化合物的鉴定及其在治疗和预防严重急性呼吸综合征冠状病毒2的用途的制作方法

化合物的鉴定及其在治疗和预防严重急性呼吸综合征冠状病毒2的用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术请求保护2020年3月27日提交的申请号为63/001,114、2020年4月3日提交的申请号为63/004,916、2020年3月31日提交的申请号为63/003,187、2020年4月8日提交的申请号为63/007,261、2020年5月15日提交的申请号为63/025,631、2020年5月15日提交的申请号为63/025,837、2021年1月27日提交的申请号为63/142,392的共同未决的美国临时专利申请的权益，这些申请均通过引用如同充分阐述一样并入本文。
3.序列表
4.电子文件中包含的名称为“vand-0208-pct_sequence_listing_st25.txt”的序列表，创建于2021年3月27日，包含131kb，特此并入本文。
技术领域
5.sars-cov-2
6.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2或2019-ncov(有时))是一种球形阳性单链rna病毒，已导致2019冠状病毒病(covid-19)的持续大流行。迄今为止，sars-cov-2已在全世界感染了超过1.26亿人，并导致了超过270万人的死亡。sars-cov-2是β-冠状病毒属sars-cov种的一个株系。
7.与其他冠状病毒一样，sars-cov-2有四种结构蛋白：s(刺突)、e(包膜)、m(膜)和n(核衣壳)。s、e和m蛋白形成病毒包膜，而位于病毒颗粒核心的n蛋白结合病毒rna并负责其进入病毒颗粒的构象。一些β-冠状病毒在所述颗粒表面还含有血凝素酯酶(he)蛋白，其可以增强病毒进入宿主细胞的能力。
8.所述刺突蛋白是三聚体i类融合蛋白，高度糖基化，从病毒粒子表面突起，促进病毒附着和进入宿主细胞。在一些冠状病毒中，所述s蛋白由病毒颗粒表面的两个亚基s1和s2组成。在其他冠状病毒(包括sars-cov-2)中，所述s蛋白包括s1和s2结构域，但在病毒进入内吞小泡内裂解之前，在病毒颗粒表面保持完整。
9.s蛋白与宿主细胞膜的融合涉及其显著的结构重排。具体而言，s蛋白s1亚基的受体结合结构域(rbd)经历从“向下”构象(其中s1亚基的结合受体不可结合)到“向上”构象(其中所述受体可以结合)的构象运动。“向上”构象被认为比“向下”构象更不稳定。
10.最近使用低温电子显微镜(cryo-em)测定了s蛋白的精确三维结构。图7示出了s蛋白三维结构的图像。
11.s2结构域控制病毒进入宿主细胞。血管紧张素转化酶2(ace2)是一种i型膜蛋白，广泛表达于人体组织，包括肺、心脏、肾、肠和脂肪组织。ace2已被鉴定为早期sars-cov株的宿主细胞受体，并且是sars-cov-2s蛋白rbd的靶点。
12.rbd的结合被认为发生在ace2蛋白的外表面，而血管紧张素底物的结合发生在蛋白的深裂沟内。图8中示出了ace2的三维结构的图像。
13.最近，s蛋白的3.5埃分辨率结构已被描述。如上所述，s蛋白被切割成s1和s2亚基。
宿主蛋白酶对s蛋白的这种切割对于病毒感染及其通过溶酶体离开细胞至关重要。
14.在感染期间，s蛋白被宿主细胞蛋白酶切割，暴露s2结构域的融合肽。s蛋白的切割发生在s1和s2结构域之间，随后发生在靠近融合肽的s2结构域(s2’)内。这导致病毒和细胞膜融合，并将病毒基因组释放到宿主细胞的细胞质中。在这两个位点的切割被认为是病毒进入宿主细胞所必需的。
15.sars-cov-2的s1/s2切割位点分别位于s蛋白氨基酸序列的696位的苏氨酸和697位的蛋氨酸之间，在本文中以seq id 1提供。该s1/s2切割位点与sars-cov的s1/s2切割位点相同，并已显示被组织蛋白酶l(catl或ctsl)切割，所述组织蛋白酶l是由ctsl1基因编码的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。catl是一种c1肽酶二聚体，包含衍生自蛋白质前体的二硫键连接的重链和轻链。
16.sars-cov-2的s2结构域的切割位点，即s2
′
位点，与sars-cov的s2结构域切割位点相同，分别位于815位的精氨酸和816位的丝氨酸之间(seq id 1)。该位点也被认为在病毒进入期间被catl或跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)切割。已证明抑制catl或tmprss2可以抑制sars-cov感染。
17.sars-cov-2还具有在sars-cov中未发现的弗林蛋白酶(furin)样蛋白酶切割位点，分别位于685位的精氨酸和686位的丝氨酸之间(seq id 1)。该位点可以在病毒外出期间被弗林蛋白酶切割。sars-cov-2的s蛋白也可以由tmprss2引发。抑制tmprss2已被证明可以抑制sars-cov的感染。此外，tmprss2表达与肺上叶sars-cov感染相关。
18.tmprss2本身的功能未知。已知其在前列腺中高度表达。tmprss2也被发现被前列腺癌细胞中的雄激素上调。此外，50％的前列腺癌包含基因组重排，导致tmprss2基因的雄激素诱导启动子在e26转录因子(ets)癌基因附近并置，将ets癌基因置于雄激素控制之下。因此，对tmprss2在前列腺癌扩散和临床病程中的潜在作用进行了研究。
19.与sars-cov相似，sars-cov-2通过结合细胞受体(包括ace2)进入细胞。ace2表达降低与心血管疾病相关。
20.这种识别的结构基础最近已经被绘制出来，并且已经报道了靶向人类ace2复合物的病毒刺突蛋白全长的低温电子显微镜(cryo-em)结构。sars-cov-2的s蛋白与ace2的结合比sars-cov的结合紧密至少10倍，并介导受体识别。
21.尽管sars-cov和sars-cov-2的s1/s2和s2’切割位点相似，但尚不清楚适用于sars-cov的治疗策略是否同样适用于sars-cov-2。一项研究表明，一些sars-cov的rbd的特异性单克隆抗体不与sars-cov-2的s蛋白结合。然而，另一项研究显示，sars-cov的特异性单克隆抗体cr3022以高亲和力与sars-cov-2的rbd结合。
22.从当前大流行的患者中分离出的sars-cov-2样本的基因组显示差异很小，可能不到0.2％，这表明最近在人类中出现了这种病毒，并于出现后迅速检测到了这种病毒。因此，在sars-cov-2病毒在人群中传播时出现额外突变之前，及时确定治疗sars-cov-2的有效策略，将提高应对当前大流行的总体有效性。
23.感染这种病毒导致世界卫生组织于2020年3月11日宣布2019冠状病毒病(covid-19)大流行。人类sars-cov-2感染的潜在致命后果是一种急性呼吸窘迫综合征(ards)。
24.严重covid-19感染/ards
25.常见的covid-19症状包括咳嗽、发烧、疲劳、肌痛和腹泻。严重covid-19的症状通
常初始症状一周后开始，包括呼吸困难和低氧血症，表现出这些严重covid-19症状的患者的呼吸衰竭进展为急性呼吸窘迫综合征(ards)。严重covid-19感染可以导致心脏、肾脏和肝脏组织的急性损伤，包括这些器官系统的衰竭。一旦患上，ards通常是致命的。
26.在大流行的最初几个月，很明显，严重covid-19感染的风险较高与高龄和合并症有关。然而，这些都不能充分解释观察到的感染过程的异质性。
