诱导性细胞外囊泡在制备延长哺乳动物寿命或治疗或预防衰老制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及诱导性细胞外囊泡在制备延长哺乳动物寿命或治疗或预防衰老制剂中的应用。


背景技术：

2.随着全球老龄化社会的到来，老年健康及老年性疾病的防治已成为国际社会面临的重要公共卫生问题。我国是世界上人口最多的国家，也是老年人口最多的国家。“老龄社会”是我国面临的严峻问题。为了解决老龄化社会所带来的困扰，抗衰老医学开始兴起。探索衰老机制。寻找抗衰老的新靶标与新疗法，成为生命科学的重大课题。
3.衰老是由外部刺激和内部过程引起的生理整体的终身恶化。机体衰老是细胞衰老的最终结果，同时衰老也是干细胞和机体细胞数量不足的表现。为了延缓衰老和维持身体内环境稳定，需要持续的组织更新和再生。
4.细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。目前该领域的研究主要集中在外泌体(exosomes) 方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，其内含有rna、脂质和蛋白质等成分。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。迄今为止，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。众多的研究发现mscs来源的外泌体能模拟mscs的生物学功能，在促进细胞生长和分化，修复组织缺损等方面发挥了重要的调控作用。因此，近年来以mscs来源的外泌体为基础的细胞囊泡疗法取得了显著的发展。然而，目前以外泌体为基础的细胞囊泡治疗仍然存在诸多问题，主要表现在外泌体的提取和纯化过程复杂，耗时长，对设备和试剂的要求较高，生理性外泌体产量较低等等，这些缺陷都限制了外泌体治疗的临床转化和应用。
5.目前尚未存在有效的细胞外囊泡用于制备延长哺乳动物寿命或治疗或预防衰老相关疾病的药物中的相关研究。


技术实现要素：

6.一方面，本技术提供了诱导性细胞外囊泡在制备延长哺乳动物寿命或治疗或预防衰老的制剂中的应用。
7.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡通过恢复受损细胞的增殖和/或分化实现延长哺乳动物寿命或治疗或预防衰老。
8.在一些实施方案中，述的制剂为治疗或预防老年肥胖的制剂。
9.在一些实施方案中，所述的制剂为治疗或预防衰老脱发的制剂。
10.在一些实施方案中，所述的制剂为治疗或预防脾脏肿大的制剂。
11.在一些实施方案中，所述的制剂为治疗或预防骨质疏松、骨丢失或骨衰老的制剂。
12.在一些实施方案中，所述的制剂选自药物制剂或保健品制剂。
13.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡用于减轻老年个体的体重。
14.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡用于减轻脱发。在本技术的一个实施例中，骨髓间充质干细胞来源的诱导性细胞外囊泡能显著改善24月龄小鼠的脱毛现象，相较于骨髓间充质干细胞自身，有更显著的效果。
15.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡用于减轻脾脏重量或体积。
16.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡用于增加骨密度。
17.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡用于增加骨体积分数。
18.一方面，本技术提供了诱导性细胞外囊泡在制备治疗或预防老年脱发的制剂方面的应用。
19.在一些实施方案中，所述的制剂选自药物制剂或保健品制剂。
20.一方面，本技术提供了诱导性细胞外囊泡在制备皮肤和/或皮肤附属器的抗衰老，和/或修复，和/或再生制剂方面的应用。
21.在一些实施方案中，所述皮肤为表皮、真皮、或皮下组织。
22.在一些实施方案中，所述皮肤附属器为毛、头发、汗腺、皮脂腺、指甲、或趾甲。
23.在一些实施方案中，所述的制剂为治疗或预防脱发的制剂、或促进毛发再生的制剂。
24.在一些实施方案中，所述的制剂为促进皮肤伤口或瘢痕的修复和/或再生的制剂。
25.在一些实施方案中，所述的制剂选自药物制剂或保健品制剂。
26.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡产生自干细胞，所述干细胞选自间充质干细胞或诱导性多能干细胞。
27.在一些实施方案中，所述间充质干细胞选自血液间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、尿液间充质干细胞、口腔间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨膜间充质干细胞、皮肤间充质干细胞中的一种或多种。
