(200μg，0.29μmol，0.9eq)。将反应搅拌3h。
[0587]
将粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到橙色固体(70nmol，21.9％)。ms(es )m/z 1619.39(m 1h)
1
[0588]
esv6-valcit-pnu 159682缀合物31的合成
[0589][0590]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv-6(2mg,2.17μmol,1.2eq)溶解于pbs ph 7.4(750μl)中。以无水dmf溶液(250μl)形式加入ma-peg4-vc-pab-dmae-pnu 159682(2.5mg,1.75μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0591]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(3mg，73％)。ms(es )m/z 2348.88(m h)

[0592]
qcooh-valcit-pnu 159682缀合物32的合成
[0593]
[0594]
将sh-cys-asp-lys-asp-qcooh(1.6mg,2.17μmol,1.2eq)溶解于pbs ph 7.4(750μl)中。以无水dmf溶液(250μl)形式加入ma-peg4-vc-pab-dmae-pnu 159682(2.5mg,1.75μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0595]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(2.8mg,73％)。
[0596]
实施例10：化合物18、19、21、p4、27、28、29、30的表征和生物学检测
[0597]
材料和方法
[0598]
hfap的体外抑制测定
[0599]
在室温下在微量滴定读板器上测量人fap对z-gly-pro-amc底物的酶活性，在360nm的激发波长和465nm的发射波长下监测荧光。反应混合物含有20μm底物、20nm人fap(恒定)、测定缓冲液(50mm tris、100mm nacl、1mm edta，ph＝7.4)和检测化合物(10-6
至10-11
m连续稀释，1:2)，总体积为20μl。ic
50
值被定义为加入底物后酶活性降低50％所需的抑制剂浓度。
[0600]
细胞培养
[0601]
解冻后，将sk-mel-187、sk-rc-52.hfap和sk-rc-52.wt细胞保持在补充有胎牛血清(10％,fbs)和抗生素-抗真菌剂(1％，aa)的rpmi培养基中在37℃和5％co2下培养。对于传代，细胞在达到90％汇合度时使用胰蛋白酶-edta 0.05％分离，并以1:4的稀释度重新接种。
[0602]
解冻后，将ht-1080.hfap和ht-1080.wt细胞保持在补充有胎牛血清(10％,fbs)和抗生素-抗真菌剂(1％,aa)的dmem培养基中在37℃和5％co2下培养。对于传代，细胞在达到90％汇合度时使用胰蛋白酶-edta 0.05％分离，并以1:4的稀释度重新接种。
[0603]
动物研究
[0604]
所有动物实验均按照瑞士动物福利法律法规进行，许可证号为zh04/2018，由des kantons z
ü
rich授予。
[0605]
皮下sk-rc-52.hfap和ht-1080.hfap肿瘤的植入
[0606]
sk-rc-52.hfap、ht-1080.hfap、sk-rc-52.wt细胞生长至80％汇合度并用0.05％胰蛋白酶-edta分离。将细胞重悬于hbss培养基中，终浓度为5
×
107个细胞/ml。在雌性无胸腺balb/c nu/nu小鼠(6-8周龄)的侧腹皮下注射5
×
106个细胞(100μl悬浮液)的等分试样。sk-mel-187细胞生长至80％汇合度并用0.05％胰蛋白酶-edta分离。将细胞重悬于1:1的hbss:matrigel混合物中，终浓度为10
×
107个细胞/ml。在雌性无胸腺balb/c nu/nu小鼠(6-8周龄)的侧腹皮下注射5
×
106个细胞(200μl悬浮液)的等分试样。
[0607]
ivis实验
[0608]
在第一项实验中，如上所述，将ht-1080.hfap异种移植肿瘤植入雌性无胸腺balb/c nu/nu小鼠(6-8周龄)的右侧腋下，并使其生长至平均体积为0.1ml。如上所述，将sk-rc-52.wt异种移植肿瘤植入雌性无胸腺balb/c nu/nu小鼠(6-8周龄)的右侧腋下，并使其生长至平均体积为0.1ml。
[0609]
小鼠静脉内注射esv6-irdye750(18，150nmol/kg，在无菌pbs，ph 7.4中制备的30μm溶液)。通过co2窒息处死小鼠(1h时间点)，并在ivis spectrum成像系统(xenogen，曝光1s，分级因子8，745nm激发，800nm发射滤光片，f数2，视野13.1)上采集所有收集的器官(血
488(30)的结构。
[0632]
图21显示了sk-rc-52.hfap荷瘤小鼠中esv6-valcit-mmae(21)和qcoh-valcit-mmae(19)治疗活性的评估结果(a)。数据点表示平均肿瘤体积
±
sem(每组n＝4)。从第8天开始，连续6天静脉内施用化合物(尾静脉注射)。与分子的非靶向形式qcooh-valcit-mmae(19)相比，esv6-valcit-mmae(21)，高亲和力fap配体“esv6”的药物缀合衍生物，显示出更有效的抗肿瘤作用。(b)通过评价实验期间动物体重的变化(％)显示不同治疗的耐受性。(c)esv6-valcit-mmae(21)和qcooh-valcit-mmae(19)的结构。
[0633]
图22显示了esv6-valcit-mmae(21)、l19-il2及其组合在sk-rc-52.hfap荷瘤小鼠中的治疗活性评估结果(a)。数据点表示平均肿瘤体积
±
sem(每组n＝4)。在第8、10、12天静脉内施用(尾静脉注射)esv6-valcit-mmae。在第9、11、13天静脉内施用(尾静脉注射)l19-il2。与l19-2单独使用相比，esv6-valcit-mmae与l19-il2联合使用显示出非常有效的抗肿瘤作用(4/4完全肿瘤消退)。(b)通过评价实验期间动物体重的变化(％)显示不同治疗的耐受性。
[0634]
图23显示了小分子-药物缀合物esv6-valcit-mmae(21)在右侧腋下荷有sk-rc-52.hfap和左侧腋下荷有sk-rc-52.wt的balb/c nu/nu小鼠中的定量生物分布实验结果。该化合物在fap阳性sk-rc-52肿瘤中选择性蓄积(即，在肿瘤部位18％id/g，静脉内施用后6小时)。相反，esv6-valcit-mmae未在fap阴性sk-rc-52野生型肿瘤中蓄积。缀合物在健康器官中的摄取可忽略不计(低于1％id/g)。
[0635]
图24显示了缀合物27(其包括
69
ga有效载荷)在小鼠血清中的稳定性研究结果。温育后0和6小时处理样品的hplc和lc/ms图谱显示具有正确质量的单峰(预期质量：1028.30。ms(es )m/z 514.3(m 2h))。
[0636]
实施例11：其他缀合物的合成
[0637]
缀合物39的合成
[0638][0639]
将(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(15mg,0.032mmol,1.0eq)溶解于无水dmso(400μl)中。加入二环己基碳二亚胺(9mg，0.042mmol，1.3eq)和n-羟基琥珀酰亚胺(4.5mg，0.039mmol，1.3eq)并将反应在室温下避光搅拌过夜。加入100μl含有2,2'-(7-(4-((2-氨基乙基)氨基)-1-羧基-4-氧丁基)-1,4,7-三唑烷-1,4-二基)二乙酸的pbs溶液(16.2mg，0.039mmol，1.2eq)并
将反应搅拌2h。粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。ms(es )m/z 858.35(m h)