27.最近，对covid-19患者的基因测序研究表明，3p21.31位点与covid-19感染的严重程度相关。3号染色体上与严重covid-19最相关的遗传变异均处于高度连锁不平衡(ld)。最近的系统发育分析表明，严重covid-19感染风险的六个基因(slc6a20、lztfl1、ccr9、fyco1、cxcr6和xcr1)的单倍型从尼安德特人进入现代人类基因组。
28.宿主蛋白酶
29.sars-cov-2进入的宿主蛋白酶依赖性对其感染效果至关重要。sars-cov利用了内体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶b(ctsb)和组织蛋白酶l(ctsl)。ctsl是一种肽酶，优先切割p2位芳香残基和p3位疏水残基的肽键。在巯基存在下，ctsl在ph 3-6.5下具有活性，其酶稳定性取决于离子强度。在先前的埃博拉和sars-cov爆发期间，ctsl蛋白水解被证明是在细胞膜融合之前加工病毒糖蛋白的重要机制。
30.ctsl基因的遗传变异可能影响sars-cov-2的传播能力。例如，ctsl多态性可能影响个体对sars-cov-2的易感性，其中，例如，具有特定遗传变异的个体降低了ctsl的表达。与具有其他ctsl变体的个体相比，这些个体可以得到相对更好的保护或具有较低的病毒滴度。此外，宿主mhc i和ctsl介导的免疫应答的的元素可能影响病毒增殖。易感因素包括种族背景、年龄相关分组和共病情况。
31.高通量筛选试验(htsa)
32.elshabrawy等人，“identification of a broad-spectrum antiviral small molecule against sever acute respiratory syndrome coronavirus and ebola,hendra,and nipah viruses by using a novel high-throughput screening assay,”journal ofvirology 88(8):4353
–
4365(2014)，描述了一种高通量筛选试验(htsa)，用于鉴定可能用于治疗sars-cov、埃博拉病毒(ebov)、亨德拉病毒(hev)和尼帕病毒(niv)(都是高度传染性的人畜共患病病毒)的小分子。所有这些病毒都被封装，需要宿主蛋白酶进行糖蛋白加工、切割以进入宿主细胞。
33.htsa elshabrawy等人描述的方法有助于鉴定能够通过选择性抑制catl切割病毒融合肽来抑制假型病毒进入宿主细胞的几种化合物。优选的化合物导致对这种进入的强烈抑制，并显著减弱宿主肽(例如，前nyp衍生肽)的切割。
34.人白细胞弹性蛋白酶、d-二聚体和α1抗胰蛋白酶
35.d-二聚体是血凝块被纤维蛋白溶解分解后的分解产物，也称为纤维蛋白降解产物(fdp)。d-二聚体在炎症条件下可见，并被认为是纤溶酶和弹性蛋白酶(两种关键蛋白酶)活性的反映。人白细胞弹性蛋白酶(hle)参与纤维蛋白溶解，其活动产生d-二聚体，还切割许多其他蛋白质，包括弹性蛋白。白细胞弹性蛋白酶来源于粒细胞，在炎症过程中经常升高，是宿主免疫应答的一部分。肺内弹性蛋白酶活性增加与肺气肿有关。慢性阻塞性肺疾病(copd)发病机制中的一个普遍假设是蛋白酶及其抑制剂、特别是hle及其天然抑制剂α1抗胰蛋白酶(a1at)的平衡失调。此外，广泛的遗传证据表明，遗传性α1抗胰蛋白酶缺乏症患者
在成年后会出现肺气肿。
36.辅酶q10
37.氧化应激通过多种途径在病毒感染中发挥破坏作用，包括减少抗氧化反应。全球科学界正在试图迅速描绘rs-cov2感染疾病的病理生理学、重症相关生物标志物和潜在治疗方法。关键抗氧化剂水平例如辅酶q10(coq10)与sars-cov2感染严重性的相关性应该进行检查，因为潜在相关性可以指示疾病严重程度和可能具有致病作用的标志物。
38.coq10是一种脂溶性分子，属于泛醌家族(图13)。辅酶q10在人类中普遍存在，并存在于大多数细胞中，既可内源性合成，也可外源性获得。最高水平的coq10存在于代谢需求最高的器官，如心脏、肺、肾脏和肝脏。coq10具有多种重要的生理作用，包括在电子传输链中作为一种重要的辅因子生成atp，并作为脂质抗氧化剂中和自由基，及自由基对身体造成的损害。
39.coq10的水平可能因多种原因而降低，包括高龄、干扰合成的外源性化合物以及易导致较低水平的遗传条件。他汀类药物抑制hmg-coa还原酶，并由于抑制共同的合成途径，降低胆固醇合成和coq10水平。在用阿托伐他汀治疗后14天内可降低coq10水平的49％。coq10水平在20岁左右达到峰值，随后随时间呈年龄依赖性下降。80岁时最大的组织特异性下降发生在肺(下降峰值的51.7％)和心脏(下降峰值的42.9％)。参与coq10生物合成的若干基因突变可导致缺陷。
40.coq10作为自由基清除剂在体内具有整体抗炎作用，并已被广泛用于治疗各种炎症介导的疾病。补充coq10可改善脓毒症诱导的大鼠急性肺损伤的存活率和肺水肿。在感染性休克患者中，发现coq10水平较低，并与水平较高的炎症标志物有关。coq10对血小板聚集的抑制可以通过多种途径发生，包括camp和pka的上调，以及通过抑制玻连蛋白(cd51/cd61)。已发现coq10通过上调自噬过程有利于减轻大鼠肺和肝纤维化。补充coq10可以改善非酒精性脂肪肝患者的肝脏和全身炎症标志物。补充coq10可以改善心力衰竭患者的死亡率和心脏标志物。补充coq10可以改善糖尿病患者的总胆固醇和低密度脂蛋白水平。已发现补充coq10可以改善血脂异常患者的内皮功能障碍。
41.关于在病毒感染中的作用，coq10已被证明在急性流感患者中较低。一项对65名流感患儿的研究表明，与季节性流感组相比，h1n1患儿的coq10水平明显较低。
42.尽管coq10水平随着时间的推移以及通过服用例如他汀类等外源性药物而降低，但已经发现，一些遗传疾病也会导致coq10缺乏。研究发现，唐氏综合征患者的coq10水平较低，tnf-α和il-6水平较高。此外，唐氏综合症患者对病毒和细菌感染的易感性较高，自身免疫性疾病(糖尿病、甲状腺功能减退症)的发病率较高，急性肺损伤的发病率也较高。唐氏综合征患者的急性呼吸窘迫综合征(ards)被认为是自由基清除剂失衡所致。


技术实现要素：

43.本发明的一个方面包括鉴定用于治疗或预防严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)感染的化合物的方法，所述方法包括：筛选至少一种候选化合物，所述化合物具有抑制人蛋白酶在一个或多个靶位点切割sars-cov-2刺突蛋白的能力。
44.本发明的另一方面提供了一种用被确定具有抑制活性的化合物预测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)刺突蛋白酶切割抑制的疗效的方法，所述方法包括：确定
2)。所述方法涉及给这样的个体施用一定量的抗雄激素剂，所述抗雄激素剂有效地将个体中的跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)的活性降低到足以改善ards的表现(即，一种或多种症状或其他生理效应)的水平。本发明的相关方面提供了一种通过给个体施用至少一种抗雄激素剂来降低个体中跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)活性的方法。