28.在一些实施方案中，所述的干细胞选自诱导性多能干细胞、血液间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、口腔间充质干细胞、皮肤间充质干细胞中的一种或多种。
29.在一些实施方案中，所述的干细胞选自诱导性多能干细胞、血液干细胞或骨髓间充质干细胞中的一种或多种。
30.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡是通过添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、或热应力法或其组合诱导间充质干细胞凋亡产生。
31.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡是通过添加星形孢菌素诱导间充质干细胞凋亡产生。
32.在一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为大于或等于1nm；优选地，为1-15000nm；优选地，为 200-10000nm；优选地，为250-1000nm；优选地，为500-1000nm。除此之外，星形孢菌素的浓度还可以是 280-9000nm；还可以是230-8500nm；还可以是500-1000nm；还可以是500-900nm；还可以是500-800nm。
33.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.45μm或以下。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.45μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.1-0.45μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.1-0.35μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.35μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.3μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.2μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.4μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.38μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.35μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.32μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.3 μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.25μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.22μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.22μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径还可以是0.15-0.45μm，还可以是0.2-0.3μm。
34.在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡具有标志物syntaxin 4。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡高表达标志物syntaxin 4。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡的标志物syntaxin 4的表达高于msc或外泌体。在一些实施方案中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的3-6倍。在一些实施方案中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的3.5-5倍。在一些实施方案中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的4.45倍。在一些实施方案中，所述标志物还包括annexin v、 flotillin-1、cadherin 11和integrin alpha 5中的一种或多种。在一些实施方案中，所述标志物为syntaxin 4、 annexin v、flotillin-1、cadherin 11和integrin alpha 5的组合。