[0640]
缀合物40的合成
[0641][0642]
将缀合物39(1ml,150μm)在乙酸钠缓冲液(0.1m,ph 4)中的溶液加入单独的小瓶中，该小瓶包含新鲜制备的(al
18
f)
2
溶液(如先前在文献cleeren等人，生物缀合化学(bioconjugate.chem.)2016中所述获得)。将封闭的小瓶在95℃温度下加热12min。复合物的形成通过放射性hplc和放射性tlc分析证实。
[0643]
缀合物41的合成
[0644][0645]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(2mg,2.171μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(800μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入马来酰亚胺-nota(3.0mg,4.343μmol,2.0eq)。将反应搅拌3h。粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到黄色固体。ms(es )m/z 1345.48(m 1h)
1
。
[0646]
缀合物43a的合成
[0647][0648]
将市售的在tentagel树脂(300mg，0.18mmol，rapp polymere)上的预上样fmoc-lys(neboc)在dmf中溶胀(3
×
5min
×
5ml)，用20％哌啶的dmf溶液去除fmoc基团(1
×
1min
×
5ml和2
×
10min
×
5ml)，并且树脂用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤。肽用fmoc-glu(tbu)-oh、fmoc-glu(tbu)-oh和(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸以指定顺序延伸。为此，将fmoc保护的氨基酸(2.0eq)、hbtu(2.0eq)、hobt(2.0eq)和dipea(4.0eq)溶解于dmf(5ml)中。使混合物在0℃下静置10min，然后在温和搅拌下与树脂反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，用dmf中的20％哌啶去除fmoc基团(1
×
1min
×
5min和2
×
10min
×
5ml)。脱保护步骤之后进行用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤步骤，然后与下一个氨基酸偶联。在室温下用20％tfa在dcm中的混合物将肽从树脂上切割1h。减压除去溶剂，粗产物在冷乙醚中沉淀，离心，溶解于水/acn中并通过hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至5:5，15min)纯化并冻干，得到白色固体。该化合物与6-(三甲基-λ4-氮杂基)烟酸2,3,5,6-四氟苯基酯(2.0eq)在无水乙腈(2ml)中反应过夜。粗化合物与[
18
f]tbaf(2.0eq)、tbahco3(2.0eq)在tbuoh:meoh(5:2)的混合物中在50℃下反应10分钟以提供最终化合物。ms(es )m/z 967.33(m 1h)
1
[0649]
树脂上cys(strt)-cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc的合成
[0650][0651]
方案22.树脂上cys(strt)-cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc的制备合成路线
[0652]
将市售的在tentagel树脂(500mg,0.415mmol,rapp polymere)上的预上样fmoc-cys(trt)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀，用在dmf中的20％哌啶去除fmoc基团(1
×
1min
×
5ml和2
×
10min
×
5ml)，并且树脂用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤。肽用fmoc-cys(trt)、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-lys(nhboc)-oh和fmoc-asp(tbu)-oh以指定顺序延伸延伸。为此，将fmoc保护的氨基酸(2.0eq)、hbtu(2.0eq)、hobt(2.0eq)和dipea(4.0eq)溶解于dmf(5ml)
中。使混合物在0℃下静置10min，然后在温和搅拌下与树脂反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，用dmf中的20％哌啶去除fmoc基团(1
×
1min
×
5min和2
×
10min
×
5ml)。去保护步骤之后进行用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤步骤，然后与下一个氨基酸偶联。
[0653]
(2r,5r,8s,11s,14s)-11-(4-氨基丁基)-8-(羧甲基)-14-(4-((4-((2-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)-2,5-双(巯基甲基)-4,7,10,13-四氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷二酸(sh-cys-sh-cys-asp-lys-asp-esv6，p7)的合成
[0654][0655]
方案23.(2r,5r,8s,11s,14s)-11-(4-氨基丁基)-8-(羧甲基)-14-(4-((4-((2-((s)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)-2,5-双(巯基甲基)-4,7,10,13-四氧代-3,6,9,12-四氮杂十六烷二酸(sh-cys-sh-cys-asp-lys-asp-esv6，p7)的制备合成路线
[0656]
将树脂上cys(strt)-cys(strt)-asp(otbu)-lys(nhboc)-asp(otbu)-nhfmoc(80mg,0.04mmol)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀。肽用(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(37mg,0.08mmol,2eq)、hatu(30mg,0.08mmol,2.0eq)和dipea(28μl,0.16mmol,4.0eq)延伸并在温和搅拌下反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，通过将树脂与tfa(15％)、tis(2.5％)和h2o(2.5％)在dcm中的混合物在室温下搅拌4h来切割化合物。树脂用甲醇(2
×
5ml)洗涤，合并的切割和洗涤溶液在真空下浓缩。粗产物经反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体(8mg，0.95μmol，2.4％)。ms(es )m/z 1024.28(m h)