55.最具体地，所述方法包括对个体进行治疗，所述个体由于诊断感染或疑似感染冠状病毒2(sars-cov-2)而被诊断为患有或易患严重急性呼吸窘迫综合征的个体，所述治疗包括向所述个体施用可有效减少个体跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)活性的量的抗雄激素剂，直至足以改善ards表现的水平。
56.在本发明的另一个实施方案中，提供了通过给个体施用至少一种抗雄激素剂来降低个体中跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)的活性的方法。
57.为了本发明上述方法的目的，所述抗雄激素剂是一种或多种雄激素受体(ar)拮抗剂、雄激素合成抑制剂或抗促性腺激素。在这方面，在一个实施方案中，所述抗雄激素剂是一种或多种ar拮抗剂，所述ar拮抗剂选自：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙(oxendolone)、osaterone acetate、地诺孕素(dienogest)、屈螺酮(drospirenone)、美屈孕酮(medrogestone)，醋酸诺美孕酮(nomegestrol acetate)、普罗孕酮(promegestone)、曲美孕酮(trimegestone)、氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、topilutamide、恩杂鲁胺(enzalutamide)和阿帕鲁胺(apalutamide)。在另一个实施方案中，所述抗雄激素剂是一种或多种雄激素合成抑制剂，其选自酮康唑(ketoconazole)、醋酸阿比特龙酯(abiraterone acetate)、seviteronel、氨基谷丙酰胺(aminoglutethimide)、非那雄胺(finasteride)、度他雄胺(dutasteride)、爱普列特(epristeride)、alfatradiol和锯叶棕(serenoa repen)提取物。在另一个实施方案中，所述抗雄激素剂是一种或多种抗促性腺激素，所述抗促性腺激素选自西曲瑞克(cetrorelix)、烯丙基雌烯醇(allylestrenol)、氯地孕酮(chlormadinone acetate)、醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)、己酸孕诺酮(gestonorone caproate)、己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲孕酮(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、osaterone acetate、奥生多龙(oxendolone)、雌二醇(estradiol)、雌二醇酯(estradiol esters)、炔雌醇(ethinylestradiol)、共轭雌激素和己烯雌酚(diethylstilbestrol)。
58.在另一方面，本发明提供了一种鉴定化合物是治疗个体感染或预防个体或细胞感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的潜在有用候选物的方法，包括：确定化合物与血管紧张素转换酶2(ace2)结合，从而随后与sars-cov-2的刺突蛋白结合在一个或多个氨基酸上被阻断，所述氨基酸选自：seq id 1的第34位的组氨酸、seq id 1的第30位的天冬氨酸、seq id 1的第41位的酪氨酸、seq id 1的第42位的谷氨酰胺、seq id 3的第353位的赖氨酸和seq id 1的第453位的精氨酸；或确定所述化合物与sars-cov-2刺突蛋白结合，使得随后的结合在一个或多个氨基酸处被阻断，所述氨基酸选自：seq id 2的第453位的酪氨酸、seq id 2的第498位的谷氨酰胺、seq id 2的第500位的苏氨酸、seq id2的第501位的天冬酰胺和seq id 2的第417位的赖氨酸。这种确定可以包括计算选自以下的一项或多项：范德瓦尔斯能量项、库伦能量项、亲脂性项、氢键项、金属结合项、奖励项和惩罚项。
59.在另一方面，本发明提供了一种抑制在细胞膜上显示血管紧张素转换酶2(ace2)
的细胞中突发急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)感染的方法，所述方法包括：将细胞暴露于能够防止sars-cov-2刺突蛋白与细胞上的ace2结合的浓度的化合物。
60.本发明的另一方面提供了治疗感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的个体的方法，所述方法包括：向所述个体施用一定量的化合物，所述化合物可以有效地预防所述sars-cov-2刺突蛋白与血管紧张素转换酶2(ace2)结合在所述细胞膜上显示ace2的个体的细胞上。
61.在另一方面，本发明提供了一种预防具有严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)感染具有被感染风险的个体的方法，所述方法包括：向个体施用一定量的化合物，所述化合物可以有效地预防sars-cov-2刺突蛋白与血管紧张素转换酶2(ace2)的结合，所述ace2位于个体的在细胞膜上呈现ace2的细胞上。
62.本发明的另一方面提供了一种治疗或预防个体感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的方法，所述方法包括：确定个体的coq10水平低于预期；并向个体施用一定量的coq10。
63.本发明的另一方面包括治疗患有β-新冠病毒感染的患者的方法，所述方法包括：确定或已经确定患者是否携带至少一种与严重β-冠状病毒感染相关的遗传标志物；以及在患者携带至少一种与严重β-冠状病毒感染相关的遗传标志物的情况下，向患者施用有效量的至少一种能够抑制fyco1基因表达的化合物，所述至少一种化合物选自吲哚美辛(indomethacin)、扑米酮(primidone)、盐酸曲普利啶(triprolidine hydrochloride)和巴氯芬(baclofen)。
64.本发明的另一方面提供了一种确定个体中严重β-冠状病毒感染的易感性的方法，所述方法包括：确定或已经确定所述个体是否携带至少一种与严重β-冠状病毒感染相关的标志物；并在所述个体携带与严重β-冠状病毒感染相关的至少一种标志物的情况下，确定所述个体易感于严重β-冠状病毒感染。
附图说明
65.结合描述本发明的各种实施方案的附图和本发明的各个方面的具体实施方式，将更容易理解本发明的这些和其他特征，其中：
66.图1示出了金刚烷胺对溶酶体途径基因的影响。
67.图2示出了ctsl在不同器官和相关细胞类型中的表达。
68.图3示出了rs2378757变体在肺组织中的相对表达。
69.图4示出了各种组织类型中ctsl转录本的可变剪接。
70.图5示出了图(a)中人中性粒细胞弹性蛋白酶蛋白的三维结构和图(b)中α1抗胰蛋白酶的三维结构。
71.图6示出了一项研究中报告的欧洲pi*sz的热图。
72.图7是sars-cov-2的s蛋白的三维结构的表示。
73.图8是ace2的三维结构的表示。
74.图9a和9b分别是ay-nh2化合物对ace2的结合亲和力分析的图示和与ace2结合的ay-nh2化合物的三维结构的图像。
75.图10a和10b分别是nad

化合物对ace2的结合亲和力分析的图示和与ace2结合的
nad

化合物的三维结构的图像。
76.图11a和11b分别是瑞普特罗化合物对ace2的结合亲和力分析的图示和与ace2结合的瑞普特罗化合物的三维结构的图像。