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡高表达标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量高于msc或外泌体。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。本发明中所述诱导性细胞外囊泡与外泌体有本质的不同，例如与外泌体相比，本发明所述的诱导性细胞外囊泡ievs高表达 syntaxin 4，以及其annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量明显高于外泌体(见实施例3)。除了标志物表达有差别之外，所述诱导性细胞外囊泡ievs在功能上或治疗效果上也呈现出有别于干细胞和其他的细胞外囊泡如外泌体的特性。例如ievs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于外泌体(见试验例2)。例如ievs治疗血友病小鼠的机制与ps和tf无关，而以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的ps和tf(见试验例2)。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡还表达cd29、cd44、
cd73、cd166；且不表达cd34、cd45。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡还表达cd9、cd63、cd81和c1q中的一个或多个。
35.在一些实施方案中，所述的制剂为注射剂、口服制剂或外用制剂。
36.在一些实施方案中，所述制剂为注射剂。
37.在一些实施方案中，所述制剂为静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂或鞘内注射剂。
38.在一些实施方案中，所述制剂还包括药学上可接受的药用载体。
39.在一些实施方案中，所述制剂载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
40.在一些实施方案中，还提供了所述的诱导性细胞外囊泡的制备方法，包括如下步骤：
41.1)体外培养间充质干细胞，细胞汇合80％-90％时，pbs冲洗2-5遍；
42.2)将步骤1)制得的间充质干细胞加入含有500-1000nm星形孢菌素的无血清培养基，37℃孵育16
-ꢀ
24h，收集细胞上清液；
43.3)将步骤2)收集的细胞上清液在4℃下500-15000g离心5-30分钟，收集上清液；
44.4)将步骤3)收集的细胞上清液在4℃下1500-2500g离心5-30分钟，收集上清液；
45.5)将步骤4)收集的细胞上清液在4℃下10000-30000g离心15-60分钟，所得沉淀物为细胞外囊泡；
46.优选地，还包括诱导性细胞外囊泡的清洗步骤；
47.优选地，所述清洗步骤具体为：6)将步骤5)制得的诱导性细胞外囊泡用pbs重悬，在4℃下10000
-ꢀ
30000g离心15-60分钟，所得沉淀物为诱导性细胞外囊泡。
48.在本发明中，所述“间充质干细胞”是指一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。所述间充质干细胞可以来源于骨髓、脂肪、血液(例如：外财血液)、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、口腔、颅颌面(例如：脱落乳牙、牙髓、牙周膜、牙龈、根尖牙乳头等)等组织以及羊水、脐带，即所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。
49.在本发明中，所述“哺乳动物”选自小鼠、大鼠、犬、猫、兔、猴或人类。
50.在本发明中，所述“预防”是指当用于疾病或病症时，与未给予药物的受试者相比，所述药物能降低受试者体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。
51.在本发明中，所述“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。
附图说明
52.图1为实施例1中流式细胞检测图。
53.图2为实施例2制备iev的技术路线图。
54.图3为用流式细胞分析技术分析的mscs(106个mscs)产生的ievs数量统计结果。
55.图4a-图4f为ievs颗粒的直径检测：图4a为流式检测ievs的颗粒直径分布图；图4b
为侧向散射光 (ssc)分析ievs的散射光强，显示ievs颗粒直径分布；图4c为以bangs laboratories公司生产的标准化小颗粒微球分析ievs的散射光强，显示ievs的颗粒直径分布；图4d为透射电镜(tem)观察的ievs，显示ievs的颗粒直径分布；图4e为纳米粒子跟踪分析(nta)，显示ievs颗粒直径分布；图4f为纳米流式检测技术对ievs进行单囊泡水平的粒径检测，显示ievs的颗粒直径分布。
