一种4-二甲氨基吡啶的检测方法与流程

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种基因毒杂质的检测方法,具体涉及的是一种4-二甲氨基吡啶的检测方法。


背景技术：

2.磷酸西格列汀是一种高选择性的dpp-iv抑制剂的口服降糖药物，临床用于2型糖尿病患者的治疗，可有效调节血糖和血脂水平，改善胰岛功能，具有不良反应少和安全性高等优点。在磷酸西格列汀合成工艺中用到了4-二甲氨基吡啶，具体结构如下：
[0003][0004]
其含有警示结构芳香杂环，属于潜在基因毒性杂质。
[0005]
基因毒性杂质在微量的水平下能诱导dna发生突变，具有潜在的致癌性，威胁人类的健康，已被广泛关注及严控。因此有必要建立一种磷酸西格列汀中4-二甲氨基吡啶的检测方法。根据欧洲ema、美国fda、ich m7和中华人民共和国药典(四部)关于基因毒性杂质的指导原则等要求，基因毒性杂质的毒理学关注阈值(ttc)为1.5ug/天。磷酸西格列汀制剂一般日最大使用剂量为128.5mg，所以磷酸西格列汀中4-二甲氨基吡啶的限度为11ppm，限度较低，液相色谱方法达不到灵敏度要求。针对如何检测西格列汀中的4-二甲氨基吡啶目前无相关文献报道。
[0006]
因此，找到一种灵敏度高、专属性好的检测该基因毒杂质的方法，实现对西格列汀中该杂质的有效控制，从而在一定程度上保证西格列汀的质量和患者用药的安全性，具有重要研究意义。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种西格列汀中基因毒杂质4-二甲氨基吡啶的检测方法，从而实现对西格列汀中该基因毒杂质的有效控制，以减少患者用药副反应的发生，保证用药安全性。
[0008]
本发明提供一种高效液相色谱—质谱联用的方法，用于磷酸西格列汀中基因毒性杂质4-二甲氨基吡啶的检测。
[0009]
在一些实施方案中所述高效液相色谱的流动相为乙酸盐缓冲液-乙腈，在一些典型的实施方案中乙酸盐缓冲液与乙腈的体积比为10:88-92，在一些更为典型的实施方案中乙酸盐缓冲液与乙腈的体积比为10：90。
[0010]
在一些实施方案中，所述乙酸盐缓冲液为乙酸铵和乙酸的缓冲液，在一些实施方案中乙酸铵缓冲液的浓度为10mmol/l。
[0011]
在一些实施方案中，所述乙酸盐缓冲液的ph为3.0-5.0；在一些更为典型的实施方
案中，所述乙酸盐缓冲液的ph为4.0。
[0012]
在一些实施方案中，所述高效液相色谱的色谱柱采用亚乙基桥杂化颗粒为填料，在一些更为典型的实施方案中，所述色谱柱为waters acquity beh hilic色谱柱。
[0013]
在一些实施方案中，所述高效液相色谱的流动相的流速为0.25-0.35ml/min；在一些典型的实施方案中，所述流动相的流速为0.28ml/min、0.30ml/min或0.32ml/min，在一些更为典型的实施方案中，所述流动相的流速为0.30ml/min。
[0014]
在一些实施方案中，所述高效液相色谱的柱温为25-35℃；在一些典型的实施方案中，所述柱温为25℃、30℃或35℃；在一些更为典型的实施方案中，所述柱温为30℃。
[0015]
在一些实施方案中，所述质谱采用电喷雾离子源，多重离子反应正离子检测模式。
[0016]
在一些实施方案中，所述质谱的离子源参数干燥气温度300℃；干燥气流速6l/min；鞘气温度325℃；鞘气流速11l/min；雾化器压力45psi；喷嘴电压500v；毛细管电压3500v。
[0017]
在一些实施方案中，所述质谱的4-二甲氨基吡啶离子对及相关参数详见下表：
[0018][0019]
进一步的，本发明提供一种4-二甲氨基吡啶的检测方法，其特征在于：
[0020]
采用高效液相—质谱联用法；
[0021]
其中，高效液相的相关条件如下：
[0022]
色谱柱：waters acquity beh hilic；
[0023]
流速：0.30ml/min；
[0024]
流动相：乙酸盐缓冲溶液-乙腈，所述乙酸盐缓冲溶液-乙腈的体积比为10：90，所述乙酸铵缓冲液的浓度为10mmol/l，ph为4.0；
[0025]
质谱的相关条件如下：
[0026]
采用电喷雾离子源，多重离子反应正离子检测模式；
[0027]