77.图12a和12b分别是胸腺五肽化合物对ace2的结合亲和力分析的图示和与ace2结合的胸腺五肽化合物的三维结构的图像。
78.图13示出了coq10的分子结构。
79.应注意的是，附图不是按比例的并且仅旨在描绘本发明的通常方面，因此不应被视为限制本发明的范围。
具体实施方式
80.筛选试验
81.申请人已经在sars-cov-2的s蛋白序列中鉴定了许多可能与治疗或预防sars-cov-2感染相关的catl的新的切割位点。任何具有抑制在这些位点的一个或多个处切割能力的化合物，包括小分子，无论是通过与宿主蛋白酶结合直接抑制酶切割、与s蛋白结合以阻断这些切割位点、改变宿主蛋白酶的表达、或改变含有宿主蛋白酶的溶酶体的功能，都可用于治疗或预防sars-cov-2感染。
82.申请人鉴定的新的切割位点包括已知或认为发生蛋白酶切割的s蛋白(seq id 1)的野生型氨基酸序列的位置，无论是在病毒进入、复制、包装或外出期间。本领域技术人员将认识到，sars-cov-2的s蛋白的其他氨基酸序列是已知的，代表与野生型序列的微小偏差。在这些替代序列中也发现了本发明的新的切割位点，尽管特定的氨基酸位置可能不同。
83.本发明的新的切割位点包括分别位于第768位和第769位的苏氨酸和甘氨酸(seq id 1)之间的那些，以及分别位于第815位和第816位的精氨酸和丝氨酸(seq id1)。
84.本发明的实施方案包括筛选一种或多种候选化合物的方法，所述候选化合物具有在这些新的切割位点中的任一个处抑制sars-cov-2s蛋白的切割的能力。这种筛选包括使用测定法同时或顺序筛选多个候选化合物。
85.可用于实施本发明的测定包括例如elshabrawy等人所述的htsa，其通过引用如同充分阐述一样整体并入本文。
86.本发明的其他实施方案包括通过向个体施用至少一种被鉴定为具有这种抑制能力的化合物来抑制sars-cov-2刺突蛋白的切割、治疗sars-cov-2的感染,或预防sars-cov-2的感染。
87.事实上，申请人已经发现了s蛋白中的一个序列范围，所述序列范围似乎对酶切割和抑制这种切割的潜在结合都敏感。所述序列长度为23个氨基酸，从第757位的甘氨酸(seq id 1)延伸到第779位的谷氨酰胺(seq id 1)。该序列在下文中完整示出，并在本文中具体识别为seq id 2。
88.gsfctqlnratgiaveqdkntq(seq id 2)。
89.seq id 2内的任何氨基酸序列都可以作为结合的靶点。如本领域技术人员所理解的，这样的序列应当具有足够的长度以确保适当的结合特异性。预期seq id 2内序列的任何八聚体、九聚体或十聚体将提供足够的结合特异性。
90.申请人还发现，sars-cov-2的s蛋白序列中的一个或多个突变可以使酶切割的抑
制更有效。据信，这些突变导致s蛋白的构象变化，使得这些新的切割位点中的任一个对酶切割不太敏感。这些突变中的一种或多种的存在还可以通过已知化合物或根据本发明的实施方案鉴定的化合物改善在上述已知catl切割位点处的切割抑制。
91.这些突变如下表1所示。如本领域技术人员理解的，突变是根据野生型序列(seq id 1)中特定位置的氨基酸突变来描述的。
92.表1
[0093][0094][0095]
因此，本发明的实施方案可以进一步包括确定个体是否感染或有感染sars-cov-2病毒株的风险，所述病毒株包括表1中的一种或多种突变。
[0096]
当然，本领域技术人员应当清楚的是，确定刺突蛋白序列是否包括一个或多个这样的突变，从而对抑制酶切割更敏感，对除本文所述之外的筛选和治疗方法是适用的。这种确定步骤可以用于例如用根据本文所述方法以外的方法鉴定的化合物治疗个体。
[0097]
了解sars-cov-2感染的作用机制是确定最佳治疗药物的基础步骤。例如，通过影响环境或调节基因表达水平，干扰宿主细胞的s蛋白加工，提供了一种潜在的治疗策略。
[0098]
使用高通量筛选试验鉴定的新疗法，并示出了其在预测/选择的结合位点阻断了ctsl、ctsb、tmprss2或任何其他宿主蛋白酶对sars-cov2-s蛋白的切割，将是功能性靶向和限制sars-cov-2感染的可行方法。
[0099]
其他疗法的作用机制可能包括降低或调节ctsl的表达，或通过调节ph来影响ctsl溶酶体环境的条件。
[0100]
申请人已经测试了各种可以帮助鉴定具有降低ctsl基因表达能力的潜在疗法的药剂。五种此类药剂示出了这种潜力(其中一种是金刚烷胺)，并值得考虑，因为它们可能对治疗感染covid-19的患者有用。
[0101]
细胞培养与药物治疗
[0102]
药物筛选用于测试具有治疗或预防sars-cov-2感染潜力的药剂。视网膜色素上皮细胞系arpe-19/hpv-16被选择用以建立药物谱数据库，因为其非癌性、人类起源、核型正常。arpe-19/hpv-16在96孔板中容易单层生长，并表达多种已知的神经元、细胞表面受体(包括多巴胺受体d2、血清素受体1a、2a和2c、蕈毒碱受体m3和组胺受体h1)。
[0103]
根据供应商的规范(atcc，马纳萨斯，弗吉尼亚州)繁殖细胞系。化合物从sigma(圣路易斯，密苏里州)或vanda pharmaceuticals(华盛顿特区)获得。提供含有药物或药物载体(水、二甲基亚砜、乙醇、甲醇或磷酸盐缓冲盐水溶液)的新鲜培养基前，在96孔板上等分细胞(2
×
105个细胞/孔)，并孵育24小时。药物在含有非必需氨基酸和110mg/l丙酮酸钠的缓冲advanced d-mem/f-12培养基(invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中稀释1000倍。在这些条件下，预计ph值不会发生显著变化，这通过监测培养基中存在的ph指示剂得到证实。
[0104]
选择最终药物浓度为10μm，因为其被认为符合生理相关性范围。在处理结束时对每个孔进行显微镜检查，以丢弃其细胞具有与凋亡一致的形态变化的任何样品。还证实了药物没有在培养基中沉淀。
[0105]
基因表达测定
[0106]
处理后24小时收获细胞，并使用rneasy 96方案(qiagen，瓦伦西亚，加利福尼亚州)提取rna。使用u133a2.0微阵列按照制造商的说明(affymetrix，圣克拉拉，加利福尼亚州)生成12490个基因的22238个探针组的基因表达。药物重复两次或三次分析，每个平板上有多个载体对照。共分析了708个微阵列，其中74个用于18种抗精神病药物，499个用于448种其他化合物，135个用于载体对照。
[0107]
原始扫描数据首先使用mas 5.0(affymetrix)转换为平均差值。将治疗和对照数据的平均差值设置为最小阈值50。如果低于50，对于每个治疗实例，根据其振幅或相对于载体对照的表达水平(或使用多个对照时的平均值)对所有探针集进行排序。振幅定义为表达率(t-v)/[(t v)/2]，其中t对应于治疗实例，v对应于载体实例。
[0108]
使用新的weighted influence model,rank ofranks(wimrr)方法创建每个药物组谱，该方法强调整个基因表达谱中每个探针集的排序，而不是表达水平的特定变化。wimrr获取每个探测集的组中所有成员的平均排序，然后将探测集从最小平均排序到最大平均排序重新排序。基因集富集度量基于kolmogorov
–
smirnov(ks)统计。具体而言，对于给定的一组探针，ks评分给出了在另一个治疗实例的谱内上调(阳性)或下调(阴性)的这组探针的发生程度的测量。
[0109]
结果
[0110]