56.图5a-图5k为流式细胞技术ievs的表面膜蛋白进行分析结果。
57.图6a-图6d为ievs的内容物分析：图6a为dia定量技术对mscs、mscs-exosomes、mscs-ievs蛋白组学定量分析结果；图6b为筛选ievs特异性高表达的蛋白绘制的热图；图6c为差异蛋白的go富集分析ievs表达annexin v，flotillin-1，cadherin 11，integrin alpha 5和syntaxin 4分子的结果；图6d为westernblot验证mscs、mscs-exosomes、mscs-ievs表达annexin v,flotillin-1，cadherin 11，integrin alpha 5和 syntaxin 4的结果。
58.图7为kaplan-meier生存曲线显示，ievs注射能显著延长小鼠寿命。
59.图8为bmmscs来源的ievs多次注射显著减轻了老年小鼠的体重，以及掉毛现象。
60.图9为bmmscs来源的ievs多次注射显著减轻了老年小鼠脾脏体积和重量。
61.图10a为bmmscs来源的ievs多次注射的不同处理组的microct图。
62.图10b为统计分析显示，mscs来源的ievs多次注射显著增加了老年小鼠的骨密度和骨体积分数。
63.图11a为不同处理的甲苯胺蓝染色、brdu染色的cfu-f和brdu统计分析结果。
64.图11b为茜素红染色显示的不同处理下的bmmsc形成矿化结节的能力，油红o染色显示msc中的脂肪细胞数。
65.图12a为实施例10中iev在皮肤表面的动态代谢示意图。
66.图12b显示随着时间推移，iev逐渐从皮下组织向真皮层和表皮移动。
67.图12c显示第7天时在小鼠体表拔下的毛发中发现毛囊中存在pkh26-iev。
68.图13a显示活体成像技术检测的第1，3，7天iev在小鼠全身的分布情况。
69.图13b显示活体成像技术检测iev在小鼠各脏器的分布情况。
70.图13c为第7天时iev在小鼠各器官中的分布与对照组的对比。
71.图13d为第1，3，7天iev在结肠中的动态代谢示意图；其中m表示粘膜肌层，v表示绒毛层。
72.图13e表示第3天时，iev在小鼠指甲和门齿中的代谢示意图。
73.图14a为实施例11中不同处理的小鼠在第0天，第10天，第14天的背部毛发再生情况示意图。
74.图14b为实施例11中不同处理的小鼠在第0天，第10天，第14天的背部毛发再生面积统计分析示意图。
75.图15显示实施例12中iev和msc处理对伤口愈合的促进作用。
76.图16为ievs治疗干燥综合症：a.ievs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响；b.ievs治疗干燥综合症下颌下腺he染色结果；c.治疗干燥综合症对b细胞的影响。
77.图17为ievs在血友病a小鼠的体内促凝作用。
78.图18a-图18d为给血友病a小鼠注射ievs之后各种凝血因子水平的变化情况：图
18a为凝血因子viii 的变化情况；图18b为vwf因子的变化情况；图18c为组织因子(tf)的变化情况；图18d为凝血酶原的变化情况。
79.图19a-图19b为血友病a小鼠模型中，ievs分别进行ps和tf的封闭之后对ievs的体内治疗效果的影响情况。
80.图20为同种mscs来源的ievs和exosomes对血友病a小鼠治疗效果对比。
81.注：所述附图中，wt为野生型小鼠；ha组为血友病a小鼠模型；ha ievs为血友病a小鼠模型给予 ievs治疗；ha ps-ievs为血友病a小鼠模型给予ps阴性ievs；ha tf-ievs为血友病a小鼠模型给予 tf阴性ievs；ha exosomes为血友病a小鼠模型给予exosomes治疗。
具体实施方式
82.以下通过具体的实施例进一步说明本技术的技术方案，具体实施例不代表对本技术保护范围的限制。其他人根据本技术理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本技术的保护范围。
83.本发明中的sts为星形孢菌素。
84.本技术实施例中的ievs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(inducedextracellular vesicles,ievs)。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞、尤其例如间充质干细胞)正常存活期间，被干预或诱导，使其凋亡产生的一类亚细胞产物。优选地，前体细胞是早期的前体细胞。通常这一类亚细胞产物，具有膜结构，表达凋亡性标志物，部分包含有遗传物质dna。发明人发现诱导性细胞外囊泡是区分于细胞和常规细胞外囊泡(如外泌体等)的一类物质。