离子源参数：干燥气温度300℃；干燥气流速6l/min；鞘气温度325℃；鞘气流速11l/min；雾化器压力45psi；喷嘴电压500v；毛细管电压3500v。
[0028]
在一些特定的实施方案中，本发明提供一种一种4-二甲氨基吡啶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0029]
(1)供试品溶液配制：取磷酸西格列汀约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，用体积比为90:10的乙腈-水的溶剂，溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得；
[0030]
(2)对照品溶液配制：取4-二甲氨基吡啶对照品适量，用体积比为90:10的乙腈-水的溶剂制成每1ml含5.5ng的4-二甲氨基吡啶的溶液，作为对照品溶液；
[0031]
(3)空白溶剂配制：体积比为90：10的乙腈-水的溶剂。
[0032]
(4)供试品测定：分别精密量取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各1μl，按照如下色谱条件和质谱条件进行试验：
[0033]
高效液相的相关条件如下：
[0034]
色谱柱：waters acquity beh hilic；
[0035]
流速：0.30ml/min；
[0036]
流动相：乙酸盐缓冲溶液-乙腈，所述乙酸盐缓冲溶液-乙腈的体积比为10：90，所述乙酸铵缓冲液的浓度为10mmol/l，ph为4.0；
[0037]
等梯度洗脱；
[0038]
质谱的相关条件如下：
[0039]
采用电喷雾离子源，多重离子反应正离子检测模式；
[0040]
离子源参数：干燥气温度300℃；干燥气流速6l/min；鞘气温度325℃；鞘气流速11l/min；雾化器压力45psi；喷嘴电压500v；毛细管电压3500v。
[0041]
本方法专属性强、灵敏度高、准确度好，可用于磷酸西格列汀原料药中4-二甲氨基吡啶的测定，在西格列汀的生产及质量控制方面具有重要的现实意义。
[0042]
说明书附图
[0043]
图1实施例1的空白溶剂色谱图；
[0044]
图2实施例1对照品溶液的色谱图；
[0045]
图3实施例1供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
[0046]
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0047]
仪器
[0048]
1290超高效液相色谱仪(安捷伦)；6470三重四级杆质谱仪(安捷伦)；me36s电子分析天平(赛多利斯)；msu225p电子分析天平(赛多利斯)；xse205du电子分析天平(梅特勒)。
[0049]
试验药品
[0050]
乙酸铵(lc/ms级别，cnw)，乙酸(lc/ms级别，cnw)，乙腈(hplc级，merck)；4-二甲氨基吡啶对照品(批号：43594，纯度：99％，阿拉丁)；磷酸西格列汀原料药(批号：157200501、157200502、157200503、105200401)(南京正大天晴制药有限公司)。
[0051]
实施例1供试品溶液的专属性试验
[0052]
液相色谱条件
[0053]
液相色谱柱waters acquity beh hilic(50
×
2.1mm，1.7μm)；流动相：乙酸盐缓冲溶液(10mmol/l甲酸铵溶液，乙酸调ph 4.0)：乙腈(10:90)；分析时间：8min；流速0.3ml/min；柱温：30℃；进样体积：1μl。六通阀切换设置：2min设置进入质谱系统。
[0054]
质谱条件
[0055]
电喷雾离子源(esi)；采用多重离子反应检测(mrm)模式，正离子模式检测；4-二甲氨基吡啶离子对及相关参数见表1。离子源参数：干燥气温度300℃；干燥气流速6l/min；鞘气温度325℃；鞘气流速11l/min；雾化器压力45psi；喷嘴电压500v；毛细管电压3500v。
[0056][0057]
*
表示定量离子
[0058]
溶液的制备
[0059]
对照品贮备液
[0060]
取4-二甲氨基吡啶对照品适量，精密称定，置量瓶中，用溶剂[乙腈-水(90:10)]溶解并定量稀释制成每1ml约含110ng的溶液，作为对照品贮备液。
