用于组织再生的方法及其试剂盒

用于组织再生的方法及其试剂盒
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2020年3月26日提交的题为“用于组织再生的方法及其试剂盒”的美国临时申请号63/000,309的优先权，其通过引用并入，犹如在本文中完整阐述。援引并入
2.本说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用整体并入本文，其程度每个犹如具体地且单独地指出单独的出版物或专利申请通过引用并入。关于联邦资助研究的声明
3.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)批准的合同de026914在政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。发明背景
4.在人和其他大型生物中，组织损伤会导致瘢痕形成和纤维化。这与涡虫、某些小鼠和其他“模式生物”中发生的组织修复不同，其中在上述动物中损伤导致正常组织结构再生而没有纤维化。促进人和其他大型生物的组织再生是生物医学研究的“圣杯(holy grail)”之一，可以彻底改变对影响器官功能的多种纤维化疾病的患者护理。此类疾病可包括但不限于心肌梗塞和缺血性中风，它们中的每一种都对个人和整个社会具有重大的经济和生活质量影响。此外，减少因外伤(包括烧伤、皮肤和下层组织的钝性和穿透性伤口)造成的纤维化瘢痕将显著改善这些情况下的结果。需要改善纤维化/瘢痕形成的新方法。


技术实现要素：

5.本发明涉及用于在大型哺乳动物(例如人)中促进伤口愈合同时减少纤维化和/或瘢痕的方法和试剂盒，其包括将包含粘着斑激酶(focal adhesion kinase，fak)抑制剂的组合物施用至所述大型哺乳动物的受伤组织附近(proximally)。fak抑制剂可以局部施用。组合物可以包括多孔支架，其中所述fak抑制剂布置在所述多孔支架的孔内。
6.在第一方面，提供了一种在大型哺乳动物中促进组织愈合同时减少纤维化的方法，包括：将含有有效量的粘着斑激酶(fak)抑制剂的组合物置于所述大型哺乳动物的组织附近，其中所述组织包括伤口；将组合物中的fak抑制剂分配到受伤组织附近；以及在选定的时间段内降低粘着斑激酶的水平，从而在愈合所述受伤组织的同时减少纤维化。
7.在一些变体(variation)中，可以局部施用含有fak抑制剂的组合物。
8.在一些变体中，组合物可以包括多孔支架，并且fak抑制剂布置在多孔支架的孔中。在一些变体中，多孔支架可以包括水凝胶。在一些变体中，多孔支架水凝胶可以是薄膜。在一些变体中，水凝胶可以是支链淀粉-胶原蛋白水凝胶(pullulan-collagen hydrogel)。
9.在一些变体中，大型哺乳动物可以是人。
10.在一些变体中，fak抑制剂可以是vs-6062。
11.在一些变体中，伤口可以是切口(incision)、穿透性伤口(penetrating wound)或烧伤。
12.在一些变体中，fak抑制剂可以配制用于控释。
13.在一些变体中，用含有fak抑制剂的组合物处理的选定的时间段可以是约7天至约100天。在一些变体中，可以每36小时至48小时将含有fak抑制剂的组合物新鲜地施用于组织附近。
14.在一些变体中，粘着斑激酶抑制剂的有效量可以是约30至约100微克/g组织重量。
15.在另一方面，提供了一种用于在大型哺乳动物中促进组织愈合同时减少纤维化的试剂盒，包括：含有fak抑制剂的组合物，所述组合物配置为局部施用至所述大型哺乳动物的受伤组织。在一些变体中，含有fak抑制剂的所述组合物配置成递送的fak抑制剂为约30至约100微克/g组织重量。在一些变体中，含有fak抑制剂的所述组合物配置为以控释方式递送所述fak抑制剂。
16.在一些变体中，组合物可以包括多孔支架，并且fak抑制剂布置在所述多孔支架的孔中。在一些变体中，多孔支架可以包括水凝胶。在一些变体中，多孔支架水凝胶可以是薄膜。在一些变体中，水凝胶可以是支链淀粉-胶原蛋白水凝胶。
17.在一些变体中，试剂盒还可包括配置为保护受伤组织的伤口敷料(wound dressing)。
附图说明
18.专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。专利局将根据请求和支付必要费用提供带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。
19.本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述以及附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中所述实施方案利用了本发明的原理，并且所述附图为：
20.图1a-1h。大型生物体中力学转导(mechanotransduction)的破坏可加速深部厚度伤口(deep partial-thickness)的愈合，减少纤维化瘢痕的形成，并促进组织再生。(图1a)大面积(5x 5cm)深部厚度切除伤口(～25cm2)是在红杜洛克猪(red duroc pig)的侧背部(左和右)上创建的(新鲜伤口的照片，底行)。伤口使用以下物质处理：标准绷带敷料(伤口：w，灰色框，左)；空白支链淀粉-胶原蛋白水凝胶(伤口 水凝胶：w_h，蓝色框，中间)；或释放粘着斑激酶抑制剂(faki)的水凝胶(伤口 faki水凝胶：w_hf，红色框，右)(每种情况总共n＝6-9个伤口)。(图1b)所有三组伤口均在指定时间点通过总摄影(gross photography)评估，直至术后(postoperative day，pod)180天。faki水凝胶处理持续到pod 90。所有猪的敷料更换持续到pod 90。(图1c)伤口闭合率和视觉模拟量表(vas)评分由四位不知情的瘢痕专家通过量化整个愈合过程中伤口的数码照片来评估(伤口闭合从pod 0到pod 25评估；vas在pod 90评估)。每个伤口n＝3个随机选择的图像。(图1d)伤口硬度(左)和弹性(右)在pod60时通过皮肤弹性测定仪(cutometer)在普通伤口(w)和faki处理的伤口(w_hf)之间进行比较(每种情况n＝8个伤口)。(图1d-1f)使用排列强度(平均矢量长度(mean vector length)；mvl，上图)和纤维长度指标(像素；px，下图)(每种情况n＝9个伤口)量化三组伤口的天狼猩红(picrosirius red)染色，并与未受伤的皮肤(uw)进行比较。(图1g)愈合瘢痕(从原始切除伤口的中心采集的样品)的马森三色染色(masson’strichrome staining)以评估毛囊(黄色实心箭头)、继发性皮肤腺(黑色实心箭头)和附件结构附近的皮内脂肪细胞(黄色虚线箭头)的存在。比例尺：200μm。(图1h)不知情的伤口专家在pod 90和pod 180时计