85.正常细胞外囊泡(evs)指的是细胞在正常培养过程或在体内生理条件下自发分泌的纳米级大小的具有膜结构的小体，直径从40-1000nm不等，主要由微囊泡(microvesicles,mv)和外泌体(exosomes)组成，含有多种rna、蛋白质等信号分子。
[0086]“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本技术的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由
……
组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本技术的范围内。
[0087]
如本文所使用的术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合。当在两个或多个项目的列表中使用时，术语“和/或”表示所列出的项目中的任何一个可以单独使用，或者可以使用两个或多个所列出的项目的任何组合。例如，如果组合物，组合，构造等被描述为包括(或包含)组分 a，b，c和/或d，则该组合物可以单独包含a；单独包含b；单独包含c；单独包含d；包含a和b的组合；包含a和c的组合；包含a和d的组合；包含b和c的组合；包含b和d的组合；包含c和d的组合；包含a，b和c的组合；包含a，b和d组合；包含a，c和d的组合；包含b，c和d组合；或a， b，c和d组合使用。
[0088]
实施例1 bmmscs的分离培养
[0089]
依据动物伦理委员会的指导用过量co2处死小鼠，在无菌条件下，取下胫骨和股骨，剥净附着在其上的肌肉和结缔组织，进一步分离干骺端、暴露骨髓腔，用10ml无菌注射
器抽取喊体积分数为10％胎牛血清的 pbs反复冲洗骨髓腔，70μm孔径细胞滤网过滤后，500g离心5min，去除上清液后收集底部的细胞沉淀， pbs重悬，再次500g离心5min，收集最终的细胞沉淀。而后对细胞进行流式分选，以cd34-和cd90 为分选标准，分选出骨髓间充质干细胞(bmmscs)。最后以dex(-)培养液重悬细胞并接种于10cm直径细胞培养皿，37℃、5％co2培养。24h后，吸除上清液未贴壁细胞，pbs清洗后，加入dex(-)培养液继续培养。 1周后加入等量dex( )培养液，再1周后可见密集的原代bmmscs集落。采用胰蛋白酶37℃孵育消化 bmmscs并传代扩增，之后每3日换dex( )培养液，长满后传代。使用p2代bmmscs进行后续实验。
[0090]
其中，dex(-)培养液成分如表1所示，dex( )培养液成分如表2所示：
[0091]
表1 dex(-)培养液成分表
[0092][0093]
表2 dex( )培养液配方表
[0094][0095][0096]
采用流式细胞术分析表面标志物的方法来评估分离的bmmscs的纯度。对于表面标志鉴定，胰蛋白酶消化收集p2代bmmscs后，pbs清洗1次，以5
×
105/ml密度重悬细胞于含3％fbs的pbs中，加入1μlpe荧光偶联的cd29、cd44、cd90、cd45和cd34抗体，空白组不加。4℃避光孵育30min，pbs清洗2 遍后，上机检测。检测结果如图1所示。
[0097]
实施例2 bmmsc来源的iev的制备
[0098]
将实施例1中培养至第2代的mscs(骨髓来源的mscs)，用实施例1中的培养基(dex( )培养液)继续培养至细胞汇合80％-90％时，pbs冲洗2遍，加入含500nm sts的无血清培养基(所述培养基为在实施例1中的培养基中加入500nm sts)，37℃孵育16-24h，收集细胞上清液，4℃下800g离心10分钟，收取上清液4℃下2000g离心10分钟，再次收集上清液4℃下16000g离心30分钟，所得沉淀物为iev。500μl pbs 重悬沉淀，4℃下16000g再次离心30分钟，即得到清洗后的iev。
[0099]
制备路线如图2所示。
[0100]
对比例1同种msc来源的外泌体分离和提取
[0101]
将实施例1中培养至第2代的mscs(骨髓来源的mscs,bmmscs)，用实施例1中的培养基继续培养至细胞汇合80％-90％时，用pbs冲洗2遍，加入无血清培养基，37℃孵育48h，收集细胞上清液，用于分离和提取外泌体。
[0102]
提取步骤包括：800g离心10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心30 分钟—收集上清液—120000g离心90分钟—移除上清液，无菌pbs重悬沉淀—120000g再次离心90分钟，移除上清，收集底部的外泌体，无菌pbs重悬。
[0103]
实施例3 ievs的分析
[0104]
(1)ievs的定量和膜蛋白的分析
[0105]
利用流式细胞技术对实施例2获得的ievs进行定量分析，测量时间点为第1h、第4h、第8h、第16h 和第24h，结果显示106个mscs在诱导至第1h、第4h、第8h、第16h和第24h后分别可以产出0.76
