基于细胞分泌物筛选源细胞的方法、源细胞、细胞库及产品与流程

1.本发明属于生物医药与细胞治疗领域，具体涉及干细胞的筛选方法、干细胞及其产品。


背景技术：

2.干细胞作为具有自我更新和多向分化能力的多功能细胞，存在于人体或动物个体发育的各个阶段的组织器官中，是各种分化细胞或特化细胞的初始来源。研究发现，间充质干细胞除具有促进损伤组织再生修复作用外，对机体的免疫功能也具有很强的调控作用，主要通过影响免疫细胞增殖、分化和免疫因子分泌而抑制免疫反应。另外，炎性环境能够刺激间充质干细胞分泌大量炎性调控因子，抑制炎症细胞促炎因子的表达，从而削弱其引起的促炎级联反应。mscs主要分泌ido、pge2、tgf-β、hgf、no等旁分泌因子参与免疫功能调节。
3.传统的筛选方法难以针对具体的个体，筛选出个性化治疗的源细胞。因此，有必要设计更加科学的方法，针对个性化治疗筛选源细胞。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种源细胞的筛选方法、尤其筛选出的源细胞及制成的产品，可以解决现有技术中的上述缺陷。
5.本发明的技术方案如下：
6.基于细胞分泌物筛选源细胞的方法，将源细胞与免疫细胞共培养，其中，通过共培养后免疫细胞分泌物的分泌量筛选源细胞。具体的，所述源细胞为干细胞或免疫细胞，通过本方法筛选的源细胞，可以针对受者的实际情况选择对应的源细胞进行个性化治疗，相对于传统的方法，能够提高科学性、有效性。
7.在一些实施例中，所述细胞分泌物为：细胞因子、趋化因子、外泌体或mrna中的至少一种。
8.在一些实施例中，所述免疫细胞包括但不限于外周血单个核细胞、白细胞、淋巴细胞或t细胞。
9.在一些实施例中，筛选对免疫细胞分泌物产生促进或抑制效果的源细胞，或根据促进或抑制免疫细胞分泌物分泌量的不同筛选源细胞。因此可以筛选具有免疫促进效果的源细胞，用于治疗炎症相关的疾病，或者筛选具有免疫抑制效果的源细胞，以治疗自身免疫性疾病。
10.在一些实施例中，所述共培养的方式为源细胞与免疫细胞以直接接触的方式共培养，所述的直接接触共培养方式是指免疫细胞与源细胞在一个合适容器以直接接触的方法共培养一段时间。
11.在一些实施例中，所述共培养的方式为使用transwell共培养的方式。transwell共培养指的是：利用聚四氟乙烯(ptfe)膜等材料将pbmc与mscs进行分开，细胞无法直接接触，只能利用旁分泌方式分泌因子进行细胞间信息交流。
12.在一些实施例中，免疫细胞分泌物包括但不限于ifn-γ、tnf-α、il-17a、il-10、pge2、tgf-β、il-2或il-6中的一种，或多种的组合。
13.在一些实施例中，所述的方法包括：利用pbmc与间充质干细胞直接接触共培养的方式，筛选出促进免疫细胞分泌il-10的源性间充质干细胞。
14.在一些实施例中，筛选免疫细胞分泌物的分泌量为以下范围的源细胞：pbmc与mscs经过体外共培养后，ifn-γ抑制倍数大于8倍；或tnf-α抑制倍数大于18倍；或il-17a抑制倍数大于2倍；或il-10促进倍数大于0.5倍；或pge2促进倍数大于40倍；或tgf-β促进倍数大于6倍；或il-2抑制倍数大于10倍；或il-6促进倍数在40～80倍范围之间。
15.人体血液中高水平的炎症因子是许多自身免疫疾病的重要病理学基础。mscs可显著将降低血液中促炎因子(ifn-γ、tnf-α、il-17a、il-2)的含量，提升抑炎因子(il-10、pge2、tgf-β、il-6)的含量。体外共培养实验中，msc可抑制活化的pbmc产生促炎因子，促进调节性免疫细胞分泌抑炎因子，根据不同供者mscs调节活化的pbmc分泌促炎因子和抑炎因子能力的差异性不同，建立筛选标准。以提高干细胞治疗的科学性和有效性。
16.在一些实施例中，所述源细胞包括且不限于p0、p1、p2、p3
…
pn代种子细胞或主库细胞的源性细胞；培养容器包括且不限于96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、t25培养瓶。
17.在一些实施例中，培养时间不少于24小时；干细胞与免疫细胞共培养的比例为1∶1～400。
18.在一些实施例中，共培养时还包括加入免疫激活剂，正常人体外从全血中分离的pbmc需要免疫激活剂才能活化、增殖并产生免疫应答，通过添加免疫激活剂模拟人体内受到外界病源、细菌或者自体免疫过分活化状态，在此基础上，利用mscs对该种状态下过度活化的pbmc细胞抑制作用。
19.在一些实施例中，所述源细胞为：脐带干细胞、脐带血干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞、肌肉干细胞、沃顿胶干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、羊膜干细胞、绒毛膜干细胞、蜕膜干细胞或胎盘干细胞中的至少一种。
20.本发明还提供了一种采用如上任一所述筛选方法得到的源细胞。
21.本发明还提供了一种采用如上任一所述筛选方法得到的源细胞所构建的细胞库。
22.本发明还提供了一种采用如上任一所述筛选方法得到的源细胞或上述的源细胞制成的产品。如用于治疗疾病或病症的药用制剂，或者以美容为目的的化妆品。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
24.本发明所述的方法提供一种有效的筛选手段，基于免疫细胞与源细胞直接或间接共培养后，针对一种或多种基于细胞分泌物筛选调节能力强的源细胞，为细胞受体筛选出优质的源细胞，将治疗或科研的有效性提升至最大，节约成本，提高效率，富有广泛的应用前景。