数愈合伤口中的毛囊(上图)和皮肤腺(下图)。通过使用方差分析(anova)和tukey多重比较检验(*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001)(图1e、1f、1h)，或使用未配对的双尾t检验(
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p《0.05)(图1d)进行统计比较。
21.图2a-2f。机械应力和随后的力学转导抑制驱动人成纤维细胞转录特征。图2a是从三名患者在不同解剖位置采集的组织中分离成人真皮成纤维细胞的方法的示意图；来自乳房切除术样品的乳房，来自腹部成形术样品的腹部，以及来自大腿成形术样品的大腿。将新鲜分离的成纤维细胞接种到3d胶原蛋白支架中，并进行无应变(ns，蓝色)、应变(s，绿色)或应变 10μm faki(s faki，橙色)，然后经受大规模并行测序(10xgenomics)和基因组分析。(图2b)胶原蛋白支架经受10％应变，并使用氧化钛点(中间9个圆圈(inner 9circles))来跟踪具体施加的应变，通过总摄影(上行)和示意图(下行)示出。支架固定在臂上以施加应变(外部圆圈；每个臂上2个圆圈)。比例尺：1cm(图2c)无应变(ns，蓝色)、应变(s，绿色)和应变 faki(s faki，橙色)组中细胞转录谱的umap密度图。(图2d)成纤维细胞转录特征的无监督聚类揭示了总共8个不同的人真皮成纤维细胞亚群(编号为0至7)。(图2e)所有聚类中前5个差异表达基因的热图(左)，以及通过基因本体分析揭示的每个聚类中差异表达最大的基因上调的主要途径(右)。(图2f)限定聚类的差异表达基因的特征umap图显示了相应的小提琴图，示出了每个聚类的表达水平；ptpn11
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非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶11，mmp1
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金属蛋白酶1，col1a1
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1型胶原蛋白α1，jund
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jund，tubb
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微管蛋白β1，stc1
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斯钙素-1，mfge8
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乳脂球-egf因子8，wnt5a-无翅相关整合位点5a(wingless-related integration site-5a)。
22.图3a-3e。破坏力学转导会耗尽促纤维化的成纤维细胞亚群，以防止瘢痕形成并允许皮肤再生。(图3a)使用正常(无应变)成纤维细胞作为起始点的成纤维细胞转录谱的拟时(pseudotime)umap分析。(图3b)有助于肌成纤维细胞分化、瘢痕形成或胶原蛋白降解的关键基因的特征图以及相应的小提琴图，以示出按处理组分类的表达水平(应变 faki-橙色，无应变-蓝色，应变-绿色)。acta2
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肌动蛋白α2，平滑肌，col1a1
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1型胶原蛋白α1，col3a1
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3型胶原蛋白α1，mmp1
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金属蛋白酶1，mmp3
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金属蛋白酶3。(图3c)这些相同基因的8个seurat聚类的拟时轨迹图(pseudotime trajectory plot)。(图3d)使用受伤且处理的(w_hf，左)与受伤且未处理的(w，右)猪真皮组织切片(来自图1)的免疫荧光染色进行人scrna-seq观测的蛋白质水平确认。αsma(翻译自acta2的蛋白质)、胶原蛋白i(col1a1)和胶原蛋白iii(col3a1)、mmp1(mmp1)和mmp3(mmp3)染色。比例尺：100μm。(图3e)示意性示出了拟议的作用机理，证明了增加的机械应力如何驱动纤维化和瘢痕形成。
23.图4。猪实验的时间表。从最初受伤到pod180的完整事件时间表示出在两个单独的时间线图中。b
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活检，c