申请人分析了所有466种受试药物的ctsl表达谱，以发现阳性命中(positive hit)，并仅选择那些导致ctsl表达降低至少33％(1.5倍下调)的结果。靠前的药物靶点(表1)包括来自不同治疗领域的药物——肌肉松弛剂、抗组胺药、抗癫痫药、抗胆碱药和抗病毒药。没有任何药物可以使ctsl表达降低40％以上。其中靠前的结果是金刚烷胺，这是一种已知且安全的抗病毒剂，以前被用于治疗甲型流感患者。
[0111]
表2.影响ctsl下调的靠前药物列表
[0112][0113]
盐酸金刚烷胺是一种溶酶体碱化剂。金刚烷胺的物理化学性质导致溶酶体积累。溶酶体致敏药物通过ph改变、阻断ca
2
信号、溶酶体膜通透性、酶活性抑制和储存物质积累来影响溶酶体。金刚烷胺作为一种亲溶酶体物质，易于通过溶酶体膜并在溶酶体中积累。它可以降低溶酶体的ph，从而抑制蛋白酶活性。
[0114]
金刚烷胺还可以在病毒复制过程中阻断流感病毒的组装。此外，金刚烷胺可能通过下调ctsl和其他溶酶体途径基因直接影响病毒进入。
[0115]
盐酸金刚烷胺ir能够以100mg片剂(相当于81mg碱性金刚烷胺)和50mg/5ml糖浆(相当于40mg/5ml碱性金刚烷烷胺)的形式提供，通常每天施用两次。
[0116]
由于ctsl不是最高的差异表达转录物，申请人将分析扩展到所有被金刚烷胺下调的基因。在前500个差异表达探针(383个基因，所有基因的表达至少减少50％)中，申请人发现了21个与溶酶体相关的基因(go:005764，p＝2.49
×
10-5
)。此外，enrichr富集分析的最重要途径是kegg溶酶体。图1和表3和表4示出了金刚烷胺对溶酶体相关膜糖蛋白(lamp)途径基因的显著影响。
[0117]
表3
[0118][0119]
表4
[0120][0121]
申请人还调查了跨种族的ctsl表达的自然变异，重点是常见和罕见的变异。基因型组织表达(gtex)项目提供了来自838名捐赠者的49个人体组织的基因型信息和基因表达
水平，允许检查跨组织和跨个体的ctsl表达模式。图2示出了ctsl在不同器官和相关细胞类型中的表达。ctsl广泛表达于许多重要器官(肺、胫骨神经、脂肪、动脉、全血等中含量高)。
[0122]
通过观察ctsl中的eqtl变体，申请人发现了一种非常显著的肺特异性(rs2378757)变体，赋予高度可变的表达。如图3所示，cc基因型具有较低的基线表达，可能关联于更好的治疗反应，而aa基因型相反具有较高的表达，可能对较高的病毒载量敏感。
[0123]
申请人注意到一系列剪接qtl，其变体影响转录物的剪接比率，例如rs114063116，其在肺组织中显著存在。ctsl gtex分析指出了其对某些个体的潜在保护或敏感性。
[0124]
有趣的是，肺中ctsl转录物的选择性剪接进一步呈现了组织特异性调节程序。各种组织类型的结果如图4所示。
[0125]
最近的功能研究指出，近端ctsl1启动子(第c-171a位)中ctsl中的常见变体通过改变异源响应元件而改变转录。这种变体和类似的其他变体可能影响基线表达的自然多样性，从而影响sars-cov-2细胞进入时的病毒适应性。
[0126]
此外，申请人在gnomad数据库中注意到了ctsl的一些罕见变体和变异耐受状态。结果表明，在ctsl中平均有167个错义变体，预测该基因具有功能缺失变异耐受性，pli为0.01。加上显著的eqtl，这表明遗传变异对ctsl表达及其变异有很大影响。
[0127]
tmprss2在多种组织中也广泛表达，包括胃肠系统、肺和肾中的组织。ctsl和trmpss2转录物在一系列器官中的高表达可以解释这些组织中的病毒表现。例如，最近的研究表明，感染个体的粪便样本中存在sars-cov-2并且病毒对组织有显著影响。
[0128]
covid-19 ards与人类白细胞弹性蛋白酶活性增加
[0129]
covid-19中ards的病理生理学尚未阐明。在不受任何特定机制约束的情况下，申请人假设病毒感染导致宿主炎症反应，特别是在肺中，这导致下呼吸道和肺泡中粒细胞的隔离和活化。有显著证据表明，肺部炎症期间，hle是造成至少一种表面活性蛋白，表面活性蛋白质d(sp-d)耗竭的原因。表面活性蛋白a、b、c和d是由ii型肺泡细胞产生的表面活性剂的一部分，其作用是降低肺泡液相和气相之间界面的表面张力。据推测，肺泡中的hle的活性的增加可以导致患有继发于covid-19感染的ards的患者呼吸功能的迅速和灾难性恶化。如果是真的，这一理论提供了许多潜在的治疗机会，包括一些及时治疗的机会。
[0130]
α1抗胰蛋白酶缺乏症(aat)等位基因携带者与covid-19ards的风险
[0131]
导致aat的遗传多态性携带者可能会增加与covid-19感染相关的ards的风险。鉴于快速大流行已使卫生保健系统不堪重负，鉴别死亡风险最高的个体十分重要。据讨论，老年个体和有潜在医学状况的个体发生严重并发症和死亡的风险较高。然而，这类人群的结果存在差异，此外，随着感染人群的扩大，现在很明显，没有任何明显潜在疾病的年轻人生病正在变成重症，其中一些人死于急性呼吸衰竭。必须迅速进行必要的流行病学分析，并广泛分享数据，以便更好地评估和鉴定可能需要额外紧急干预的风险个体。
[0132]
欧洲一直是covid-19疫情的中心，该疫情与ards的高发病率和相关死亡率有关。文献中报告的aat等位基因的发病率以及新出现的covid-19死亡率数据表明，在s或zaat等位基因频率较高的人群中，死亡率有较高的趋势。在blanco等人的综述中，他们报告了以下情况：“在欧洲，各地区的平均sz发病率(从最高到最低)如下：南欧，每483名受试者中有1名sz(1:483)；西欧，1:581；北欧，1:1492；中欧，1:1712；东欧，1:1181.8。”，预计南欧的新冠肺炎死亡率较高，中欧和东欧的死亡率较低。
[0133]
pi*sz基因型在南欧更为普遍，而在中欧不太普遍。还应指出，意大利半岛北部的发病率与南部相比更高，其中南部的发病率非常低。
[0134]
covid-19感染期间死亡率的累积数据(2020年3月31日)显示，死亡率(定义为死亡/确诊病例)与各国报告的pi*sza1at基因等位基因发病率之间存在相关性。为了稳健性，申请人仅包括了九个欧盟国家的数据，在提交时，这些国家已经报导了超过10000例确诊病例。相关分析结果如表5所示。使用所有九个国家的死亡率和pi*sz发病率，观察到r＝0.66(p值＝0.05)的显著相关性。根据blanco等人(2017年)，我们观察到意大利北部(较高)和南部(较低)之间pi*sz基因型的发病率存在显著差异。因此，我们这次重新分析了数据，不包括意大利。在表5(不包括意大利)所示的分析中，死亡率与pi*sz发病率之间的相关性更强，r＝0.88(p值＝0.003)。
[0135]
表5
[0136][0137][0138]
这些结果表明，pi*sz基因型状态可能是covid-19ards及其导致死亡率的危险因素。经进一步证实，这一观察结果可能表明，对于新冠肺炎感染和pi*sz基因型的患者，可以采取不同的治疗方法，包括积极的支持治疗和弹性蛋白酶活性降低治疗，所述治疗可能包括酶的小分子抑制剂和/或补充a1at活性。
[0139]
人白细胞弹性蛋白酶(hle)抑制剂治疗covid-19ards
[0140]
人们一直都有意向开发用于治疗肺气肿和治疗遗传型α1抗胰蛋白酶(a1at)缺乏症患者的hle抑制剂。
[0141]
西维来司他
[0142]