25.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
26.图1是本发明实施例2中脐带间充质干细胞表面抗原检测示意图；
27.图2a是本发明实施例3中脐带间充质干细胞成脂示意图；
28.图2b是本发明实施例3中脐带间充质干细胞成骨示意图；
29.图2c是本发明实施例3中脐带间充质干细胞成软骨示意图；
30.图3a、3b、3c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-10分泌量；
31.图3d、3e、3f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-10分泌量促进倍数；
32.图4a、4b、4c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中pge2分泌量；
33.图4d、4e、4f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中pge2分泌量促进倍数；
34.图5a、5b、5c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中tgf-β分泌量；
35.图5d、5e、5f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中tgf-β分泌量促进倍数；
36.图6a、6b、6c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-6分泌量；
37.图6d、6e、6f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-6分泌量促进倍数；
38.图7a、7b、7c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中ifn-γ分泌量；
39.图7d、7e、7f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中ifn-γ分泌量抑制倍数；
40.图8a、8b、8c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中tnf-α分泌量；
41.图8d、8e、8f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中tnf-α分泌量抑制倍数；
42.图9a、9b、9c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-2分泌量；
43.图9d、9e、9f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-2分泌量抑制倍数；
44.图10a、10b、10c分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-17a分泌量；
45.图10d、10e、10f分别是本发明实施例5中不同供者mscs对donor a、donor b、donor c的pbmc中il-17a分泌量抑制倍数。
具体实施方式
46.本发明公开了一种源细胞的筛选方法，将源细胞与免疫细胞共培养，其中，通过共培养后对免疫细胞分泌因子能力筛选源细胞。
47.mscs主要分泌ido、pge2、tgf-β、hgf、no等旁分泌因子参与免疫功能调节。
48.mscs与pbmc在pha或cd3抗体、cd28抗体等激活剂刺激下，可以显示出明显的免疫调节功能，主要集中为三个方面，分别为：抑制pbmc增殖、改变th细胞亚群、改变抑炎、促炎因子的分泌量。mscs与pbmc共培养后，对促炎性因子：ifn-γ、tnf-α、il-17a、il-2可能产生抑制分泌量的作用，同时不同供者mscs抑制pbmc分泌量存在一定的差异性。对抑炎性因子：il-10、pge2、tgf-β可能产生促进分泌量的作用，同时不同供者mscs促进pbmc中各种抑炎因子分泌量存在一定的差异性。mscs与pbmc本身都分泌大量il-6因子，il-6即可作为促炎因子，也可作为抑炎因子，在分泌量过高的前提下，会产生细胞因子风暴。
49.通过对体外不同供者mscs与不同供者pbmc的共培养实验，检测相关促炎因子、抑炎因子的分泌量以及促进或抑制倍数，建立相应的数据库，筛选出免疫功能调节能力较强的供者mscs作为首选治疗药物，进而使免疫功能失调或障碍的患者获得更好的治疗效果，同时依此数据库数据作为基础或参考，制定理想的剂量回输。
50.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的免疫细胞的来源包括但不限于人、鼠、兔和猴。
51.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的分泌物筛选机制可以是一种或多种分泌物组合，根据分泌物的机制和特性筛选分泌多的或分泌物少的源细胞。
52.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的源细胞指种子细胞或者主细胞库中的细胞，包括且不限于各类干细胞。
53.根据本发明又一个示例性实施方案，所述细胞库为多种源细胞的集合，包括且不限于使用冻存管或冻存袋等储存于液氮的形式。
54.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的数据库多种源细胞各类数据统计的集合，其各种数据包括且不限于物理、化学和生物相关特性的数据，记录形式包括且不限于纸质的或电脑的方式。