[0061]
对照品溶液
[0062]
精密量取对照品贮备液适量，用溶剂[乙腈-水(90:10)]定量稀释制成每1ml约含5.5ng的溶液，作为对照品溶液。
[0063]
供试品溶液
[0064]
取磷酸西格列汀约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，用溶剂[乙腈-水(90:10)]溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
[0065]
空白溶剂：体积比为90：10的乙腈-水的溶剂。
[0066]
分别精密量取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液(批号：105200401)各1μl，按照上述色谱条件和质谱条件进行试验，记录色谱图，试验结果见图1、图2、图3。溶剂和供试品溶液均不干扰4-二甲氨基吡啶的测定，表明本方法的专属性良好。
[0067]
实施例2线性关系试验
[0068]
精密量实施例1中的对照品贮备液适量，分别用溶剂[乙腈-水(90:10)]溶解并定量稀释制成每1ml约含0.55、2.75、4.4、5.5、8.25、11.0ng(10％-200％限度浓度)的系列浓度的线性溶液，取各浓度的线性溶液，按实施例1公开的相关方法检测，以4-二甲氨基吡啶的浓度为横坐标(x)，以4-二甲氨基吡啶的峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归。回归方程为：y＝16909.6915x 3948.9297，r＝0.9993
[0069]
结果表明，4-二甲氨基吡啶在浓度0.55ng/ml～10.98ng/ml浓度范围内，线性关系良好。
[0070]
实施例3定量限与检测限试验
[0071]
取实施例1项对照品贮备液适量，用溶剂[乙腈-水(90:10)]逐步稀释，分别稀释至信噪比s/n≥10为定量限溶液；至信噪比s/n≥3为检测限溶液。结果在实施例1的检测方法该下4-二甲氨基吡啶的定量限浓度为0.02ng/ml(相当于供试品浓度的百分比0.04ppm)；平行测定6次峰面积rsd为4.2％(n＝6)检测限浓度为0.005ng/ml(相当于供试品浓度的百分比.0.01ppm)，结果表明，定量限浓度明显低于限度浓度(11ppm)，方法灵敏度较好，符合检测要求。
[0072]
实施例4准确度试验
[0073]
取磷酸西格列汀样品(批号：105200401)10mg，精密称定9份，置20ml量瓶中，用溶剂溶剂[乙腈-水(90:10)]溶解，精密加入实施例1中的对照品贮备液各0.50ml、1.00ml和1.50ml，分别用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为50％回收率溶液、100％回收率溶液和150％回收率溶液；每个浓度水平平行配制3份。按实施例1的方法条件检测，结果表明，4-二甲氨基吡啶回收率在88.80％～92.60％，rsd为1.3％(n＝9)，表明该方法的准确度良好。见表1。
[0074]
表1准确度试验
[0075]
[0076][0077]
实施例5重复性试验
[0078]
取磷酸西格列汀样品(批号：105200401)10mg，精密称定6份，置20ml量瓶中，用溶剂溶剂[乙腈-水(90:10)]溶解，分别精密加入实施例1下对照品贮备液1.00ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为重复性溶液。依实施例1的方法测定，结果4-二甲氨基吡啶含量的rsd为1.7％(n＝6)，表明该方法重复性良好。
[0079]
实施例6样品检测
[0080]
取4批样品(批号：157200501、157200502、157200503、105200401)，按实施例1公开的方法条件进样测定，采用外标法以峰面积进行计算，得到4-二甲氨基吡啶的检出量分别为0.04ppm、0.11ppm、0.07ppm和0.06ppm。
[0081]
实施例7色谱条件变化
[0082]
按照实施例1的方法，仅将流动相进行变更，流动相为0.1％甲酸—乙腈(体积比为10：90)，其它检测条件与实施例1一致，结果显示：4-二甲氨基吡啶的保留时间为1.428min，出峰时间较早，需要更换流动相。