一种木霉菌、干悬浮杀菌剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及微生物农药制备加工技术领域，尤其涉及一种木霉菌、干悬浮杀菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.木霉(trichoderma spp.)属于半知菌类的丝孢纲，丝孢目，丛梗孢料，为世界性分布。广泛分布于土壤、腐烂的木材及植物残体等基质中。木霉在植物病害生物防治和环境保护方面具有广阔的应用前景，已经证明木霉菌对白绢病、疫霉病、水稻纹枯病等多种土传病害有较好的防治能力，其中康宁木霉(trichoderma koningii)、棘孢木霉(trichoderma viride)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)已在防治中得到广泛应用。很多研究表明木霉菌在土壤中分布广泛，该真菌可寄生多种植物病原真菌的菌丝和菌核，同时还具有促进植物生长的作用。
3.长枝木霉菌可寄生核盘菌属(sclerotinia)、腐霉菌(pythium.spp.)、立枯丝核菌(rhizoctonia.solani)和齐整小核菌(sclerotium rolfsii)等多种植物病原菌。木霉菌对植物病原菌具有产生抗菌素及毒素、重寄生、产生细胞壁降解酶以及协同作用等多重作用机制，可以有效抑制植物真菌病害的的发生。国外已有商品化木霉菌颗粒剂的报道，并将不同菌株制成生物制剂，用于防治豌豆、大豆、向日葵、油菜、莴苣等菌核病及其它多种温室和大田作物土传病害。
4.干悬浮剂，是20世纪80年代国际上开始研发的农药新剂型和新制剂加工技术。该剂型具有入水迅速崩解分散成高悬浮的固液分散体系的颗粒状剂型，不含有机溶剂，悬浮稳定性好、悬浮率高，无粉尘，包装、运输、使用方便。干悬浮剂被认为既具有粒剂的优点，又具有悬浮剂高分散性能的理想农药剂型，已成为新剂型开发的热点。
5.由于木霉菌菌株对助剂的生物相容性较差，其干悬浮制剂至今未见登记注册销售，更没有田间大量应用，所有有必要提供一种木霉菌干悬浮制剂。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提出了一种木霉菌、干悬浮杀菌剂及其制备方法，以解决或至少部分解决现有技术中存在的技术问题。
7.第一方面，本发明提供了一种木霉菌，所述木霉菌的分类命名为：长枝木霉(trichoderma longibrachiatum nbbrc-vwt5)，所述木霉菌的保藏编号为cctcc no：m 2022942。
8.第二方面，本发明还提供了一种干悬浮杀菌剂，包括木霉菌分生孢子粉，所述木霉菌分生孢子粉的制备方法为：将所述的木霉菌经过活化培养至产生孢，即得木霉菌分生孢子粉。
9.优选的是，所述的干悬浮杀菌剂，还包括润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂以及载体。
10.优选的是，所述的干悬浮杀菌剂，按照质量分数计，所述干悬浮杀菌剂包括：5～30％的木霉菌分生孢子粉、8～20％的润湿分散剂、0.1～1％的紫外保护剂、2～20％的崩解剂、1.0～10％的粘结剂、24～83.9％的载体。
11.优选的是，所述的干悬浮杀菌剂，所述紫外保护剂包括糊精、黄原胶、荧光素钠、维生素c、纳米氧化锌中的至少一种；
12.和/或，所述崩解剂包括交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、尿素、硫酸铵、淀粉中的至少一种；
13.和/或，所述粘结剂包括cmc、木质素磺酸钠、peg、草酸、糊精中的至少一种；
14.和/或，所述载体包括凹凸棒土、高岭土、硅藻土、膨润土、白炭黑中的至少一种；
15.和/或，所述润湿分散剂包括morwet efw、k12、mf-5、terwet1010、wlno、木质素磺酸钙、tersperse2700、tersperse 2020、morwet d425、nno、t36中的至少一种。