55.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的有效性指包括且不限于用于治疗相关疾病的有效性或用于科研效果的有效性。
56.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的直接接触共培养方式是指免疫细胞与源细胞在一个合适容器以直接接触的方法共培养一段时间。
57.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的间接接触共培养方式包括但不限于使用transwell共培养的方式。
58.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的免疫细胞分泌物检测方式包括不限于免疫印迹、抗体免疫沉淀、elisa、质谱分析、rt-pcr、竞争性rt-pcr、实时rt-pcr、rna酶保护测定(rpa)、rna印迹或dna芯片。
59.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的方法包括：利用pbmc与间充质干细胞(mscs)直接接触共培养的方式，筛选出促进免疫细胞分泌il10能力高的源性间充质干细胞。
60.根据本发明又一个示例性实施方案，其中所述的方法包括：
61.(a)取p3代源性mscs接种至6孔板，培养过夜贴壁后弃上清，加入pbmc细胞和激活剂共培养72h，收集上清；
62.(b)利用elisa的方法检测对比pbmc组和mscs组中的il10的含量；
63.(c)记录数据至数据库，根据需求使用相应细胞库中源性mscs，以提高医疗或科研
有效性。
64.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的免疫细胞包括但不限于pbmc，淋巴细胞和t细胞。
65.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的免疫细胞分泌物包括但不限于ifn-γ、tnf-α、il-17a、il-12、il-10、ido、pge2、tgf-β、il-4、il-2或il-6。
66.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的间充质干细胞源包括而不限于：脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、沃顿胶、神经、皮肤、羊膜、绒毛膜、蜕膜和胎盘。
67.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的mscs与pbmc共培养的比例包括但不限于1∶1、1∶5、1∶10
…
1∶n。
68.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的il10检测方法包括且不限于免疫印迹、抗体免疫沉淀、elisa、质谱分析、rt-pcr、竞争性rt-pcr、实时rt-pcr、rna酶保护测定(rpa)、rna印迹或dna芯片。
69.根据本发明又一个示例性实施方案，所述的激活剂包括但不限于pha和cd3/cd28等有活化pbmc能力的物质。
70.按照公式：促进倍数＝pbmc pha msc组/pbmc pha组-1
71.抑制倍数＝pbmc pha组/pbmc pha msc组-1
72.pbmc pha mscs组：pbmc与mscs在pha刺激下共培养后elisa检测出的细胞分泌物的分泌量；
73.pbmc pha组：pbmc与mscs在pha刺激下共培养后elisa检测出的细胞分泌物的分泌量。
74.在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
75.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
76.实施例1：脐带间充质干细胞的获取
77.(1)在生物安全柜内，将脐带放置于10cm细胞培养皿中，第一遍用生理盐水润洗，第二遍用75％酒精润洗，第三遍再用生理盐水润洗，用手术剪剪成2cm左右的小段，用有齿镊将脐带小段外层的表皮剥净，撕开华通氏胶，先剔除2根动脉，再剔除1根静脉，用生理盐水洗净血液，再用手术刀将华通氏胶组织部分切成大约2-3mm大小的组织块。
78.(2)按64个组织块/t75培养瓶的规格将组织块均匀散布，将培养瓶放入37℃，5％co2培养箱烘干90min，达到放置时间，操作台内配制10％fbs完全培养基，缓慢添加15ml至t75培养瓶。
79.(3)原代分离7天后，更换新的10％fbs完全培养基，将培养液全部慢慢吸出，弃置，在t75培养瓶中加入15ml 10％fbs完全培养基，换液后的t75培养瓶放于37℃、5％co2培养箱进行培养，之后每2-5天观察一次，最后一次换液时，将培养基和组织块一并小心倒出；
80.(4)添加生理盐水洗涤后，加入4ml胰酶消化细胞，加入同胰酶等体积10％fbs完全
培养基，并轻轻吹打2次以上至细胞无团块，将细胞悬液用70μm筛网过滤至50ml离心管，1800rpm、5min离心，弃上清，添加40ml 10％fbs培养液进行接种，继续培养。
81.(5)细胞长满后，消化，按照2
×
106个/ml密度进行细胞冻存。
82.实施例2：脐带间充质干细胞表面标志物检测
83.从实施例1的冻存细胞库内取出13个样本脐带间充质干细胞，放入37℃水浴锅进行快速复融后添加10ml预热d-pbs进行洗涤；进行细胞计数后按照1.75
×
105个/ml密度接种至t175培养瓶，添加40ml10％fbs完全培养液进行培养；细胞长满后，进行消化后取3
×