西维来司他目前在日本和韩国可用于治疗急性肺损伤(ali)，包括ards。aikawa和kawasaki的大量临床研究支持西维来司他在ards中的治疗用途。尽管如此，临床益处的大小仍存在争议。在一项对230名患有ali的通气患者进行的三期研究中，西维来司他减少了机械通气时间，缩短了icu住院时间，但对30天生存率没有明显影响。在另一项对492名患者的研究中，其对无呼吸机天数或28天全因死亡率没有影响。然而，在一项被设计以在404名ali患者和177名对照组中对重新评估西维来司他的效果的上市后研究中，西维来司他显著改善了无呼吸机的天数。虽然这些研究结果的差异可能是由于研究人群和研究设计的差异，但西维来司他目前在日本和韩国广泛用于ards患者的icu环境中。
[0143][0144]
是一种经美国食品和药物管理局批准的α-蛋白酶抑制剂(a1-pi)，适用于a1at缺乏和有肺气肿临床证据的成年人的慢性强化和维持治疗。不适用于尚未确定严重a1at缺乏的肺部疾病患者。
[0145]
alvelestat(mph996)
[0146]
alvelestat是美国正在开发的一种实验性白细胞弹性蛋白酶抑制剂，用于治疗pi*zz、pi*sz或pi*null/null基因型的α1抗胰蛋白酶缺乏症患者。根据ncats，“该药物的临床特征表明，其耐受性良好，几乎没有副作用，并且存在可以间接测量其体内活性的简单方法。”[0147]
人类白细胞弹性蛋白酶活性失衡可能在covid-19患者急性呼吸窘迫症状的产生和进展中发挥作用。施用小分子、肽或蛋白质抑制剂可以降低hle活性，包括通过直接干扰hle的酶活性或下调其编码中性粒细胞弹性蛋白酶基因(elane)，可能对covid-19重症患者具有治疗价值，因此值得在对照临床试验中研究。此外，申请人观察到具有pi*sz基因型的covid-19患者的死亡率较高，如果得到证实，可能会为这些患者提供具体的治疗选择和治疗计划。
[0148]
tmprss2
[0149]
tmprss2单核苷酸多态性rs8134378已被证明可减少雄激素受体的结合和反式激活。因此，细胞表面的tmprss2蛋白酶水平可能根据雄激素水平而变化。其他基因序列变异也可能导致细胞膜表面tmprss2表达的变异。
[0150]
例如，基因型组织表达(gtex)数据库中报告了许多与tmprss2基因的可变表达特异相关的表达数量性状基因座(eqtl)。这些包括rs8134657、rs8134378、rs6517673、rs9979885、rs9984523、rs9978587、rs28360562、rs34205539、rs1041449和rs3498323。在这9种多态性中，次要等位基因的携带者与较低的tmprss2表达相关，表明其在替代主要等位基因携带者中表达较高。
[0151]
鉴于这些发现以及tmprss2作为sars-cov-2细胞受体的作用，抗雄激素治疗可能降低tmprss2水平，从而降低病毒进入人类细胞的能力，降低病毒载量，并导致更好的临床结果。
[0152]
在实施本发明的各种实施方案中，可以使用抗雄激素剂，即阻断雄激素或雄激素
类药如睾酮的作用的药物。合适的抗雄激素剂包括例如雄激素受体(ar)拮抗剂，即直接阻断雄激素作用的药物。如上所述，ar拮抗剂的实施例包括甾体拮抗剂，如醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙(oxendolone)、osaterone acetate、地诺孕素(dienogest)、屈螺酮(drospirenone)、美屈孕酮(medrogestone)，醋酸诺美孕酮(nomegestrol acetate)、普罗孕酮(promegestone)、曲美孕酮(trimegestone)，以及非非甾体拮抗剂，例如氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、topilutamide、恩杂鲁胺(enzalutamide)和阿帕鲁胺(apalutamide)。
[0153]
其他合适的抗雄激素剂包括雄激素合成抑制剂，即作用于降低雄激素水平的药物。这类药剂包括cyp17a1抑制剂，例如酮康唑、醋酸阿比特龙酯、seviteronel，以及氨基谷丙酰胺(aminoglutethimide)，一种cyp11a1抑制剂。其他雄激素合成抑制剂包括5α-还原酶抑制剂，例如非那雄胺、度他雄胺、爱普列特、alfatradiol和锯叶棕(锯叶棕(sawpalmetto))提取物。
[0154]
还有其他抗雄激素药剂包括抗促性腺激素，即与雄激素合成抑制剂一样，可以降低雄激素水平的药物。这些包括促性腺激素释放激素(gnrh)调节剂，例如西曲瑞利；孕激素，例如烯丙基雌烯醇、氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、osaterone acetate、和奥生多龙(oxendolone)；和雌激素，例如雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素和己烯雌酚。
[0155]
如本领域已知的，除了上述和举例说明的抗雄激素剂之外，还可以使用其他抗雄激素药物。
[0156]
在本发明的实践方面，一种或多种抗雄激素药剂，包括上述一种或几种药剂，以足以降低个体中tmprss2活性的量施用于个体。这种减少的tmprss2活性可由雄激素的直接阻断(例如通过使用ar拮抗剂)、雄激素的产生或合成减少(例如通过雄激素合成抑制剂或抗促性腺激素的使用)或两者引起。在本发明的一些实施方案中，使用了ar拮抗剂和雄激素合成抑制剂，或ar拮抗剂和抗促性腺激素，包括任何数量的上述药剂或其组合。
[0157]
在本发明方法的实践中，基于ards的表现选择个体进行治疗。ards是由于肺部肺泡内的液体积聚，导致血液中氧气充盈，剥夺器官功能化所需的氧气。严重呼吸短促是ards的主要症状，可以在急性感染(如诊断或疑似冠状病毒2(sars-cov-2)感染)后数小时至数天内发展。一旦患上ards，往往是致命的。死亡风险随着年龄和合并症而增加。ards可以对肺部造成持久损害。ards的诊断是使用本领域已知的既定诊断标准来完成的，如基于症状或可能暴露于这种病毒确认个体是否患有冠状病毒2(sars-cov-2)感染或疑似患有这种感染。感染的诊断测试是本领域已知的。
[0158]
此外，在本发明的实践中，施用于个体的抗雄激素药剂的量由患者的状况、药剂的效力、患者的年龄和体重以及本领域已知的用于产生所需抗雄激素效果的其他标准确定。根据本方法的治疗在确定待治疗个体患有或疑似患有冠状病毒2(sars-cov-2)感染后的任何点开始，所述感染已产生ards的表现，或者对于无症状患者，可能会导致ards。例如，在诊断为ards之前，可以预防性地对ards高风险患者施用抗雄激素药剂。此类患者可包括高龄患者(例如，60岁或65岁以上)和具有合并症的患者，例如高血压、糖尿病、心血管疾病、哮喘或免疫系统紊乱，包括免疫抑制个体。
[0159]
根据本方法对个体的治疗可以持续到观察到ards的一个或多个症状的所期望的
改善为止，或者持续到ards完全消除为止，或者只需要个体恢复可能由于综合征而受损的肺功能。因此，对个体的治疗可以从治疗开始持续几天到几周，或者如果需要，可以持续几个月。
[0160]
aces2
[0161]
ace2的自然遗传变异可能影响个体对sars-cov-2感染的易感性和病毒的传播能力。具体而言，ace2基因型组织分析指出，在某些个体中，可能构成对sars-cov-2感染易感性或抵抗力的潜在变体的群体频率相当罕见。ace2相对于ace的表达也存在年龄相关差异。ace2/ace比率在年轻个体中高得多。此外，由于人类ace2基因位于x染色体上，携带罕见ace2编码变体的男性将是半合子，仅在ace2全表达细胞中表达这些罕见变体。另一方面，携带罕见ace2编码变体的女性明显更可能是杂合的，并且通常这些罕见ace2的变体的表达呈镶嵌分布，所述镶嵌分布由早期x-失活事件确定。