16.优选的是，所述的干悬浮杀菌剂，按照质量分数计，所述干悬浮杀菌剂包括：5％的木霉菌分生孢子粉、12％的morwet efw与木质素磺酸钙混合而成的润湿分散剂、3％的交联聚乙烯吡咯烷酮、0.2％的纳米氧化锌、4％的peg、75.8％的白炭黑。
17.优选的是，所述的干悬浮杀菌剂，按照质量分数计，所述干悬浮杀菌剂包括：20％的木霉菌分生孢子粉、15％的terwet1010和tersperse 2700混合而成的润湿分散剂、4％的交联聚维酮、0.3％的维生素c、5％的木质素磺酸钠、55.7％的硅藻土。
18.优选的是，所述的干悬浮杀菌剂，所述木霉菌分生孢子粉的含孢量≥1
×
10
10
个/g、质量含水量为1.8～2.5％。
19.第三方面，本发明还提供了一种所述的干悬浮杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
20.将润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂以及载体混合后，加入水，然后研磨；
21.将木霉菌分生孢子粉加入至研磨后的物料中混合，喷雾造粒，即得干悬浮杀菌剂。
22.优选的是，所述的干悬浮杀菌剂的制备方法，将润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂以及载体混合后，加入水，然后研磨至粒径为18～22μm；
23.将木霉菌分生孢子粉加入至研磨后的物料中以8000～15000r/min搅拌混合20～60min，喷雾造粒，即得干悬浮杀菌剂。
24.本发明木霉菌、干悬浮杀菌剂及其制备方法，相对于现有技术具有以下有益效果：
25.本发明的干悬浮杀菌剂，包括木霉菌分生孢子粉、润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂以及载体；本发明的干悬浮杀菌剂具有分生孢子成活率高(80.16％)、保存期长、崩解快，悬浮率高、粒径细，附着力强、耐冲刷等优点，是一种优良的绿色农药，具有巨大市场开发前景。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1本发明的长枝木霉(trichoderma longibrachiatum nbbrc-vwt5)在光学显微镜镜检照片(400x)；
28.图2为本发明的长枝木霉(trichoderma longibrachiatum nbbrc-vwt5)正面pda平板照片；
29.图3为本发明的长枝木霉(trichoderma longibrachiatum nbbrc-vwt5)反面pda平板照片；
30.图4为本发明的长枝木霉(trichoderma longibrachiatum nbbrc-vwt5)its rrna基因测序进化树图；
31.图5为本发明实施例1中制备得到的干悬浮杀菌剂的粒径分布图。
具体实施方式
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
33.下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
34.本技术实施例提供了一种木霉菌，是从湖北神农架国家森林公园土壤中分离得到的。该菌株在pda培养基上生长良好，菌落在pda平板上有脓泡状结构生成，大小不同的脓泡成熟后变成绿色，反面颜色白色或黄色，镜检观察为树枝状，小梗顶端有成簇的分生孢子，分生孢子为椭球型，菌落形态及基因测序进化树见附图1、图2、图3及图4。经中国典型培养物保藏中心鉴定并根据木霉菌的分类命名为：长枝木霉(trichoderma longibrachiatum nbbrc-vwt5)。目前，该木霉菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2022942，保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期为2022年06月29日。