[0657]
esv6-valcit-mmae-bis(44)的合成
[0658][0659]
将sh-cys-sh-cys-asp-lys-asp-esv6(p7,1.2mg,1.175μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-valcit-pab-mmae(4.6mg,3.525μmol,3.0eq)。将反应搅拌3h。
[0660]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0661]
ms(es )m/z 3656.9(m h)

[0662]
esv6_2-valcit-mmae-bis(45)的合成
[0663]
[0664]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(p7,1mg,1.09μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-valcit-pab-mmae(1.4mg,1.09μmol,1.0eq)和osu-glu-valcit-pab-mmae(1.4mg,1.09μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0665]
ms(es )m/z 3456.8(m h)

[0666]
(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰氨基)喹啉-4-甲酰胺(p8)的合成
[0667][0668]
方案24.(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰氨基)喹啉-4-甲酰胺(p8)的制备合成路线
[0669]
在25ml圆底烧瓶中，将5-己炔酸(94mg，0.84mmol，1.5eq)溶解于1.5ml dcm和20μl dmf中。将混合物冷却至0℃并滴加草酰氯(107mg，0.84mmol，1.5eq)。移除冰浴并将反应搅拌15分钟。然后将混合物加入到冷却的实施例2-p4在dmf中的溶液中。30分钟后，粗产物用nahco3水溶液稀释，用dcm萃取，经无水na2so4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过色谱(dcm/meoh 100:0至90:10，10min)纯化，得到黄色油状物(78mg.0.267mmol,34％)。ms(es )m/z 454.16(m 1h)
1
[0670]
(s)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-5-氧代戊基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)丁酰氨基)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)喹啉-4-甲酰胺(p9)的合成
[0671][0672]
方案25.(s)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-5-氧代戊基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)丁酰氨基)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)喹啉-4-甲酰胺(p9)的制备合成路线
[0673]
将市售的在tentgel树脂(300mg,0.2mmol,novabiochem)上的预上样氨基-peg2在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀。树脂用dmf(5ml)中的5种叠氮戊酸(2.0eq)、hbtu(2.0eq)、hobt(2.0eq)和dipea(4.0eq)延伸。使混合物在0℃下静置10min，然后在温和搅拌下与树脂反应
1h。将(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰氨基)喹啉-4-甲酰胺(78mg,0.17mmol,0.86eq)、cui(4mg,0.02mmol,0.1eq)和tbta(34mg,0.06mmol,0.3eq)溶解于5ml的1:1dmf/thf混合物中。
[0674]
在室温下用20％tfa在dcm中的混合物将肽从树脂上切割1h。减压除去溶剂，粗产物在冷乙醚中沉淀，离心，溶解于水/acn中并通过hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至5:5，15min)纯化并冻干，得到白色固体(30mg,21％)。ms(es )m/z 727.8(m h)

[0675]
缀合物46的合成
[0676][0677]
将(s)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-5-氧代戊基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)丁酰氨基)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)喹啉-4-甲酰胺(1mg,1.4μmol,1.0eq)溶解于thf(200μl)中并滴加无水dipea(400μg,3.3μmol,2.4eq)。将fitc异构体i(0.8mg,2.1μmol,1.5eq)以dmso溶液形式以1mg在20μl中的浓度加入，将反应避光搅拌3h，粗产物用反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)直接纯化并冻干，得黄色粉末(1.1mg,70.4％)。ms(es )m/z 1116.4(m h)

[0678]
(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰氨基)喹啉-4-甲酰胺(p10)的合成
[0679][0680]
方案26.(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰氨基)喹啉-4-甲酰胺(p10)的制备合成路线
[0681]
将(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(将50mg,0.11mmol,1eq)、炔丙基胺(7mg,0.13mmol,1.2eq)和
hatu(49mg,0.13mmol,1.2eq)溶解于2ml dcm和100μl dmf中。滴加dipea(56mg，0.44mmol，4eq)并将反应在室温下搅拌30分钟。加入水，与有机层分离，然后用dcm萃取3次。粗产物经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。粗产物通过色谱(dcm/meoh 100:0至95:5，10min)纯化，得到深色油状物(32mg.0.0638mmol,58％)。ms(es )m/z 495.47(m 1h)
1
[0682]
bi-esv6-肽(p11)的合成
[0683][0684]
将市售的在tentagel树脂(300mg,0.18mmol,rapp polymere)上的预上样fmoc-cys(trt)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀，用在dmf中的20％哌啶去除fmoc基团(1
×
1min
×
5ml和2
×
10min
×
5ml)，并且树脂用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤。肽用fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-lys(nhboc)-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-n3-lys、fmoc-asp(tbu)-oh和(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸以指定的顺序延伸。为此，将fmoc保护的氨基酸(2.0eq)、hbtu(2.0eq)、hobt(2.0eq)和dipea(4.0eq)溶解于dmf(5ml)中。使混合物在0℃下静置10min，然后在温和搅拌下与树脂反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，用在dmf中的20％哌啶去除fmoc基团(1
×
1min
×
5min和2
×
10min
×
5ml)。去保护步骤之后进行用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤步骤，然后与下一个氨基酸偶联。(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰氨基)喹啉-4-甲酰胺(174mg,0.35mmol,2eq)、cui(4mg,0.02mmol,0.1eq)和tbta(28mg,0.05mmol,0.3eq)溶解于5ml的1:1dmf/thf混合物中。在室温下用20％tfa在dcm中的混合物将肽从树脂上切割1h。减压除去溶剂，粗产物在冷乙醚中沉淀，离心，溶解于水/acn中并通过hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至5:5，15min)纯化并冻干，得到白色固体(18mg,6％)。ms(es )m/z 1687.7(m h)