[0162]
比较人ace2氨基酸序列(seq id 12)与其他动物(鸡、猪、狗和猫)的氨基酸序列、以及它们被报导地对sars-cov-2感染的敏感性，并关注氨基酸残基功能性和氨基酸残基接触，某些氨基酸可能对病毒进入很重要。特别是一种氨基酸，第34位的组氨酸(his
34
；在图8中以蓝色示出)，似乎对病毒进入所有物种至关重要。对sars-cov-2病毒进入可能重要的其他ace2氨基酸包括asp
30
(图8中以红色示出)、tyr
41
、gln
42
、lys
353
和arg
357
。
[0163]
已经提出ace2序列的his34可能与位于s蛋白序列(seq id 2)的rbd内的第453位的酪氨酸(tyr453)进行氢键结合。ace2的asp
30
被认为与rbd的lys
417
进行类似地结合，同样地，ace2中的tyr
41
、gln
42
、lys
353
以及arg
357
与rbd中的gln
498
、thr
500
和asn
501
进行结合。
[0164]
进行计算机模拟化学库筛选允许鉴定能够与ace2或rbd序列的任何氨基酸结合或掩蔽结合的小分子。这种结合或掩蔽提供了抑制sars-cov-2病毒进入的机制，以治疗或预防感染。
[0165]
首先应用glide对接协议。这包括计算候选分子的glide评分，以预测ace2和rbd的结合。使用可以从有限责任公司获得的glide软件计算glide评分。计算glide评分的组件和用途在本领域中是已知的，特别是有限责任公司所描述的和市场化的方法，例如其glide 6.7用户手册，该用户手册在此并入本文，如同完全阐述。
[0166]
对接评分(即glide评分)是一个经验评分函数，旨在最大限度地将具有强结合亲和力的化合物与具有很少或没有结合能力的化合物分离。作为经验评分函数，它由解释结合过程物理的项组成，包括亲脂性-亲脂性项、氢键项、可旋转键惩罚和来自蛋白质-配体库仑-vdw能量的贡献。对接分数越低，对接越优化。评估候选分子在对接位点的实际相互作用(也包括分子锚定的方式)、hbond分数(如果氢键更优化，例如在更近的距离处，hbond项将更低)和配体效率(glide分数(gscore)除以重原子数的标准化版本)。
[0167]
接下来，确定候选分子的药物动力学相关分子描述符。最后，进行了分子动力学模拟，以验证对接结合模式的稳定性。总共分析了大约11000个非冗余候选分子。
[0168]
在筛选的候选分子中，具有最低(即，最有利于结合)对接分数的10个如下表6所示。
[0169]
表6
[0170][0171][0172]
ay-nh2是一种选择性par4受体激动剂肽(h-ala-tyr-pro-gly-lys-phe-nh2)，并产生最有利的对接分数。图9a是ay-nh2化合物的图形描述，所述ay-nh2化合物根据上述关于化合物与ace2的相关氨基酸的预测相互作用的测定被注释。这些包括与ace2asp
30
、ala
387
、gln
388
和glu
564
氨基酸结合的预测氢键。图9b是如上预测的与ace2结合的ay-nh2的三维图像。如此结合，sars-cov-2s蛋白rbd与ace2的his
34
(蓝色)或asp
30
(红色)的结合被ny-hn2(灰色)有效阻断。
[0173]
nad

(氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，一种参与许多代谢反应的辅酶，产生第二最有利的对接分数。据报道，nad

血浆水平随年龄显著下降。最近的研究表明，sars-cov-2感染的细胞系使nad

途径在nad

合成和利用方面显著失调。图10a是nad

化合物的图形描述，所述nad

化合物根据上述关于化合物与ace2的相关氨基酸的预测相互作用的测定被注释。图10b是如上预测的nad

与ace2结合的三维图像。例如sars-cov-2的s蛋白的rbd与ace2的his
34
(蓝色)或asp
30
(红色)结合的结合被nad (灰色)有效阻断。
[0174]
瑞普特罗(7-[3-[[2-(3,5-二羟基苯基)-2-羟乙基]氨基]丙基]-1,3-二甲基嘌呤-2,6-二酮)是一种短效β2肾上腺素受体激动剂，被批准用于治疗哮喘。它产生第三最有利的对接分数。图11a是瑞普特罗化合物的图形描述，所述瑞普特罗化合物根据上述关于化
合物与ace2的相关氨基酸的预测相互作用的测定被注释。图11b是如上预测的瑞普特罗与ace2结合的上的三维表示。因此，sars-cov-2的s蛋白的rbd与ace2的his
34
(蓝色)或asp
30
(红色)的结合被瑞普特罗(灰色)有效阻断。
[0175]
胸腺五肽(h-arg-lys-asp-val-tyr-oh)是一种用于增强胸腺t细胞生成的合成五肽。它产生第四个最有利的对接分数。图12a是所述胸腺五肽化合物的图形描述，所述胸腺五肽化合物根据上述关于所述化合物与ace2的相关氨基酸的预测相互作用的测定被注释。图12b是如上预测的胸腺五肽与ace2结合的三维表示。例如sars-cov-2的s蛋白的rbd与ace2的his
34
(蓝色)或asp
30
(红色)的结合被胸腺五肽(灰色)有效阻断。
[0176]
表6的其他化合物产生较低的对接分数，但能够抑制his
34
和上述其他ace2氨基酸的结合，从而抑制sars-cov-2感染。
[0177]
cgs 21680hcl(2-p-(2-羧乙基)苯乙基氨基-5
′‑
n-乙基甲酰胺腺苷盐酸盐)是一种选择性腺苷a2a-r激动剂。
[0178]
nadh二钠(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠)是大量氧化还原酶的辅酶。
[0179]
痛敏肽(1-7)(伤害感受片段1-7；h-phe-gly-gly-phe-thr-gly-ala-oh)是伤害感受的活性代谢物。
[0180]
莫匹罗星(9-(((e)-4-((2s,3r,4r,5s)-3,4-二羟基-5-(((2s,3s)-3-((2s,3s)-3-羟基丁烷-2-基)环氧乙烷-2-基)甲基)-3-甲基丁-2-烯酰基)氧壬酸；假单胞菌酸)是一种天然存在的抗生素，目前用于局部治疗脓疱病和其他皮肤葡萄球菌感染。它还被用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(s.aureus)(mrsa)感染。
[0181]
sligrl-nh2(h-ser-leu-ile-gly-arg-leu-nh2)是一种源于蛋白酶激活受体-2(par2)n端的肽，作为par2激动剂。
[0182]
氧烟酸(3-吡啶羧酸1-氧化物；烟酸1-氧化物)是一种具有降血脂活性的烟酸衍生物。
[0183]
在本发明方法的实践中，基于与sars-cov-2感染相关的症状的表现(包括急性呼吸窘迫综合征(ards))，或个体感染sars-cov-2的风险，选择个体进行治疗。sars-cov-2感染的诊断测试是本领域已知的。
[0184]
在确定个体是否需要治疗时，特别值得关注的是ards的表现，当液体在肺的肺泡中积聚时，导致血液中的氧气充盈，剥夺器官功能化所需的氧气。严重呼吸短促是ards的主要症状，可在急性感染(如诊断或疑似sars-cov-2感染)后数小时至数天内发展。adrs一旦患上，往往是致命的。死亡风险随着年龄和合并症而增加。adrs可以对肺部造成持久损害。ards的诊断是使用本领域已知的既定诊断标准来完成的，如基于症状或可能暴露于病毒来确定个体是否患有sars-cov-2感染或怀疑患有这种感染。