35.基于同一发明构思，本技术实施例还提供了一种干悬浮杀菌剂，包括木霉菌分生孢子粉，木霉菌分生孢子粉的制备方法为：将上述的木霉菌经过活化培养至产生孢，即得木霉菌分生孢子粉。
36.具体的，上述的木霉菌分生孢子粉的制备方法，具体为：
37.s1、将保藏的木霉菌菌种先接到pda培养基平板上，在28℃和12l:12d条件下活化培养至产孢，自pda培养基平板培养菌落上取孢子粉配制成浓度为3
×
107个孢子/ml的悬浮液；
38.s2、将1ml步骤s1中悬浮液加入盛有30ml pd培养液的200ml三角瓶中，使培养液中孢子浓度为l
×
l06个孢子/ml，振荡培养(28
±
1℃，180r/min)48h，转接入1000ml pda培养液(pda是标准真菌培养液)中，继续振荡培养24h即为接种液；
39.s3、称取100g大米分别置于500ml玻璃三角瓶中，按米(g)：水(ml)＝1:1.5(即每g大米加1.5ml水)加入水浸泡30min，洗尽沥干后，进行灭菌，灭菌条件为：121℃，0.1mpa灭菌30分钟。冷却后按10％体积的接种量拌入木霉菌接种液(即步骤s2中接种液)，接种后的米料倒入直径为15cm的培养皿中，用保鲜膜覆盖；
40.s4、再将接种的米料在28
±
1℃和12l：12d的条件下培养产孢，后去掉保鲜膜后培养3～5d，得到大米培养物；将大米培养物经冷冻真空干燥处理后，使其含水率降至4％以
下，利用振动筛，使孢子粉与大米基质分开，即得木霉菌分生孢子粉；
41.其中，pda培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，pd培养液即pd液体培养基，本技术所用的pda培养基、pd培养液均采用市售培养基/培养液；12l:12d指的是光周期，12小时明，然后12小时黑暗。
42.在一些实施例中，还包括润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂以及载体。
43.在一些实施例中，按照质量分数计，干悬浮杀菌剂包括：5～30％的木霉菌分生孢子粉、8～20％的润湿分散剂、0.1～1％的紫外保护剂、2～20％的崩解剂、1.0～10％的粘结剂、24～83.9％的载体。
44.在一些实施例中，紫外保护剂包括糊精、黄原胶、荧光素钠、维生素c、纳米氧化锌中的至少一种；
45.和/或，崩解剂包括交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、尿素、硫酸铵、淀粉中的至少一种；
46.和/或，粘结剂包括cmc、木质素磺酸钠、peg、草酸、糊精中的至少一种；
47.和/或，载体包括凹凸棒土、高岭土、硅藻土、膨润土、白炭黑中的至少一种；
48.和/或，润湿分散剂包括morwet efw、k12、mf-5、terwet1010、wlno、木质素磺酸钙、tersperse2700、tersperse 2020、morwet d425、nno、t36中的至少一种。
49.其中，cmc为羧甲基纤维素，peg为聚乙二醇，morwet efw为阿克苏诺贝尔进口润湿剂；morwet efw，k12为十二烷基硫酸钠，mf-5为上虞浙创化工有限公司的分散剂，tersperse2700为美国亨斯迈公司生产的tersperse2700分散剂，
50.在一些实施例中，按照质量分数计，所述干悬浮杀菌剂包括：5％的木霉菌分生孢子粉、12％的morwet efw与木质素磺酸钙混合而成的润湿分散剂、3％的交联聚乙烯吡咯烷酮、0.2％的纳米氧化锌、4％的peg、75.8％的白炭黑，其中，morwet efw与木质素磺酸钙的质量比为1:1。
51.在一些实施例中，按照质量分数计，所述干悬浮杀菌剂包括：20％的木霉菌分生孢子粉、15％的terwet1010和tersperse 2700混合而成的润湿分散剂、4％的交联聚维酮、0.3％的维生素c、5％的木质素磺酸钠、55.7％的硅藻土，其中，terwet1010和tersperse 2700的质量比为1:1。
52.在一些实施例中，木霉菌分生孢子粉的含孢量≥1
×
10
10
个/g、质量含水量为1.8～2.5％。