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皮肤测量仪读数，p
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照片。
24.图5。猪深部厚度伤口随时间的视觉模拟量表(vas)的瘢痕评分。在指定时间点(初次受伤后约1、2和3个月)采集的瘢痕图像由四位不知情的瘢痕专家(全部为获得董事会认证的整形外科医生(board-certified plastic surgeon)和具有高级学位的伤口愈合科学家)进行分析。相对于每个对照伤口的较低分数表明所检查的五个组成部分(血管分布、色素沉着、可接受性、观察者舒适度和轮廓)有所改善，如方法部分所述。使用方差分析(anova)和tukey多重比较检验(**p《0.01；***p《0.001)对这些图进行统计分析。
25.图6a-6d。faki水凝胶在猪模型中的急性、全身和植入毒性测试。(图6a)为了评估急性毒性，连续14天每天将浓faki溶液(150μm和1.5mm溶解于4％dmso和30％peg-300中)滴
在未受伤的猪皮肤上。通过总摄影监测伤口，未观察到不良皮肤反应。蓝色框尺寸＝25cm2。(图6b)对经faki处理的猪的外周血样本进行质谱分析，以评估在人研究中口服给予faki后，相对于血清faki水平，覆盖全身表面积的大约7-10％的局部施用的faki的全身渗透率。在从三只不同猪收集的三个独立实验中，通过局部递送的血清faki浓度可忽略不计。(图6c-6d)faki水凝胶和空白水凝胶的生物相容性通过在皮下区域植入4cm2大小水凝胶，使用缝合线闭合来进行测试。14天后取出组织标本。裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)(图6c)染色显示出两种条件下的凋亡细胞水平较低，而三色染色(图6d)显示了上覆皮肤的真皮结构没有明显变化。
26.图7a-7b。使用两种已知的胶原蛋白分析指标证明了纤维分析。(图7a)使用两个先前发布的指标matfiber和ct-fire(均在matlab中)进行的可视化纤维的处理图像，用于天狼猩红染色图像的量化。使用这两个指标的分析显示了处理组之间的变化(如图1f所示)。(图7b)ct-fire量化纤维计数指标显示了faki处理使纤维数量更接近未受伤皮肤的能力的趋势。使用方差分析(anova)和图基(tukey)多重比较检验(*p《0.05)进行统计比较。
27.图8。围绕继发性真皮结构的再生皮内脂肪细胞是脂滴包被蛋白a阳性的、完全分化的脂肪细胞。在pod 90时的经faki处理的伤口(w_hf，底行)显示了脂滴包被蛋白a阳性的皮内脂肪细胞(红色，黄色虚线箭头)在靠近发育中的附件结构(白色箭头所示)的深层真皮层中再生。在未处理的对照(uw，未显示)和经安慰剂(仅水凝胶，w_h，顶行)处理的伤口中，没有皮内脂肪细胞。
28.图9a-9d。3d胶原蛋白支架系统概括了猪组织中的观察结果。(图9a)对没有应变(蓝色，左)、10％等双轴应变(绿色，中间)或10％等双轴应变 faki(橙色，右)的3d拉伸培养系统的拉伸和应变进行量化，证明了应变的有效诱导。(图9b)通过免疫荧光染色对在所有3种条件下培养的成纤维细胞中的α平滑肌肌动蛋白(αsma)肌成纤维细胞蛋白表达进行量化。dapi＝蓝色，αsma＝红色，比例尺：140μm(c)3d拉伸培养系统中成纤维细胞的排列，该系统经历了单轴约束(无应变)(蓝色，左)、仅10％单轴应变(绿色，中间)或10％单轴应变 faki(橙色，右)使用先前发表的分析成纤维细胞的毒伞素(phalloidin)免疫染色(绿色)的算法。比例尺：140μm。(图9c)使用胶原蛋白支架的体外收缩测试表明，用faki破坏力学转导会阻碍成纤维细胞重塑(r)细胞外基质(ecm)环境。通过使用方差分析(anova)和tukey多重比较检验(*p《0.05；****p《0.0001)(图9a-9c)，或通过未配对的双尾t检验(
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p《0.05)(图9d)进行统计比较。
29.图10a-10d。根据人供体对成纤维细胞表达的seurat作图显示，成纤维细胞根据应变和处理组聚类，而不是根据人来源。(图10a)来自三名患者(患者1、患者2和患者3，如图2所示)的成纤维细胞不根据患者来源进行聚类，而是根据实验组进行聚类(无应变[ns]与(vs.)应变[s]与(vs.)应变 faki，如图2所示。(图10b)3个人供体和3个处理组之间的所有9个组的详细视图。(图10c)根据encode基因数据库的细胞转录谱证实3d胶原蛋白系统内的所有细胞均为人成纤维细胞。(图10d)使用kegg go数据库分析了图2b中的8个修拉聚类(seurat cluster)中显著上调的基因的基因富集途径，强调了每个聚类中上调的关键力学转导和炎症途径。
[0030]
图11a-11d。另外的基因表达谱进一步证明应变增加了经典的促纤维化和力学转导标志物。(图11a)使用正常的成纤维细胞作为起始点，覆盖在seurat聚类上的拟时轨迹。
(图11b)随应变显著上调的基因的特征图和小提琴图(从左至右)：yes关联蛋白1(yes-associated protein 1，yap1)、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，pik3r1)、e-盒锌指结合蛋白2(zinc finger e-box binding homeobox 2，zeb2)、血小板源性生长因子受体-α(platelet-derived growth factor receptor-alpha，pdgfra)、表皮生长因子(epidermal growth factor，egfr)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，mapk1)、runt相关转录因子1(runt-related transcription factor 1，runx1)、ras相关c3肉毒杆菌毒素底物1(ras-related c3 botulinum toxin substrate 1，rac1)和rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶1(rho associated coiled-coil containing protein kinase 1，rock1)。(图11c)mmp10的特征图和相应的小提琴图——使用faki处理后显著上调的基因。(图11d)使用s faki成纤维细胞作为起点的拟时umap图，用于在图3c中创建基因轨迹。