[0685]
缀合物47的合成
[0686][0687]
将bi-esv6-肽(p11,1mg,0.59μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入马来酰亚胺-荧光素(0.76mg,1.77μmol,3.0eq)。将反应搅拌3h。
[0688]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到黄色固体。
[0689]
ms(es )m/z 2114.7(m h)

[0690]
缀合物48的合成
[0691][0692]
将bi-esv6-肽(p11,1mg,0.59μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(300μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入alexa fluor
tm 488c5马来酰亚胺(200μg,0.29μmol,0.5eq)。将反应搅拌3h。
[0693]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到橙色固体。
[0694]
ms(es )m/z 2385.8(m 1h)
1
[0695]
缀合物49的合成
[0696][0697]
将bi-esv6-肽(p11,1mg,0.59μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-valcit-pab-mmae(1mg,0.76μmol,1.3eq)。将反应搅拌3h。
[0698]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0699]
ms(es )m/z 3003.5(m h)

[0700]
缀合物50的合成
[0701][0702]
将bi-esv6-肽(p11,1mg,0.59μmol,3.3eq)溶解于pbs ph 7.4(300μl)中。无水dmso溶液(200μl)形式加入irdye750(200μg,0.174μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0703]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到橙色固体。
[0704]
ms(es )m/z 2838.0(m 1h)
1
[0705]
缀合物51的合成
[0706][0707]
将bi-esv6-肽(p11,1mg,0.59μmol,1eq)溶解于pbs ph 7.4(300μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入马来酰亚胺-dota(465μg,0.59μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0708]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到橙色固体。
[0709]
ms(es )m/z 2213.9(m 1h)
1
[0710]
albutag-esv6-肽(p12)的合成
[0711][0712]
将市售的在tentagel树脂(300mg,0.18mmol,rapp polymere)上的预上样fmoc-cys(trt)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀，用在dmf中的20％哌啶去除fmoc基团(1
×
1min
×
5ml和2
×
10min
×
5ml)，并且树脂用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤。肽用fmoc-asp(tbu)-oh、
fmoc-lys(nhboc)-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-n3-lys、(tbu)-asp-oh、fmoc-glu(tbu)-oh和4-(4-碘苯基)丁酸以指定的顺序延伸。为此，将fmoc保护的氨基酸(2.0eq)、hbtu(2.0eq)、hobt(2.0eq)和dipea(4.0eq)溶解于dmf(5ml)中。使混合物在0℃下静置10min，然后在温和搅拌下与树脂反应1h。用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤后，用在dmf中的20％哌啶去除fmoc基团(1
×
1min
×
5min和2
×
10min
×
5ml)。去保护步骤之后进行用dmf(6
×
1min
×
5ml)洗涤步骤，然后与下一个氨基酸偶联。将(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰氨基)喹啉-4-甲酰胺
[0713]
(174mg,0.35mmol,2eq)、cui(4mg,0.02mmol,0.1eq)和tbta(28mg,0.05mmol,0.3eq)溶解于5ml的1:1dmf/thf混合物中。用20％tfa在dcm中的混合物在室温下将肽从树脂上切割1h。减压除去溶剂，粗产物在冷乙醚中沉淀，离心，溶解于水/acn中并通过hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至5:5，15min)纯化并冻干，得到白色固体(6mg,2％)。ms(es )m/z 1646.6(m h)

[0714]
缀合物52的合成
[0715][0716]
将albutag-esv6-肽(p12,1mg,0.61μmol,1.0eq)溶解于pbs ph7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入马来酰亚胺-荧光素(0.78mg,1.82μmol,3.0eq)。将反应搅拌3h。
[0717]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到黄色固体。
[0718]
ms(es )m/z 2073.6(m h)

[0719]
缀合物53的合成
[0720][0721]
将albutag-esv6-肽(p12,1mg,0.61μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(300μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入alexa fluor
tm
488c5马来酰亚胺(400μg，0.58μmol，0.95eq)。将反应搅拌3h。
[0722]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到橙色固体(180nmol，30％)。ms(es )m/z 2345.7(m 1h)
1
[0723]
缀合物54的合成
[0724][0725]
将albutag-esv6-肽(p12,1mg,0.61μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-valcit-pab-mmae(1mg,0.76μmol,1.25eq)。将反应搅拌3h。
[0726]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0727]
ms(es )m/z 2963.8(m h)