53.基于同一发明构思本技术实施例还提供了一种上述的的干悬浮杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
54.s1、将润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂以及载体混合后，加水至研磨器容量的70％，然后研磨；
55.s2、将木霉菌分生孢子粉加入至研磨后的物料中混合，喷雾造粒，即得干悬浮杀菌剂。
56.在一些实施例中，将润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂以及载体混合后，加入水，然后经加拿大均质机(工作压力500～1200bar)或砂磨机研磨至粒径为18～22μm；
57.将木霉菌分生孢子粉加入至研磨后的物料中后置于剪切机中以8000～15000r/min搅拌混合20～60min，喷雾造粒，即得干悬浮杀菌剂。
58.本技术的干悬浮杀菌剂，将各助剂(润湿分散剂、紫外保护剂、崩解剂、粘结剂)及载体分别设计比例加入营养液中，接种106个孢子/ml分生孢子悬浮液，28
±
1℃、180r/min振荡培养16h，抽样镜检萌发率(活孢率)。以萌发率高低判定各助剂的影响，芽管长度等于或大于孢子直径的孢子视为萌发，以孢子水悬液作为对照(hong et al.，2001)。
59.本技术的干悬浮杀菌剂的质量标准为干悬浮杀菌剂中活孢率≥80.00％，水分≤1.63，ph值为6.5，孢子悬浮率≥82.12％，润湿时间为15s，崩解时间为78s，90％的粒度《25.69μm，平均粒度为10.84μm1，热贮稳定性30℃下贮存60天；为合格的木霉菌干悬浮剂。本技术的干悬浮杀菌剂，该剂型提高了分生孢子的萌发率和悬浮率，润湿和崩解速度快，分散性和热贮稳定性优良，为植物病害防治提供了新材料。
60.以下进一步以具体实施例说明本技术的木霉菌干悬浮杀菌剂及其制备方法。本部分结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。如未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。
61.实施例1
62.本技术实施例提供了一种干悬浮杀菌剂，按质量分数计，包括：5％的木霉菌分生孢子粉、12％的morwet efw与木质素磺酸钙混合而成的润湿分散剂、3％的交联聚乙烯吡咯烷酮、0.2％的纳米氧化锌、4％的peg、75.8％的白炭黑，其中，morwet efw与木质素磺酸钙的质量比为1:1。
63.上述干悬浮杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
64.s1、将上述除木霉菌分生孢子粉以外的各物料混合后，加入适量的水后，置于砂磨机中，研磨至粒径为20μm；
65.s2、将木霉菌分生孢子粉加入至步骤s1中研磨后的物料中，然后置于剪切机以8000～15000r/min混合20～60min，混合均匀后进行喷雾造粒，即得到干悬浮杀菌剂。
66.实施例2
67.本技术实施例提供了一种干悬浮杀菌剂，按质量分数计，包括：20％的木霉菌分生孢子粉、15％的terwet1010和tersperse 2700混合而成的润湿分散剂、4％的交联聚维酮、0.3％的维生素c、5％的木质素磺酸钠、55.7％的硅藻土，其中，terwet1010和tersperse 2700的质量比为1:1。
68.本技术实施例提供的干悬浮杀菌剂的制备方法，同实施例1。
69.实施例3
70.本技术实施例提供了一种干悬浮杀菌剂，按质量分数计，包括：25％的木霉菌分生孢子粉、18％的terwet1010、tersperse 2020以及t36混合而成的润湿分散剂、5％的硫酸铵、6％的cmc、0.4％的纳米氧化锌、45.6％的膨润土，其中，terwet1010、tersperse 2020以及t36的质量比为1:1:1。
71.本技术实施例提供的干悬浮杀菌剂的制备方法，同实施例1。