具体实施方式
[0031]
如本文所述，大型哺乳动物是成年体重大于约7kg；约10kg；约20kg；约50kg；约60kg；约70kg，约80kg；约90kg；约100kg，约150kg；约200kg；约250kg或更多的哺乳动物。大型哺乳动物的出生体重可为约0.5kg；约1kg；约5kg；约7kg或更多。大型哺乳动物包括但不限于猫、狗、人、猪、马、骆驼或大象。
[0032]
如本文所指，粘着斑激酶(fak)抑制剂是能够抑制fak(也称为ptk2)的有机小分子或生物分子，其是细胞(包括上皮细胞)中整合素和生长因子受体下游的信号转导介质。尽管本文描述了使用vs-6062，但是方法和试剂盒不受此限制，并且可以使用任何合适的fak抑制剂。一些示例性fak抑制剂包括vs-6062、pf-562271、pr-573228、tae226(nvp-tae226)、pf-03814735、pf-562271hcl、gsk2256098、pf-431396、pnd-1186(vs-4718)、地法替尼(defactinib)(vs-6063、pf-04554878)和茄尼醇(solanesol)(nonaisoprenol)。
[0033]
组织修复和愈合仍然是出生后生活中最复杂的过程之一。受伤后，人和其他大型生物通过形成纤维化瘢痕组织而愈合，所述纤维化瘢痕组织具有减弱的功能。相比之下，涡虫、蝾螈和小鼠等较小的生物通过无瘢痕组织再生和恢复组织功能来应对损伤。已知的比例原则(scaling principle)表明，随着生物体变大，运动需要组织内成倍增加的峰值力。如在组织肥大和增生中所见，进化通过提高器官水平的机械性能来指导对这些需要的补偿。然而，这些生物适应可在受伤期间产生意想不到的后果，否则当前平衡良好的力量会导致组织纤维化和瘢痕形成。申请人已经发现，在大型动物模型中阻断力的生物传感器显著加速伤口愈合，并使得组织再生伴随恢复继发性结构(例如毛囊)。申请人已经证明，在人体组织中，机械力的增加会诱导成纤维细胞群向着促纤维化表型转变，这可以通过早期药理学阻断力学转导信号传导来逆转。首次表明，生物质量和力之间的基本关系会驱动大型生物体纤维化，而中断力转导的天然机制使得组织再生，这一发现对肢体、心脏和其他组织的再生具有重要意义。
[0034]
使“模式生物”与人和其他大型哺乳动物区分开来的一个主要特征是质量，其中大型生物通常大几个数量级(例如，人具有超过涡虫105倍的质量)。虽然进化使得模式生物能够在低机械应力的环境中完全再生，但承受增加的组织力的能力使哺乳动物的质量变得更大并增加了生物复杂性。已知的比例原则表明，随着生物体的进化和生长变大，其组织内的
峰值应力在移动和运动过程中呈指数增长。进化塑造了大型生物体的发展，以通过多种方式补偿这些增加的力，从组织肥大等基本变化到更复杂的适应，如肢体姿势的改变，以减少移动过程中骨骼和肌肉所承受的力。其他无法缓解这些力的器官，如皮肤，被迫通过改变和提高机械性能来适应这些力。这些控制生物质量和力之间关系的比例原则解释了人纤维化的发展。
[0035]
最近的多方面努力已经研究了再生模式生物，以查明可用于促进人再生的基因、蛋白质或信号通路。然而，虽然已经鉴定出新的目标通路，但尚不清楚增加机械力可能对这些过程产生的影响。
[0036]
申请人令人惊讶地已发现，在大型生物体再生中，组织中的机械应力是至关重要的。高机械应力促进成纤维细胞形成纤维化表型和胶原蛋白沉积，导致纤维化瘢痕形成，严重干扰再生过程。阻断力学转导可以抑制大型生物体中生理性伤口愈合的旺盛胶原蛋白沉积和纤维化特征，从而可能导致加速的、无瘢痕的伤口愈合和随后的皮肤再生。通过抑制细胞感知生理上高水平的机械应力，可以消除促纤维化亚群，并减少或消除随后的瘢痕形成。这可允许其他细胞迁移到伤口中以恢复正常的皮肤组成，从而在大型生物体中产生组织再生。申请人已发现，当试图在大型哺乳动物和人患者中实现真正的再生时，机械应力和细胞力学转导信号通路是要考虑的重要因素。申请人第一个发现破坏质量和力之间的基本关系可以消除生物复杂性和再生能力之间的进化权衡，驱动大型生物向类似“模式生物”的组织再生的方向发展。特别是，申请人已发现，破坏粘着斑激酶(fak)——一种主要的生物力传感器——可以使人和其他大型哺乳动物受伤后组织再生，并且可以为肢体、心脏和其他组织的再生提供深远影响。
[0037]
在大型动物伤口中抑制力的生物传感器允许以最小的纤维化反应进行组织再生。fak信号传导已被确定为将组织水平的整合素-基质力感知相互作用转移到下游细胞通路的上游介质。为了评估阻断力学转导对大型动物组织修复的影响，研究了fak的药理学抑制剂(fak-i，vs-6062)。该化合物先前在临床试验中被证明具有作为抗癌疗法治疗晚期实体瘤的有效性。选择红杜洛克猪的切割伤口，因为普遍认为这种模式生物是在皮肤生理学和皮肤伤口愈合方面与人最相似的大型动物。(参见图1a)。人和红杜洛克猪均通过长出厚厚的胶原增生性瘢痕(hts)来治愈深层皮肤损伤，所述胶原增生性瘢痕取代生理性软皮肤组织。与未受伤的皮肤相比，这种瘢痕组织永远不会有毛囊或皮肤附件恢复。相反地，该组织的特征在于真皮增厚并且没有皮内脂肪，从而导致机械硬度增加。
[0038]
使用小分子fak抑制剂(faki)研究了力学转导的破坏，以确定是否可以调节伤口愈合动力学。如实验部分所述，发现使用缓释的水凝胶支架的用faki处理的伤口在术后(pod)14
±