[0728]
缀合物55的合成
[0729][0730]
将albutag-esv6-肽(p12,1mg,0.61μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(300μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入irdye750(400μg,0.384μmol,0.58eq)。将反应搅拌3h。
[0731]
粗产物经反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到橙色固体(55nmol，9％)。ms(es )m/z 2797.9(m 1h)
1
[0732]
缀合物56的合成
[0733][0734]
将albutag-esv6-肽(p12,1mg,0.61μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(300μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入马来酰亚胺-dota(480μg,0.61μmol,1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0735]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到橙色固体。
[0736]
ms(es )m/z 2172.7(m 1h)
1
[0737]
bi-esv6(p13)的合成
[0738][0739]
将市售的2-氯-三苯甲基氯树脂(300mg)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀。树脂用在dmf(5ml)中的nhfmoc-叠氮基-赖氨酸(1mmol)、hbtu(1.0eq)、hobt(1.0eq)和dipea(2.0eq)延伸。使混合物在0℃下静置10min，然后在温和搅拌下与树脂反应1h。然后用甲醇洗涤树脂。树脂用在dmf(5ml)中的(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(1mmol)、hobt(1.0eq)和dipea(2.0eq)延伸。将(s)-n-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-8-(己-5-酰胺基)喹啉-4-甲酰胺(78mg,0.17mmol,0.86eq)、cui(4mg,0.02mmol,0.1eq)和tbta(34mg,0.06mmol,0.3eq)溶解于5ml的1:1dmf/thf混合物中。用50％hfip在dcm中的混合物在室温下将肽从树脂上切割1h。减压除去溶剂，粗产物在冷乙醚中沉淀，离心，溶解于水/acn中并通过hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至5:5，15分钟内)纯化并冻干，得到白色固体。ms(es )m/z 1111.1(m h)

[0740]
dota-ga-bi-esb6(57)的合成
[0741][0742]
将bi-esv6(p13,45mg,40.5μmol,1.0eq)溶解于无水dmso(400μl)中。加入二环己基碳二亚胺(10.9mg，52.7μmol，1.3eq)和n-羟基琥珀酰亚胺(14mg，122μmol，3eq)并将反应在室温下避光搅拌过夜。
[0743]
加入100μl含有2,2’,2
”‑
(10-(4-((2-氨基乙基)氨基)-1-羧基-4-氧代丁基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(25mg,48.6μmol,1.2eq)的pbs溶液并将反应搅拌2h。
[0744]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0745]
ms(es )m/z 1624.8(m h)