×
108个、1.29
×
108个、1.95
×
108个、2.48
×
108个、3.14
×
108个ievs，从中可以看出，诱导至24h后，单个msc可以产出300个ievs(图3)。
[0106]
此外，流式检测发现ievs的颗粒直径分布都集中在1μm以下，占94.97％(图4a)。
[0107]
侧向散射光(ssc)分析结果同样显示ievs散射光强集中在1μm以下范围(图4b)。
[0108]
进一步的，通过bangs laboratories公司生产的标准化小颗粒微球(0.2μm，0.5μm，1μm)分析ievs 的散射光强，结果显示ievs的颗粒直径都在0.2μm以下(图4c)。
[0109]
透射电镜(tem)观察的结果与流式检测结果相似，大部分囊泡的直径都在200nm及200nm以下(图 4d)。
[0110]
纳米粒子跟踪分析(nta)结果与透射电镜观察结果相符，ievs颗粒直径平均为169nm(图4e)。
[0111]
利用最先进的纳米流式检测技术进行单囊泡水平的粒径检测，结果也显示ievs的平均颗粒直径在100.63 nm(图4f)。
[0112]
利用流式细胞技术对实施例3提取的ievs的表面膜蛋白进行分析，结果显示，mscs来源的ievs能够表达和mscs相似的表面蛋白，即cd29，cd44，cd73，cd166阳性，cd34，cd45阴性。同时，ievs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白cd9，cd63，cd81和c1q(如图5a-5k)。
[0113]
(2)ievs的内容物分析
[0114]
利用蛋白dia定量技术完成mscs，mscs-exosomes(对比例1提取的)，mscs-ievs(实施例2获得的)的蛋白组学定量分析。结果显示，mscs-exosomes和mscs-ievs的蛋白内容物表达与母细胞具有较高的重叠性，170种蛋白在ievs中特异性高表达(图6a)。通过生物信息学分析，筛选ievs特异性高表达的蛋白，绘制热图(图6b)，进一步结合差异蛋白的go富集分析结果，明确ievs能特异性高表达annexinv，flotillin-1，cadherin 11，integrin alpha 5和syntaxin 4分子(图6c)。与同种mscs来源的exosomes相比，ievs的5种特征性分子的表达量均显著上调，具体为：ievs中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4相对于外泌体中相应标记物的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68 倍和4.45倍。最后利用western blot技术再次进行验证，结果与dia定量分析结果相符(图6d)。
[0115]
mscs-exosomes：指的是来源于mscs的外泌体。
[0116]
mscs-ievs：指的是来源于mscs的ievs。
[0117]
其中所述的内容物分析中的mscs和与提取外泌体和ievs的mscs为同一细胞株。
[0118]
实施例4-9的一般实验方法
[0119]
1.实验材料
[0120]
将60只正常野生型c57小鼠分为3组，即对照组(control)，iev组，msc组，每组20只。
[0121]
iev为实施例2制备，msc为实施例1制备的bmmsc。
[0122]
2.实验方法
[0123]
从8月龄开始，三组小鼠分别尾静脉注射pbs、iev(实施例2制备)、msc(实施例1制备)，每月注射一次。其中，iev组每只小鼠以1
×
106个ievs重悬于200μl pbs，混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕；msc组小鼠每次注射等量细胞(1
×
106个mscs)；control组小鼠注射等体积溶剂(pbs,200ul/ 只)。
[0124]
实施例4 bmmscs来源的ievs多次注射显著延长小鼠寿命
[0125]
用上述一般实验方法准备各组小鼠。
[0126]
持续监测小鼠状态及死亡状况。并进行kaplan-meier生存分析。其中，使用对数秩检验分析对照组和各处理组的统计学差异，p值小于0.05被认为具有统计学差异。
[0127]
本实施例的结果显示，注射ievs和msc均可提高老年小鼠的存活率，进行kaplan-meier生存分析后表明，iev组和msc组与对照组相比，均显著延长了小鼠的寿命(图7)。
[0128]
实施例5 bmmscs来源的ievs多次注射显著减轻了老年小鼠的体重
[0129]
用上述一般实验方法准备各组小鼠。
[0130]
在24月龄的时候称取每组小鼠体重，进行统计分析。本实施例的结果表明iev注射和msc注射均显减轻了老年小鼠的体重(图8a)。
[0131]
实施例6 bmmscs来源的ievs多次注射显著减轻了老年小鼠脱毛现象
[0132]
用上述一般实验方法准备各组小鼠。