106个细胞进行mscs表面标志物检测，检测指标包括：cd14、cd19、cd31、cd34、cd45、cd73、cd90、cd105、hla-dr，结果如图1所示。
84.通过对所有样本表面抗原分析，结果显示出所有样本满足细胞干性表达的需求，即满足cd73、cd90、cd105全阳性标准，cd14、cd19、cd31、cd34、cd45、hla-dr全阴性标准。
85.实施例3：脐带间充质干细胞成脂、成骨、成软骨三系分化检测
86.(1)取实施例2中细胞进行接种，接种至六孔板内，接种密度为8
×
104个/ml，接种体积为3ml，培养2天后吸弃原培养液，按照3ml/孔添加人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基；2-3天更换人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基，培养至20天左右；成脂诱导分化结束后，吸弃六孔板中的间质干细胞成脂诱导分化培养基，用pbs冲洗1-2次，每孔添加2ml 4％中性甲醛溶液，固定30min，吸弃中性甲醛溶液，用pbs冲洗2次；每孔中加入1ml油红o染料工作液，染色30min，吸弃油红o染液，用60％异丙醇冲洗2次，用pbs冲洗1次，每孔添加1ml pbs；结果如图2a所示。
87.(2)取实施例2中细胞进行接种，接种至六孔板内，接种密度为4
×
104个/ml，接种体积为3ml，培养2天后吸弃原培养液，按照3ml/孔添加人脐带间质干细胞成骨诱导分化培养基；2-3天更换人脐带间质干细胞成骨诱导分化培养基，培养至20天左右；成骨诱导分化结束后，吸弃六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用pbs冲洗1-2次，每孔加入2ml 4％中性甲醛溶液，固定30min，吸弃中性甲醛溶液，用pbs冲洗2次，每孔中加入1ml茜素红染液，染色3-5min，吸弃茜素红染液，用pbs冲洗2-3次，每孔添加1ml pbs；结果如图2b所示。
88.(3)取实施例2中13个样本mscs，取5
×
105细胞转移到15ml离心管中，1000rpm，5min离心，弃上清，加入0.5m1人脐带间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基，重悬细胞，室温下1000rpm，5min离心，弃上清，用0.5m1人脐带间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞，室温下1000rpm，5min离心，拧松离心管管盖，以便于气体交换，将其放置于37℃，5％co2的培养箱中培养；(此步骤不需要吸掉上清并重悬细胞，且24h之内不要摇动离心管)；当细胞团出现聚拢现象时(一般为24h或48h后，实际视细胞生长情况而定)，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中；自接种开始计算，每隔1-2天更换成软骨诱导分化培养液，14天之后，对软骨球进行固定、包埋、切片、抗体染色；采用he染色法进行成软骨能力检测，具体结果如图2c所示。
89.通过对13个源细胞样本进行成脂、成骨、成软骨三系分化检测，所有样本均具有三系分化的潜能，鉴定为脐带间充质干细胞，所有样本初步满足入库标准，在此基础上进行pbmc与mscs体外共培养实验，进一步筛选干细胞。
90.实施例4：pbmc细胞制备
91.取3个志愿者(donor a、donor b、donor c)全血进行pbmc分离，先离心(1000rpm，
10min)去除血浆，添加等比例的生理盐水，混匀；将血液稀释液添加至预先添加的ficoll液中，离心(2000rpm，20min)后吸取白膜层细胞；将细胞用生理盐水洗涤两遍，离心(1500rpm，6min)后进行细胞活率检测，检测结果显示活率超过95％，并按照1
×
107/ml进行细胞冻存。
92.实施例5：mscs对pbmc在活化状态下对促炎因子、抑炎因子的影响
93.取实施例2中13个供者脐带间充质干细胞进行接种，接种至六孔板内，接种密度为8
×
104个/ml，接种体积为3ml；贴壁24小时后，吸弃上清液，更换新的10％fbs完全培养液，培养24小时后收集上清液；pbmc复苏后接种至含有贴壁mscs的六孔板内，接种密度为8
×
105个/ml，接种体积为3ml；设置一组不添加mscs的单独pbmc组作为阳性对照。
94.按照20ng/ml添加pha激活剂，设置pha激活剂的pbmc组、pbmc与mscs共培养组，添加后放入37℃培养箱进行细胞培养；培养3天后，每组样本吸取上清液，离心(1500rpm，6min)进行分装，-80℃保存。
95.(1)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下il-10因子分泌量。
96.不同供者mscs对pbmc免疫调控中促进抑炎因子il-10的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图3a、3b、3c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs促进pbmc分泌il-10的促进倍数，结果如图3d、3e、3f所示，鉴于此数据，筛选出促进倍数大于0.5倍的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
97.(2)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下pge2因子分泌量；