[0746]
合成mc-氨基酸(otbu)的一般程序
[0747][0748]
方案27.制备mc-氨基酸(otbu)的一般合成路线
[0749]
上述一般程序可以如下所述进行，例如，对于aa＝甘氨酸。
[0750]
在氩气氛下将6-马来酰亚胺基己酸(1.0eq)溶解于无水ch2cl2(1ml/mmol)中并将溶液冷却至0℃。随后加入edc
·
hcl(1.1eq)、dipea(2.3eq)和期望的h-aa-otbu
·
hcl(1.1eq)。将反应在室温下搅拌直至完成。混合物用acoet稀释，用1m khso4水溶液、饱和nahco3溶液和盐水洗涤。将有机相干燥并浓缩，得到期望的产物，为白色粉末。
[0751]
合成mc-氨基酸的一般程序
[0752][0753]
方案28.制备mc-氨基酸的一般合成路线
[0754]
上述一般程序可以如下所述进行，例如，r对应于aa＝甘氨酸。
[0755]
在氩气氛下，将期望的mc-氨基酸-otbu(1.0eq)溶解于无水ch2cl2(0.3ml/mmol)中。加入tfa(22.0eq)并将混合物在室温下搅拌2小时。将溶液浓缩并用己烷沉淀，得到白色粉末状产物。
[0756]
(9h-芴-9-基)甲基(2s)-2-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-1λ
4-吡咯烷-1-羧酸盐的合成
[0757][0758]
方案29.(9h-芴-9-基)甲基(2s)-2-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-1λ
4-吡咯烷-1-羧酸盐的制备合成路线
[0759]
在氩气氛下，将fmoc-pro-oh(312mg；0.92mmol；1.0eq)和hatu(393mg；1.01mmol；1.1eq)溶解于无水dmf(4ml)中，并将溶液冷却至0℃。滴加dipea(505μl；2.76mmol；3.0eq)并将混合物在相同温度下搅拌15分钟。以无水dmf中的溶液形式加入4-氨基苯甲醇(226mg，1.84mmol，2eq.)。混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用acoet稀释并用1m khso4水溶液、饱和nahco3和盐水洗涤。将合并的有机相干燥并真空浓缩。粗产物通过色谱(dcm/meoh 99:1至95:5，10min)纯化，得到白色粉末产物(274mg；0.66mmol；66％产率)。ms(es )m/z 443.19(m 1h)
1
[0760]
(s)-n-(4-(羟甲基)苯基)吡咯烷-2-甲酰胺的合成
[0761][0762]
方案30.(s)-n-(4-(羟甲基)苯基)吡咯烷-2-甲酰胺的制备合成路线
[0763]
在氩气气氛下，将(9h-芴-9-基)甲基(2s)-2-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-1λ
4-吡咯烷-1-羧酸盐(274mg；0.66mmol)溶解于无水dmf(30ml)中并冷却至0℃。加入哌啶(325μl；3.29mmol)并将混合物在室温下搅拌1小时。将溶液在高真空下浓缩，溶解于acoet(100ml)中，用nahco3水溶液和盐水洗涤。将有机相干燥并真空浓缩。粗产物通过色谱(dcm/meoh 99:1至90:10，含0.5％tea)纯化，得到棕色油状物产物。
[0764]
ms(es )m/z 221.12(m 1h)
1
[0765]
合成mc-aa-pro-pab的一般程序
[0766][0767]
方案31.制备mc-aa-pro-pab的一般合成路线
[0768]
在氩气氛下，将期望的mc-氨基酸(1.1eq)溶解于无水dmf(0.5ml/mmol)中，并将溶液冷却至0℃。随后加入hatu(1.1eq)、(s)-n-(4-(羟甲基)苯基)吡咯烷-2-甲酰胺(1.0eq)和dipea(1.5eq)。使反应缓慢达到室温并搅拌过夜。混合物用acoet稀释并用1m khso4和盐水洗涤。将有机相干燥并真空浓缩，粗产物通过色谱(dcm/meoh 93:7)纯化，得到期望的mc-aa-pro-pab
[0769]
合成mc-aa-pro-pab-pnp的一般程序
[0770][0771]
方案32.制备mc-aa-pro-pab-pnp的一般合成路线
[0772]
在氩气氛下，将氯甲酸4-硝基苯酯(2.2eq)在无水ch2cl2(1ml/mmol)中的溶液加入期望的mc-aa-pro-pab(1.0eq)在无水ch2cl2(1ml/mmol)中的悬浮液和吡啶(1.5eq)。完成后，真空除去溶剂，粗混合物经二氧化硅垫过滤，用acoet洗脱，得到mc-aa-pro-pab-pnp。
[0773]