72.实施例1中制备得到的干悬浮杀菌剂的粒径分布如图5所示。具体的，图5中左侧纵坐标cmum％(cumulative distribution的简写)表示累积分布，右侧纵坐标diffx(difference distribution的简写)表示差额分布。图5中，粒径分布如下表1所示。
73.表1-粒径分布
74.粒径μm含量％0.8230.001.3120.172.0910.973.3333.195.3138.518.47019.4713.5039.8621.5273.3334.9097.5454.76100.00
75.从图5中可以看出，质量含量90％的干悬浮杀菌剂的粒度《25.69μm，平均粒度为10.84μm。
76.实施例1中制备的干悬浮杀菌剂中活孢率≥80.00％、水分≤1.63％(质量含量)、ph值为6.5、孢子悬浮率≥82.12％、润湿时间为15s、崩解时间为78s、热贮稳定性30℃下可贮存60天、为合格的木霉菌干悬浮剂。
77.干悬浮杀菌剂的应用
78.1.1供试材料：苹果轮纹病原菌(physalospora piricola nose)、油菜菌核病原菌(sclerotinia sclerotiorum)、黄瓜白粉病原菌(sphaerotheca cucurbitae)、马铃薯晚疫病原菌(phytophthora infestans)。
79.1.2供试药剂：本技术实施例1～3中制备得到的干悬浮杀菌剂，对照分别为70％百菌清可湿性粉剂剂型和25％嘧菌酯悬浮剂剂型。需要指出的是，70％百菌清可湿性粉剂剂型、25％嘧菌酯悬浮剂剂型均为国际农药标准通用表述。
80.1.3方法
81.盆栽试验：分别将上述各种病原菌转至pda平板活化3d，再转至pd液体培养基中，每瓶转5块，培养6d，打菌丝，测透光率喷雾接种，保湿培养黄瓜苗至发病，三种病原菌透光率分别为1.0％、3.2％和9.6％；分别将实施例1～3中制备的干悬浮杀菌剂分别采取稀释400倍、800倍和1600倍，喷雾防治病原菌，15d后检查防治效果，根据病级指数划分标准(表2)，按照以下公式计算防治效果。
82.表2-病级指数划分标准
83.病级病情0无任何症状1病斑面积占整片叶面积的5％以下3病斑面积占整片叶面积的6-10％5病斑面积占整片叶面积的11-25％7病斑面积占整片叶面积的26-50％9病斑面积占整片叶面积的50％以上
84.病情指数＝〔∑(病级数值
×
该病级叶数)
×
100〕/(病级最高值
×
调查叶数)
85.防治效果(％)＝(ck病情指数-处理病情指数)
×
100/ck病情指数；
86.其中，ck表示空白对照。
87.1.4结果与分析
88.表3-本技术的干悬浮杀菌剂对苹果轮纹病菌的离体试验
[0089][0090]
表4-本技术的干悬浮杀菌剂对油菜菌核病菌的离体试验
[0091][0092]
从表3～4中可以看出，本技术制备得到干悬浮杀菌剂对苹果轮纹病的防效在75％以上，对油菜菌核病防效在65％以上。
[0093]
表5-本技术的干悬浮杀菌剂对黄瓜白粉病的离体试验
[0094]
[0095][0096]
表6-本技术的干悬浮杀菌剂对马铃薯晚疫病的离体试验
[0097][0098]
从表5～6中可以看出，在1000倍稀释液干悬浮杀菌剂对黄瓜白粉病的平均防效在70％以上，与对照药剂枯草芽孢杆菌防效相当；对马铃薯晚疫病防效低于对照药剂化学农药氰霜唑82.8％，但防效也达到70％左右。
[0099]
表7-本技术的干悬浮杀菌剂对苹果轮纹病、油菜菌核病的盆栽试验
[0100][0101]
注：差异性(p＝0.01)，表7中数字后边大写字母，表示99％水平上显著性。
[0102]
从表7中可知，本技术的干悬浮杀菌剂对两种植物病害的防效各异。木霉菌分生孢子粉干悬浮剂对苹果轮纹病》油菜菌核病，所试的木霉菌分生孢子粉干悬浮剂的防效虽不
及化学农药嘧菌酯，但400倍液对苹果轮纹病病害的防效也达88％，且与嘧菌酯防效差异极不显著(p》0.01)，对油菜菌核病的防效虽比化学农药差，但也达到75％以上，且木霉菌分生孢子粉干悬浮剂属微生物农药范畴，无化学农药的3r现象，是环保绿色的农药。
[0103]
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。