[0133]
在24月龄的时候小鼠拍照记录毛发状态，照片显示iev注射显著减轻了小鼠脱毛的现象(图8b)。与注射msc的处理组相比，注射iev的处理组的脱毛几乎完全恢复。注射msc组的脱毛并无明显改善。
[0134]
实施例7 bmmscs来源的ievs多次注射显著减轻了老年小鼠脾脏体积和重量
[0135]
用上述一般实验方法准备各组小鼠。
[0136]
在24月龄的时候每组随机取5只小鼠，处死后取小鼠脾脏，拍照称重。结果显示iev注射显著减轻了小鼠脾脏体积和重量(图9)。而注射msc的小鼠，其脾脏的体积和重量的减轻程度不如注射iev的处理组。
[0137]
实施例8 bmmscs来源的ievs多次注射显著增强老年小鼠骨密度
[0138]
用上述一般实验方法准备各组小鼠。
[0139]
在24月龄的时候每组随机取5只小鼠，处死后取小鼠股骨，使用microct分析bmd，bv/tv等骨矿物质密度、骨体积相关指标。
[0140]
microct分析：将小鼠股骨固定在4％的pfa中后，使用高分辨率scanco microct50扫描仪(scancomedical ag)分析股骨。使用20μm的体素尺寸在20kvp和200μa下扫描样本。使用amira 5.3.1软件 (visage imaging)分析数据集以重建图像并测量骨矿物质密度。
[0141]
结果显示iev和msc注射均能增强老年小鼠骨矿物质密度bmd和骨体积分数bv/tv(图10a、10b)。
[0142]
实施例9 bmmscs来源的ievs多次注射显著增强老年小鼠bmmsc的功能
[0143]
用上述一般实验方法准备各组小鼠。
[0144]
在24月龄的时候每组随机取5只小鼠，分离培养其bmmsc。
[0145]
bmmsc的分离：将来自股骨的骨髓衍生的所有核细胞(ancs,15
×
106)的单一悬浮液接种在100mm 培养皿(corning)中，并在37℃下用5％co2温育。24小时后，去除非粘附细胞，并在补充有20％胎牛血清 (fbs)，2mm l-谷氨酰胺的α最小必需培养基(α-mem,invitrogen)中培养贴壁细胞另外14天(invitrogen)， 55μm 2-巯基乙醇(invitrogen)，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(invitrogen)。这些粘附的单菌落在第 1代传代，频繁更换培养基以消除潜在的造血细胞污染。集落形成单位-成纤维细胞(cfu-f)的测定：将1
×
106单悬浮bmmscs接种在60mm培养皿(corning)中。16天后，用pbs洗涤培养物，并用含有2％多聚甲醛 (pfa,sigma-aldrich)的1％甲苯胺蓝溶液染色。在显微镜下计数细胞簇，将具有超过50个细胞的细胞簇视为菌落。
[0146]
细胞增殖试验：使用溴脱氧尿苷(brdu)掺入测定评估bmmsc的增殖。简单来说，将bmmsc以每孔1
×
104个细胞接种在12孔板上培养24小时，然后将培养物与brdu溶液(1:100)(invitrogen)一起温育 24小时，并根据制造商的说明用brdu染色试剂盒(invitrogen)染色。每个样本在10个图像中计数brdu阳性和总细胞数。brdu阳性细胞的数量表示为细胞总数的百分比。对于每个实验组，用五个独立样品重复brdu 测定。
[0147]
体外成骨分化：bmmsc在成骨诱导条件下培养，包括在生长培养基中的2m mβ-甘油磷酸盐(sigma
-ꢀ
aldrich)，100μml-抗坏血酸，2-磷酸(wako)和10nm地塞米松(sigma-aldrich)。诱导3周后，通过1％茜素红s(sigma-aldrich)染色检测基质矿化，并使用nih imagej软件定量染色的阳性面积，并显示为总面积的百分比。
[0148]
体外脂肪形成分化：对于脂肪形成诱导，500nm异丁基甲基黄嘌呤(sigma-aldrich)，60μm吲哚美辛 (sigma-aldrich)，500nm氢化可的松(sigma-aldrich)，10μg/ml用胰岛素(sigma-aldrich)和100nm l
-ꢀ
抗坏血酸磷酸盐。将其加入常规小鼠bmmsc生长培养基中。诱导7天后，将培养的细胞用油红o(sigma
-ꢀ
aldrich)染色，并在显微镜下定量阳性细胞，并显示为阳性细胞数与总细胞的百分比。
[0149]
结果显示，相对于6月龄小鼠而言，24月龄小鼠msc自我更新能力降低，包括克隆形成能力(cfu-f 集落形成单位成纤维细胞)，以及增殖能力(brdu溴脱氧尿苷)降低；成骨能力降低，成脂增多。这些都反映了msc能力受损，而注射iev的小鼠，其msc功能相对于未注射组而言有明显提升(图11a、11b)。
[0150]
实施例10 iev可经皮肤和毛发排出
[0151]
取4
×
106的实施例2制备的iev用dir标记，200微升pbs重悬，通过尾静脉系统性注射裸鼠balb/c
-ꢀ
nu/nu体内，观察1，3，7天后用活体成像仪器检测iev在皮肤表面的分布，结果如图12a-12c所示。