合成mc-aa-pro-pab-mmae的一般程序
[0774][0775]
在氮气气氛下，将单甲基奥瑞他汀e(mmae
·
tfa 1.1eq)溶解于无水dmf(200μl)中。随后加入mc-aa-pro-pab-pnp(1.0eq)、hoat(0.5eq)和dipea(5.0eq)。将混合物在室温搅拌48小时并真空浓缩。粗产物用200μl 1:1水/甲醇的混合物稀释，并在反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)上纯化，以得到期望的白色固体产物。
[0776]
合成esv6-aa-pro-mmae(58)的一般程序
[0777][0778]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(p7,700μg,0.760μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入mc-aa-pro-pab-mmae(1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0779]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0780]
使用的aa、m/z和衍生物的产率列于下表
[0781]
化合物aams(es )m/z(m 1h)
1
58a甘氨酸2136.058b丙氨酸2150.058c缬氨酸2178.158d异亮氨酸2192.158e脯氨酸2176.158f精氨酸2235.1
[0782]
合成py-s-s-mmae的一般程序
[0783][0784]
方案33.py-s-s-mmae的一般合成路线
[0785]
在氮气气氛下，将单甲基奥瑞他汀e(mmae
·
tfa 1.1eq)溶解于无水dmf(200μl)中。随后加入各种取代的4-硝基苯基(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)碳酸酯(1.0eq)、hoat(0.5eq)和dipea(5.0eq)。将混合物在室温搅拌48小时并真空浓缩。将粗产物用200μl 1:1水/甲醇的混合物稀释，并在反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)上纯化。以得到期望的白色固体产物。
[0786]
合成esv6-s-s-mmae(59)的一般程序
[0787][0788]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(p7,700μg,0.760μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μl)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入期望的py-s-s-mmae(1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0789]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0790]
使用的r基团、m/z和衍生物的产率列于下表
[0791]
化合物rr’ms(es )m/z(m 1h)
1
59a-h-h1740.659b-ch
3-h1755.659c-ch
3-ch31770.6
[0792]
pencys-asp-lys-asp-esv6肽(p14)的合成
[0793][0794]
将市售的2-氯-三苯甲基氯树脂(300mg)在dmf(3
×
5min
×
5ml)中溶胀。树脂用fmoc-pencys(trt)、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-lys(nhboc)-oh和fmoc-asp(tbu)-oh以指定的顺序延伸。为此，将fmoc保护的氨基酸(2.0eq)、hbtu(2.0eq)、hobt(2.0eq)和dipea(4.0eq)溶解于dmf(5ml)中。树脂用在dmf(5ml)中的(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(1mmol)、hbtu(2.0eq)和dipea(2.0eq)延伸。用50％hfip在dcm中的混合物在室温下将肽从树脂上切割1h。减压除去溶剂，粗产物在冷乙醚中沉淀，离心，溶解于水/acn中并通过hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa9.5:0.5至5:5，15min)纯化并冻干，得到白色固体。ms(es )m/z949.3(m h)