2.3天完全愈合，比用标准敷料或空水凝胶处理的伤口早10天以上，两者都在pod 24后愈合，如图1b-1c所示。此外，机械信号传导的药理学阻断使得经处理的猪伤口中产生正常的皮肤，如图1c所示。早在pod 40时，这种明显的瘢痕差异就很明显(参见图5)。使用组织皮肤弹性测定仪(一种测量皮肤生物力学特性的非侵入性临床仪器)，用faki处理的伤口表现出与未受伤皮肤相似的组织特性，包括硬度降低和弹性增加，如图1d中的条形图所示。总之，破坏细胞在皮肤受伤后感知组织机械应力的能力可使得加速愈合和正常皮肤特征的恢复。
[0039]
未处理的猪伤口中组织超微结构的定量评估揭示了明显的纤维化，通过胶原蛋白
伸长和增加的单向纤维排列得到证明，如图1e所示。相比之下，用药物阻断力学转导处理的伤口愈合有未受伤的猪皮肤特有的篮状编织胶原结构(basket weave-like collagen structure)，如图1e-1f和图7a-7b所示。此外，发现这些经处理的伤口表现出毛囊和其他皮肤腺的再生，类似于天然皮肤，而未处理而经受机械力的伤口没有实现继发性结构的再生，如图1g-1h和图8所示。不受理论束缚，这些结果表明机械信号传导可为伤口愈合过程中纤维化组织发育的关键介质。破坏这种信号传导可以减少纤维化，恢复正常的皮肤结构，并促进继发性结构再生。
[0040]
力学转导改变了人成纤维细胞的异质性。增加大型生物体质量的进化压力导致器官发育具有增加的耐用性和机械性能。为了确认猪模型中对力学转导在纤维化反应中作用的结果的转化潜力，然后评估了从人手术患者中分离的真皮成纤维细胞。细胞以2.0mg/ml胶原蛋白和200,000个细胞/ml的密度接种在3d胶原蛋白支架内(图2a)。为了人为地提高组织力，施加于成纤维细胞的机械应变按照chen,k.等人，“边界条件在确定响应拉伸的细胞排列中的作用(role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch)”,美国国家科学院院刊(pnas)115,986-991,doi:10.1073/pnas.1715059115(2018)的描述进行了精确操作，其全部公开内容通过引用整体并入本文，并且如图2b和图9a所示。在一个细胞子集中，faki处理的力学转导信号传导在施加应变后也立即被阻断。该体外系统模拟愈合伤口中观察到的纤维化表型和由此产生的瘢痕的功效得到证实。具体而言，在单轴应变环境中培养的真皮成纤维细胞表现出单向、细长的细胞排列，如图9c所示。相比之下，成纤维细胞无法感知多向排列的机械力，表明恢复与正常结构一致，所述正常结构类似于在猪皮肤中可见的，如图1e-1f所示。成纤维细胞ecm的重组驱动胶原蛋白重塑，以及长排列整齐的胶原纤维纤维化特征的发展。因此，抑制力学转导会降低成纤维细胞重组胶原蛋白和重塑其周围环境的能力，如图9d所示。这种3d胶原蛋白支架系统概括了在正常伤口愈合过程中观察到的纤维化反应和阻断这些反应的能力。
[0041]
使用该实验系统，模拟了体内真皮应变模式，对成纤维细胞施加双轴应变，同时还减弱了样品子集中的力学转导。胶原蛋白支架被酶消化以获得成纤维细胞的细胞悬浮液，然后对其进行处理以进行scrna-seq，如图2a和2c所示。所有单个细胞数据首先均以对起源表型不知情的方式进行分析。在对数归一化之后，汇集的数据进行半监督的基于louvain的聚类并嵌入到umap空间(seurat)。从来自汇集数据超集(superset)的细胞中鉴定出八个转录不同的亚群(聚类0至聚类7)，如图2d所示。当不设盲时，在表型和生物学复制中都发现了聚类之间相当大的允许性，这与已知的人皮肤成纤维细胞之间的异质性一致(图2d)。使用singler工具包针对encode blue数据库获得自动细胞水平注释，支持实验中使用的所有细胞都显示成纤维细胞转录程序(图10c)。
[0042]
发现未形变的成纤维细胞在umap嵌入中心附近聚集为相对均匀的组，代表了假定的聚类0中的绝大多数细胞。这些细胞——主要由诸如ptpn11和hadha的成纤维细胞基因(在聚类0中上调的已知的管家基因)的一致表达定义——可能代表实验系统中的天然成纤维细胞稳态(图2c-2d)。相比之下，发现成纤维细胞经受机械形变然后立即测序具有显著改变的转录组谱和数据流形(data manifold)内的相对不均匀分散。这些形变的成纤维细胞主要分布在聚类2、聚类3、聚类4和聚类7，并且由促纤维化基因(例如col1a1、col3a1、jund、tubb和wnt5a)的差异表达定义(图2c-2d)。
[0043]
最后，对成纤维细胞中的力学转导信号传导进行药理学破坏然后立即施加应变时，由此产生的转录程序与未处理的形变细胞转向相反“方向”的新亚态(meta-state)。这些经处理的细胞几乎完全映射到假定的聚类1、5和6，并由已知驱动ecm降解的基因(例如mmp1和mmp3)以及抗纤维化基因(例如stc1和mfge8)的差异过表达定义。经处理的成纤维细胞的一个小子集甚至似乎恢复到与未形变的成纤维细胞一致的转录程序——所述转录程序在来自形变且和未处理的成纤维细胞的任何细胞中都没有观察到。此外，经处理的细胞中成纤维细胞转录特征的整体变化是稳健的，并且在三个不同的人样品中保持不变，每个样品都是从不同患者的不同解剖位置采集的(图2c；图10a-10b)。力学转导的调节可以“推动”和“拉动”成纤维细胞程序朝向或远离纤维化转录状态。
[0044]
力学转导的破坏阻止了力响应性促纤维化亚群的富集，并使成纤维细胞整体转向应力屏蔽的假定再生状态。为了进一步研究在单细胞数据中观察到的转录变化，基于表型状态构建了拟时轨迹。将未形变的成纤维细胞定义为起始点，发现与还用faki处理的形变的成纤维细胞相比，机械形变的成纤维细胞沿相关的拟时轨迹显示出明显更强的转录差异(图3a；图11a)。这表明在应变过程中对成纤维细胞的处理不仅会改变产生的程序，而且所述改变以与未处理的形变的成纤维细胞相比在转录上差异较小的方式进行。
[0045]