[0152]
图12a显示iev可到达皮肤表面，在第3天时数量最多，第7天基本消失，显示iev在皮肤表面的动态代谢过程(图12a)。免疫荧光结果显示pkh26-iev系统性注射c57小鼠后，随着时间推移，逐渐从皮下组织向真皮层和表皮移动。第7天在皮肤表面角质层观测到iev大量存在，提示系统性注射的iev可以随着皮肤角质层的脱落而排泄出去(图12b)。同时，第7天时在小鼠体表拔下的毛发中发现毛囊中存在pkh26
-ꢀ
iev，说明系统性注射的iev还可随
着毛发的脱落而代谢出去(图12c)。
[0153]
此外，活体成像数据和免疫荧光结果均显示iev在体内肝、脾、骨髓、淋巴等脏器大量分布，在心、肾、脑中无分布，但在结肠、牙齿和指甲中分布，进一步证明iev可随着代谢排出体外(图13a-图13e)。
[0154]
本实施例表明iev可以通过皮肤和毛发排出，说明注射或增加iev在体内的含量具有安全性。
[0155]
实施例11 iev能够促进毛发再生
[0156]
7周的雌性c57小鼠(毛发静止期)进行脱毛处理，分别皮下注射pbs、ievs、msc和2％米诺地尔 (minoxidil)。比较第10天和第14天小鼠背部的毛发再生面积，实验结果显示ievs和msc较对照组有明显的促毛发再生作用，与传统的防脱发药物米诺地尔相比，在第14天时，ievs和msc都具有更明显的促毛发再生效果(图14a-14b)。
[0157]
实施例12 ievs可促进伤口愈合
[0158]
在小鼠身上制作1cm
×
1cm的全皮层创口，检测系统性注射mscs和ievs对伤口愈合的促进作用。结果显示ievs和mscs均对伤口愈合有促进作用(图15)，无显著差异。
[0159]
综合实施例10、11、12，iev的代谢研究显示其通过皮肤和皮肤附属器排出，并且给这些组织带来了积极的效应。
[0160]
试验例1
[0161]
(1)检测步骤或方法：取8周龄舍格伦综合征(ss)模型小鼠，经尾静脉系统注射mscs和ievs，注射后4周取材，检测唾液流速，收集唾液腺样本行石蜡切片he染色和b细胞标志物b220染色。
[0162]
(2)结果：如图16a-图16c，结果显示，对比小鼠骨髓间充质干细胞及其来源的ievs治疗干燥综合症 (舍格伦综合征)唾液流率的影响，间充质干细胞治疗后唾液流率稍有恢复，ievs治疗后唾液流率未见改善 (*p《0.05相较于wt组，###p《0.001相较于mscs组)。ievs注射未改变唾液腺的炎症浸润和b细胞堆积情况。
[0163]
试验例2
[0164]
利用体外凝血实验检测实施例2获得的ievs和对比例1提取exosomes的体外促凝效果。结果如表3显示，ievs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于exosomes。
[0165]
但对于因子ii，v，x缺乏的血浆，ievs无法发挥体外促凝作用，说明ievs的体外促凝作用更多集中于凝血共同途径的上游。
[0166]
表3
[0167][0168]
利用血友病a小鼠(凝血因子viii缺乏)为模型，通过尾静脉注射9
×
108个ievs，观
察ievs的体内促凝作用。结果如图17显示，ievs治疗后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳定地维持14天。
[0169]
实验结果表明，ievs能够在体外发挥显著的促凝作用。且体内注射后能够显著改善出血倾向，可用于改善血友病a导致的出血倾向。同时检测小鼠血浆中各种凝血因子的水平，发现凝血因子viii、vwf因子、组织因子(tissue factor，tf)和凝血酶原(prothrombin)均没有发生显著变化(图18a，图18b，图18c，图18d)。
[0170]
在血友病a小鼠模型中，分别注射正常ievs，ps阴性ievs和tf阴性ievs，7天后进行剪尾实验，结果如图19a和图19b显示，ps和tf的封闭并没有影响ievs的体内治疗效果，初步说明ievs治疗血友病小鼠的机制与ps和tf无关。以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的ps和tf，而ievs的体内实验结果与以往研究不一致，这提示在体内环境下，ievs可能有新的作用机制发挥促凝作用。
[0171]
对血友病a小鼠模型，分别进行同种mscs来源的ievs(实施例2获得的)和exosomes(对比例1提取的)的注射治疗(9
×
108个)，结果显示，ievs能够显著纠正小鼠的出血倾向，而exosomes没有明显的治疗效果(图20)。
[0172]
鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅是本技术的优选示例，而不应视为限制本技术的范围。相反，本技术的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。