[0185]
此外，在本发明的实践中，给个体施用的治疗药剂(例如，ay-nh2、nad

、瑞普特罗、胸腺五肽、cgs 21680hcl、nadh二钠、痛敏肽(1-7)、莫匹罗星、sligrl-nh2或氧烟酸)的量由患者的状况、所述药剂的效价、患者的年龄和体重以及本领域已知的其他标准来确定。
[0186]
根据本方法的治疗可以在确定待治疗个体患有或疑似患有sars-cov-2感染后的任何时间点开始，所述感染已产生ards的表现，或对于无症状患者，可能导致ards。例如，在被诊断为ards之前，可以预防性地给处于发展为ards的高风险的患者施用治疗药剂。此类患者可以包括高龄患者(例如，60岁或65岁以上)和具有合并症的患者(例如高血压、糖尿
病、心血管疾病、哮喘或免疫系统紊乱，包括免疫抑制的个体)。
[0187]
辅酶q10和covid-19
[0188]
coq10水平降低与covid-19最严重感染人群之间可能存在潜在关联。导致严重疾病易感性的致病机制尚不清楚，但可能是由于防止氧化应激、减弱凝血、缓解过度免疫应答，或直接抑制病毒复制进入的能力降低。与疾病相关的缺陷可能涉及其他抗氧化剂，例维生素c和e。大型研究应测量covid-19感染者在出现时的coq10水平以及维生素和脂质水平，以检查其相关性是否预测临床结果，并检查是否与炎症细胞因子和分子(例如il-2、il-6、tnf-α和d-二聚体)有相关性。还应检查遗传易感coq10缺陷个体中感染covid-19的临床结果。鉴于sars-cov2感染的复杂性和疾病表现的异质性，重症的原因可能是多因素的。coq10可以作为严重疾病的相关标志物，并可能作为更差临床结果易感性的病因。
[0189]
如果这种关联被证实，可能会进一步探索致病机制，coq10可能在未来提供保护性治疗。在缺陷个体中补充coq10水平的剂量可从每天100mg至200mg开始，以产生生理影响。正如许多疾病状态的情况一样，预防可以带来更有效的益处。如果较低水平的coq10与严重的covid-19疾病相关，对有缺陷的个体进行补充可能提供了一种治疗方案，以减轻疾病负担，并可能改善这一大流行的状态。
[0190]
重度covid-19和fyco1
[0191]
对80例表现出严重症状的covid-19患者(68％为男性，32％为女性；年龄35
–
87岁)的基因组进行了分析，并与2000年全基因组关联研究(gwas)中1876名个体的基因组进行比较。该比较结果不仅证实了之前报道的严重covid-19感染与六基因尼安德特人单倍型之间的关联，还指出了fyco1基因和严重covid-19感染内的三个突变，以及它们与lztfl1基因内的rs73064425snp的关联。这种更离散的单倍型与严重covid-19感染的相关性最强，可能有助于预测和诊断严重covid-19感染。
[0192]
lztfl1 snp，rs73064425，一个c到t的变体，被报道次要等位基因频率(maf)为0.05。该值与2000年对照基因型中发现的值一致。然而，在covid-19患者中，maf为0.17。该snp与三个fyco1 snp中的每一个都处于强连锁不平衡状态。这些fyco1 snp，其中两个出现在同一密码子中，代表三个编码突变，导致生成的mrna中的氨基酸置换。
[0193]
在新关联的fyco1 snp中，第一个rs13079478是g/t变体，导致天冬氨酸取代天冬酰胺；第二个，rs13059238，是与rs13079478有相同密码子的t/c变体，但导致赖氨酸取代天冬酰胺；而第三个，rs33910087，是g/a变体，导致半胱氨酸取代精氨酸。
[0194]
下表7示出了covid-19人群和2000年对照人群中每个fyco1 snp的maf。
[0195]
表7
[0196]
snpwtma对照mafcovid-19mafp值rs73064425ct0.05330.16961.19
×
10-5
rs13079478gt0.078090.21437.84
×
10-6
rs13059238tc0.083160.22327.01
×
10-6
rs33910087ga0.080760.21431.34
×
10-5
[0197]
如表7所示，在covid-19人群中，fyco1和lztfl1 snp的次要等位基因频率显著较高。这提供了一种有用的方法，可以预测个体在暴露于covid-19的事件下是否容易出现严重的covid-19症状，并且是治疗covid-19患者的一种有价值的治疗工具，能够识别出更可
能出现严重covid-19症状的患者，对这些患者的所述症状进行早期治疗。
[0198]
fyco1基因
[0199]
fyco1基因编码一种参与囊泡转运和自噬的蛋白。它被认为是连接源自内质网的双膜囊泡(冠状病毒的主要复制位点)与微管网络的关键介质。
[0200]
通过其lc3相互作用区(lir)基序，fyco1也被证明对自噬体与溶酶体的融合非常重要。fyco1通过cc区二聚，通过其fyve结构域与pi3p相互作用，并通过位于fyve区前面的cc区的一部分与rab7形成复合物。具体而言，fyco1被示出作为rab7效应器，其与lc3和pi3p结合以介导微管加末端定向囊泡转运。rab7的缺失抑制晚期胞内体/多泡体(mvb)的成熟，并导致细胞中溶酶体数量减少。fyco1还介导了α-突触核蛋白聚集体的清除。
[0201]
在人类肺泡基底上皮癌细胞中进行的基因组尺度crispr功能缺失筛查确定了其缺失能够抵抗sars-cov-2感染的基因。rab7a的缺失通过在细胞内隔离ace2受体而减少病毒的进入/排出。针对lc3的n端的fyco1抗体的耗尽阻断了自噬体的亚细胞再分配。一些在lir结构域中含有错义突变的罕见fyco1变体与包涵体肌炎相关，包涵体心肌炎是一种以自噬降解受损为特征的疾病。
[0202]
fyco1中的功能获得性变体可能导致更高的严重covid-19感染风险，与其他β-冠状病毒相比，也可能导致类似的更大风险。因此，fyco1的下调将提供对这种严重感染的保护，提供一种针对covid-19的潜在治疗方法。
[0203]
高通量基因表达分析确定了能够下调fyco1的化合物。使用人视网膜色素上皮细胞系arpe-19和通过12490个基因收集的基因表达变化，共对来自14个治疗类别的466种化合物进行了此类分析。对于表8中所示的四种化合物，在所有466种化合物中对fyco1表达的影响最大。
[0204]
表8
[0205]
化合物处理对照差异吲哚美辛4.9496.488-1.539扑米酮6.44537.9412-1.4959盐酸曲普利啶6.49637.9898-1.4935巴氯芬6.72227.9412-1.2190
[0206]
吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，呈现抑制或下调fyco1表达的能力最大能力。吲哚美辛被批准用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、痛风性关节炎、滑囊炎和肌腱炎。它可以口服、静脉内或直肠施用。口服剂量通常为75-150mg/天，分为四个剂量。口服剂量可以为20mg、25mg、40mg和50mg胶囊、75mg缓释胶囊和25mg/5ml口服混悬剂。
[0207]
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[0208]
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