对转录组特征的进一步分析表明，机械形变的成纤维细胞表现出经典促纤维化标志物(acta2，pdgfra)、促进肌成纤维细胞分化的标志物(runx1，zeb2)和下游的力学转导信号通路基因(mapk1，pi3kr1，egfr，rac1，yap1)的更高的表达(图3b；图11b)。抑制这些形变的成纤维细胞内的力学转导消除了几乎所有这些纤维化信号传导变化(图3b；图11b-11c)。
[0046]
检查纤维化的下游产物，尽管未形变和形变的成纤维细胞均表现出col1a1和col3a1 mrna的高表达，但是faki处理大大降低了这些ecm成分基因的转录。这种药理学阻断还增加了mmp1和mmp3的表达，mmp1和mmp3是参与胶原蛋白降解并且已知可减少多种疾病模型中的纤维化的关键酶。为了进一步证明这些发现，机械破坏的成纤维细胞设置为拟时间的起点，以绘制细胞转录特征从机械破坏到正常，最后到转录不同的、形变的成纤维细胞的进展(图3c；图11d)。通过按该顺序排列拟时轨迹，可以证明“再生轴(axis of regeneration)”与增加的机械应力成反比。沿着该轴，纤维化基因增加，而假定的再生基因减少。
[0047]
为了在蛋白质水平上进行确认，将人成纤维细胞的发现应用于大型动物比较者(comparator)的组织块。在特定时间点对受伤的猪组织进行免疫荧光染色，对从如图1a-1b所示的猪伤口采集的组织进行染色，得到图3d中所示的图像(如上文第[0035]至[0037]段所述)。αsma的蛋白质表达(acta2的翻译产物)、胶原蛋白i(col1a1)和胶原蛋白iii(col3a1)在经faki处理的伤口中减少，而mmp1(mmp1)和mmp3(mmp3)增加。因此，猪瘢痕病变中蛋白质表达的改变与通过人成纤维细胞的scrnaseq分析确定的基因表达数据一致(图3b-3d)。正常的猪伤口表现出增加的肌成纤维细胞分化，如αsma表达增加所证实的，这进而导致胶原沉积增加。相比之下，机械信号传导中断的伤口表现出肌成纤维细胞分化和胶原蛋白生成减少，同时mmp1和mmp3表达增加。这些数据证实了在人细胞中的发现，确定了机械信号在大型生物体伤口愈合和瘢痕形成中的关键作用。
[0048]
这些实验旨在检验机械应力的增加会直接导致人的生理伤口愈合过程中可见的促纤维化表型这一假设。随着生物体的体积变大，它们通过增加其组织的机械强度来进行
生物适应。不受理论的束缚，在愈合过程中存在的这些增加的机械力可能会通过以下机制促进瘢痕形成并阻止真正的再生(图3e)。增加的机械应力可能会触发整合素和fak的激活，这进而可促进αsma表达和随后的肌成纤维细胞分化。αsma稳定化可以促进跨核蛋白的表达，例如通过yap-taz通路，所述跨核蛋白易位进入细胞核以促进促纤维化信号的级联，这通过增加的力学转导信号传导以及col1a1和col3a1表达得到证实，导致旺盛的胶原蛋白沉积和纤维化瘢痕形成。然而，破坏力学转导可能抑制这些信号级联的发生并消除这些促纤维化的成纤维细胞亚群，同时还促进减少瘢痕组织的酶的表达，例如mmp1和mmp3。mmp(如mmp1)不仅会降解现有的瘢痕组织，还会降解损伤后构成急性伤口床的多种临时基质蛋白。此外，mmp还可促进细胞迁移到伤口，以及促进周围角质形成细胞的再上皮化，从而加速愈合。通过防止瘢痕形成和促进mmp表达，可诱导再生细胞亚群迁移到伤口中并促进皮肤再生。
[0049]
试剂盒。提供用于在大型哺乳动物中促进组织愈合同时减少纤维化的试剂盒。试剂盒可包括组合物，其中所述组合物包括fak抑制剂，所述组合物配置用于局部施用至大型哺乳动物的受伤组织。在一些实施方案中，组合物可以包括多孔支架，并且fak抑制剂布置在所述多孔支架的孔中。在一些变体中，多孔支架可以包括水凝胶。在一些变体中，多孔支架水凝胶可以是薄膜。在一些实施方案中，水凝胶可以是支链淀粉-胶原蛋白水凝胶。在一些变体中，试剂盒还可以包括配置为保护受伤组织的伤口敷料。实验
[0050]
释放faki的支链淀粉-胶原蛋白水凝胶的生产：释放faki的贴剂生产的所有实验室程序均按照ma等人，“粘着斑激酶抑制剂的受控递送导致伤口闭合加速及瘢痕形成减少(controlled delivery of a focal adhesion kinase inhibitor results in accelerated wound closure with decreased scar formation)”，皮肤病学研究杂志(j.invest dermatology)(2018)138,2452-2460中所描述的进行，其公开内容通过引用整体并入。faki(vs-6062)化合物获自verastem oncology(马萨诸塞州尼德姆(needham,ma))和selleckchem(德克萨斯州休斯顿(houston,tx))。最终形式的包装faki水凝胶贴剂由第三方公司(steri-tek,加利福尼亚州菲蒙市(fremont,ca))用电子束辐照灭菌，并保持在气密包装中直至使用。
[0051]
动物关怀：所有动物工作均按照斯坦福大学批准的实验动物护理行政委员会(administrative panel on laboratory animal care)(aplac#31530和32962)协议进行。从pork power farms(加利福尼亚州特洛克(turlock,ca))购买7只雌性红杜洛克猪，6-8周龄，手术时重大约16-20kg。所有动物在到达后适应至少一周。所有动物均喂食实验室猪饲饮食和自由饮水。
[0052]
猪深部厚度切除伤口模型：术前给动物口服阿莫西林(amoxicillin)10mg/kg，24小时。全身麻醉由兽医服务人员实施，并采用肌肉注射替拉唑(telazol)6-8mg/kg，作为前驱麻醉剂(pre-anesthetic)给药一次。然后，使用气管插管对动物进行插管，并在整个手术中保持吸入1.5-3％的异氟醚(isoflurane)。剪除背部的毛，并首先用溶液清洁皮肤，然后用70％酒精冲洗。使用标准电动zimmer皮刀(zimmer biomet，warsaw，in)创建切除伤口。在每个侧胁腹(lateral flank)上创建最多八个伤口，大约5cm x 5cm大小，伤口之间有3-5cm的间隔(图1a)。进行了多次皮刀戳刺(pass)，以创建均匀的0.07英寸深度的深部