[0795]
合成penesv6-s-s-mmae(60)的一般程序
[0796][0797]
将pencys-asp-lys-asp-esv6(700μg,0.760μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(840μ
l)中。以无水dmf溶液(160μl)形式加入期望的py-s-s-mmae(1.0eq)。将反应搅拌3h。
[0798]
粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到白色固体。
[0799]
使用的r基团和衍生物的m/z列在下表中
[0800]
化合物rr’ms(es )m/z(m 1h)
1
60a-h-h1770.660b-ch
3-h1785.660c-ch
3-ch31800.6
[0801]
(s)-n
1-(4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)-n
4-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基)琥珀酰亚胺(p15)的合成
[0802][0803]
方案34.制备(s)-n
1-(4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)-n
4-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基)琥珀酰亚胺(p15)的合成路线
[0804]
将(s)-4-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)氨基)-4-氧代丁酸(65mg,0.14mmol,1eq)、hatu(54mg,0.14mmol,1eq)和1-(2-氨基乙基)马来酰亚胺hcl(25mg,0.14mmol,1eq)溶解于1.5ml dcm和500μl dmf。滴加dipea(54mg，0.43mmol，3eq)并将反应在室温下搅拌30分钟。加入水，与有机层分离，然后用dcm萃取3次。粗产物经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。粗产物通过色谱(dcm/meoh 100:0至95:5，10min)纯化，得到黄色油状物(50mg，0.0868mmol，62％)。ms(es )m/z 582.6(m 1h)
1
[0805]
缀合物66的合成
[0806][0807]
将sh-cys-asp-lys-asp-esv6(2mg,2.171μmol,1.0eq)溶解于pbs ph 7.4(800μl)中。以无水dmso溶液(200μl)形式加入马来酰亚胺基-nodaga(3.3mg,4.343μmol,2.0eq)。将反应搅拌3h。粗产物通过反相hplc(水0.1％tfa/乙腈0.1％tfa 9.5:0.5至2:8，20min)纯化并冻干，得到黄色固体。ms(es )m/z 1346.36(m 1h)
1
[0808]
蛋白质-oncofap的一般合成
[0809][0810]
使用每个半胱氨酸残基30当量的tcep-hcl在4℃下将蛋白质还原过夜。产物通过fplc纯化，并合并含有产物的级分。
[0811]
然后将还原的蛋白质与每个半胱氨酸残基20当量的(s)-n
1-(4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-8-基)-n
4-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基)琥珀酰胺在室温下轻轻振荡1小时。
[0812]
然后通过fplc纯化产物并用lc/ms分析以确认身份。
[0813]
所描述的方案可用于功能化蛋白质、酶、靶点、抗体、免疫细胞因子、促炎蛋白和含有一个或多个半胱氨酸残基的肽。
[0814]
根据本发明的蛋白质缀合物的进一步实例是：与fap靶向剂(例如缀合物63、63a)
偶联的蛋白质，以及与多种fap靶向剂(例如69、69a)偶联的蛋白质，如下例所示。球表示通用的蛋白质结构。
[0815]