98.不同供者mscs对pbmc免疫调控中促进抑炎因子pge2的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图4a、4b、4c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs促进pbmc分泌pge2的促进倍数，结果如图4d、4e、4f所示，鉴于此数据，筛选出促进倍数大于40倍的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
99.(3)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下tgf-β因子分泌量；
100.不同供者mscs对pbmc免疫调控中促进抑炎因子tgf-β的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图5a、5b、5c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs促进pbmc分泌tgf-β的促进倍数，结果如图5d、5e、5f所示，鉴于此数据，筛选出促进倍数大于6倍的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
101.(4)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下il-6因子分泌量；
102.不同供者mscs对pbmc免疫调控中促进抑炎因子il-6的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图6a、6b、6c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs促进pbmc分泌il-6的促进倍数，结果如图6d、6e、6f所示，鉴于此数据，筛选出促进倍数在40～80倍范围之间的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
103.(5)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下ifn-γ因子分泌量；
104.不同供者mscs对pbmc免疫调控中抑制促炎因子ifn-γ的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图7a、7b、7c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs对pbmc分泌ifn-γ的抑制倍数，结果如图7d、7e、7f所示，鉴于此数据，筛选出抑制倍数大于8倍的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
105.(6)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下tnf-α因子分泌量；
106.不同供者mscs对pbmc免疫调控中抑制促炎因子tnf-α的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图8a、8b、8c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs对pbmc分泌tnf-α的抑制倍数，结果如图8d、8e、8f所示，鉴于此数据，筛选出抑制倍数大于18倍的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
107.(7)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下il-2因子分泌量；
108.不同供者mscs对pbmc免疫调控中抑制促炎因子il-2的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图9a、9b、9c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs对pbmc分泌il-2的抑制倍数，结果如图9d、9e、9f所示，鉴于此数据，筛选出抑制倍数大于10倍的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
109.(8)elisa法检测pbmc与mscs在激活剂共培养体系下il-17a因子分泌量；
110.不同供者mscs对pbmc免疫调控中抑制促炎因子il-17a的分泌，且分泌量产生不同的差异性，结果如图10a、10b、10c所示。根据pbmc组、pbmc与mscs共培养组分泌量计算出mscs对pbmc分泌il-17a的抑制倍数，结果如图10d、10e、10f所示，鉴于此数据，筛选出抑制倍数大于2倍的供者mscs，建立相应的子细胞库，对mscs供者进行筛选用于后期的免疫修复、调控、治疗。图中a、d指pbmc供者为donor a，图中b、e指pbmc供者为donor b，图中c、f指pbmc供者为donor c。
111.以上公开的仅为本发明优选实施例，优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围，本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
112.本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属领域技术人员能很好地利用本发明。在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。