厚度伤口。伤口随机分配接受faki水凝胶(w_hf)、空白水凝胶(“安慰剂”，w_h)或无水凝胶(伤口对照，w)(每种情况n＝6-9个伤口)。术后每天两次给动物口服阿莫西林10mg/kg，持续5天。伤口敷料(包括faki水凝胶贴剂)在最初受伤后的前三周内每隔一天更换一次，直到pod 21(图1c)。此后，每周两次更换敷料，直到pod 90。每次敷料更换时对动物进行短期镇静。在猪新鲜伤口(红杜洛克猪)上测试了递送至伤口的实际剂量。在一项时间依赖性研究中，24小时内在大约0.5mm伤口深度处检测到的vs-6062的量为30-100微克/g重量组织。超过1mm伤口深度检测到的vs-6062量小于5微克/g组织。
[0053]
伤口闭合、视觉瘢痕评估和粘弹性分析。在每次敷料更换时对伤口进行照相监测。基于总摄影评估确定每个伤口的伤口闭合天数，伤口闭合定义为完全再上皮化且没有开放伤口区域。由四名不知情的瘢痕专家组成的小组使用视觉模拟量表(vas)对5个组成部分(血管分布、色素沉着、观察者舒适度、可接受性和轮廓)进行瘢痕指标的量化。总分计算为所有5个分数的综合；较低的分数表示改善的瘢痕外观。皮肤弹性测定仪(dual mpa 580,courage khazaka electronic,德国科隆(germany))用于评估pod 60时愈合伤口的硬度和弹性。皮肤弹性测定仪通过小圆形直径(2mm探针)施加负压(吸力)来测量皮肤表面的垂直形变。皮肤弹性测定仪评估是测量人患者粘弹性的黄金标准。施加形变(吸力)两秒，然后松弛(无吸力)两秒，持续三个循环。在松弛期间测量弹性比(组织恢复到原始设定点的能力)(r2指标)。
[0054]
组织学和免疫荧光染色。在中间时间点和研究结束时从每个伤口的中心采集样本，如图4所示，4％多聚甲醛固定，脱水，然后石蜡包埋。进行马森三色染色(.masson’s trichrome staining)和天狼猩红染色(picrosirius red)。使用偏光显微镜(leica dm5000 b正置显微镜)捕获天狼猩红染色的图像。在leica sp5正置共焦多光子显微镜上使用20x物镜使用二次谐波产生(second harmonic generation，shg)对胶原纤维进行可视化。使用860nm的激发波长、大约100fs的脉冲长度和以445nm为中心、带宽为20nm的发射滤波器捕获shg图像。前向shg用于成像成纤维细胞，后向shg用于成像体内组织切片。使用定制软件matfiber对天狼猩红染色图像在40x放大率下进行纤维排列分析，matfiber是一种强度梯度检测算法，用于分析来自多个样品的胶原纤维和应力纤维的整体排列。平均矢量长度(mvl)表示排列的强度，范围从0(完全随机纤维排列)到1(完全排列的纤维)。计算纤维排列的整体强度。(参见chen,k.等人，“边界条件在确定响应拉伸的细胞排列中的作用(role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch)”,美国国家科学院院刊(pnas)115,986-991,doi:10.1073/pnas.1715059115(2018)，其全部公开内容在此通过引用整体并入)。使用ct-fire单根纤维提取的matlab源代码计算纤维总数的分析。使用靶向α-平滑肌肌动蛋白(αsma)、胶原蛋白i、胶原蛋白iii同时增加mmp1和mmp3的表达的一抗进行免疫荧光染色，购自abcam(加利福尼亚州伯林盖姆(burlingame,ca))或细胞信号技术(cell signaling technology)(马萨诸塞州丹威斯(danvers,ma))。使用定制的matlab图像处理代码量化荧光面积的百分比(参见chen,k.等人，“边界条件在确定响应拉伸的细胞排列中的作用(role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch)”,美国国家科学院院刊(pnas)115,986-991,doi:10.1073/pnas.1715059115(2018)，其全部公开内容在此通过引用整体并入)。显示的所有组织学和免疫荧光图像都是多个实验的代表性图像。
genomics；3.1版)功能mkfastq将碱基调用转换为读数，然后使用cell ranger的计数功能(star v2.7.0的功能)与grch38 v3.0.0(人)基因组进行比对，使用sc3pv3化学且每个样品5,000个预期细胞
42
。基于具有至少200个独特转录本、少于10,000个总转录本和少于10％的线粒体来源的转录组的阈值，从凋亡细胞或背景rna的条形码中描绘出代表优质细胞的细胞条形码。
[0058]
数据归一化和细胞亚群识别。保留每个细胞条形码的唯一分子标识符(umi)用于所有下游分析。原始umi计数使用每个细胞10,000个umi的比例因子进行归一化，随后使用r包(r package)seurat(3.1.1版)将自然对数转换为伪计数1。鉴定出高度可变的基因，并通过回归分析将细胞调节为线粒体转录物的比例。然后使用统一流形逼近与投影(uniformmanifold approximation and projection，umap)分析对前15个主成分评估聚合数据。使用single r工具包(3.11版)针对encode blue数据库进行细胞注释。
[0059]
特征亚群标志物的生成和富集分析。细胞类型标志物列表是使用seurat的自带findmarkers函数生成的，其中对数倍数变化阈值为0.25，使用roc检验为每个基因分配预测能力。使用enrichr(2.1版)以编程方式对每个聚类的该分析中排名最高的100个基因针对通路数据库进行基因集富集分析。
[0060]
在本文中，当特征或元件(element)称为“位于”另一个特征或元件“上”时，其可以直接位于另一个特征或元件上，或还可以存在中间特征和/或元件。相反地，当一个特征或元件称为“直接位于”另一个特征或元件“上”时，不存在中间特征或元件。还应理解，当一个特征或元件称为“连接”、“附接”或“耦合”到另一个特征或元件时，它可以直接连接、附接或耦合到另一个特征或元件，或可存在中间特征或元件。相反地，当一个特征或元件称为“直接连接”、“直接连接”或“直接耦合”到另一个特征或元件时，不存在中间特征或元件。尽管关于一个实施方案进行了描述或示出，但如此描述或示出的特征和元件可以应用于其他实施方案。本领域的技术人员还将理解，提及“相邻”另一特征设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于相邻特征之下的部分。
[0061]
本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明。例如，如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该/所述”(“a”,“an”and“the”)旨在也包括复数形式。将进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包含”和/或“包括”(comprises”and/or“comprising,”)指定了存在所述特征、步骤、操作、元件和/或组件，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合，并且可以缩写为“/”。
[0062]
可以使用诸如“在
……
之下”、“下方”、“低于”、“在
……
之上”、“上方”等空间相对术语，以便于描述一个元件或特征与另外的元件或特征的关系，如附图所示。应理解，空间相对术语旨在涵盖除了附图中描绘的方向之外的设备在使用或操作中的不同方向。例如，如果附图中的装置倒置，则描述为“在”其他元件或特征“之下”或“下方”的元件将定向为“在”所述其他元件或特征“之上”。因此，示例性术语“在
……
之下”可以包括上方和下方的方向。装置可以以其他方式定向(旋转90度或在其他方向)并且本文使用的空间相对描述语相应地进行解释。类似地，除非另有具体说明，否则本文中使用的术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等仅用于解释的目的。
[0063]
尽管本文中可以使用术语“第一”和“第二”来描述多个特征/元件(包括步骤)，但是除非上下文另有说明，否则这些特征/元件不应受这些术语的限制。这些术语可用于将一个特征/元件与另一特征/元件区分开来。因此，下文讨论的第一特征/元件可称为第二特征/元件，并且类似地，下文讨论的第二特征/元件可称为第一特征/元件，而不背离本发明的教导。
[0064]
在整个本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则措辞“包含”(“comprise”)以及“包括”和“含有”(“comprises”and“comprising”)等变体意指多个组件可以在方法和制品(例如，组合物，设备(包括装置)，以及方法)中共同使用。例如，术语“包含”将理解为隐含包括任何所述的元件或步骤，而不是排除任何其他元件或步骤。
[0065]
如本文在说明书和权利要求中使用的，包括在实施例中使用的，并且除非另有明确规定，否则所有数字都可理解为犹如以措辞“约”或“大约”开头，即使该术语没有明确出现。当描述幅度和/或位置时，可以使用短语“约”或“大约”，以指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可能具有以下值：规定值(或值范围)的 /-0.1％，规定值(或值范围)的 /-1％，规定值(或值范围)的 /-2％，规定值(或值范围)的 /-5％，规定值(或值范围)的 /-10％等。除非上下文另有说明，否则本文给出的任何数值也应理解为包括约或大约该值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。本文所述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。还应理解，当公开一个值“小于或等于”某值时，还公开了“大于或等于该值”以及值之间的可能范围，如本领域技术人员所适当理解的。例如，如果公开了值“x”，则还公开了“小于或等于x”以及“大于或等于x”(例如，其中x是数值)。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点任意组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点“15”，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及范围10至15。还应理解，还公开了两个具体单元(unit)之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
[0066]
尽管上文描述了多个说明性实施方案，但是可以对多个实施方案做出多种改变中的任何一种而不脱离如权利要求所描述的本发明的范围。例如，在替代实施方案中，执行所描述的各方法步骤的顺序通常可以改变，并且在其他替代实施方案中，可完全跳过一个或多个方法步骤。多种装置和系统实施方案的可选特征可以包括在一些实施方案中而不包括在其他实施方案中。因此，提供上述描述主要是为了示例性目的，不应解释为限制如权利要求所描述的本发明的范围。
[0067]
本文包括的实施例和说明通过说明而非限制的方式显示了可以实践本主题的特定实施方案。如所提及的，可以利用其他实施方案并从中衍生出实施方案，从而可进行结构和逻辑替换和改变，而不脱离本公开的范围。本发明主题的这些实施方案可以在本文中单独提及或通过术语“发明”共同提及，仅是为了方便而不旨在将本技术的范围自愿限制到任何一项发明或发明构思，如果实际上公开了多个发明或发明构思。因此，尽管本文已经示出和描述了具体实施方案，但是任何适于实现相同目的的布置都可以代替所示的具体实施方案。本公开旨在涵盖各种实施方案的任何和所有修改或变化。上述实施方案的组合以及本文未具体描述的其他实施方案对于本领域技术人员在阅读以上描述后将是显而易见的。