布地奈德21-磷酸酯盐及包含其的药物组合物的制作方法

1.本发明涉及布地奈德21-磷酸酯与β2肾上腺素激动剂且优选与福莫特罗的盐，含有其的药物组合物及其在治疗呼吸道炎症性疾病、阻塞性疾病和过敏原诱导的气道功能障碍中的用途。本发明还涉及制备所述盐的方法。


背景技术：

2.式i所示的布地奈德(bud)(化学名11β,21-二羟基-16α,17α-(亚丁基二(氧))孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮)是一种糖皮质激素类固醇，用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、非感染性鼻炎和克罗恩病。
[0003][0004]
布地奈德的logp为3.2，这导致其在肠道区域的生理ph值下几乎不溶于水(28μg/ml)[1]。它属于吸入性皮质类固醇(ics)，ics是迄今为止治疗哮喘的最有效的一类化合物，即使在非常低的剂量下也能够抑制和激活许多与引发哮喘气道炎症相关的基因。
[0005]
β2(贝塔2)肾上腺素受体激动剂是一类作用于β2肾上腺素受体的药物。β2肾上腺素激动剂引起支气管组织的平滑肌扩张、肌肉和肝脏的血管舒张、子宫肌肉的松弛和胰岛素的释放。它们主要用于治疗哮喘和其他肺部疾病，例如copd。
[0006]
它们可分为短效、长效和超长效β2肾上腺素受体激动剂。
[0007]
ics通常与长效β2-激动剂(laba)联合使用。布地奈德通常与式ii所示的福莫特罗(化学名n-[2-羟基-5-[1-羟基-2[[2-(p-甲氧基苯基)-2-丙基]-氨基]-乙基]-苯基]-甲酰胺)联合。
[0008][0009]
吸入性β2-激动剂和皮质类固醇经常联合用于控制哮喘，显示出重要的分子相互作用[2]。特别是，皮质类固醇增加了β2-受体的基因转录，防止它们在长期给药后下调[3]。
此外，皮质类固醇还可以增强β2-激动剂的改善β2-受体与g蛋白偶联的效果[4]。这些效果进一步维持了这两类药物组合的治疗优势。
[0010]
国际药剂学杂志(international journal of pharmaceutics)416(2011)，第493-498页公开了脂质体和游离糖皮质激素制剂在实验性抗原诱导关节炎(aia)期间对关节炎症和下丘脑-垂体-肾上腺(hpa)轴活性的影响。脂质体递送的有效剂量较低，从而提高了糖皮质激素的安全性。脂质体糖皮质激素的安全性可以通过包裹布地奈德磷酸酯(budesonide phosphate)而非泼尼松龙磷酸酯(prednisolone phosphate)来进一步提高。
[0011]
wo 99/64014公开了包含福莫特罗和布地奈德的组合物用于预防或治疗哮喘急性病症的用途。
[0012]
定义
[0013]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本公开所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，出于清楚和/或便于引用的目的，本文对具有普遍理解含义的术语进行了定义。因此，本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的含义存在实质性差异。
[0014]
本文中的术语“生理学上可接受的赋形剂”是指自身没有任何药理作用并且在施用于哺乳动物且优选人时不会产生不良反应的物质。生理学上可接受的赋形剂在本领域中是众所周知的并且公开在例如药物赋形剂手册(handbook of pharmaceutical excipients)2009年第6版中，其通过引用并入本文。
[0015]
本文中的术语“短效β2肾上腺素受体激动剂”或“短效β2激动剂”或“saba”是指作用持续时间约为4至6小时的β2肾上腺素受体激动剂。可用于本发明的saba的优选实例是非诺特罗、奥西那林、沙丁胺醇和特布他林。
[0016]
本文中的术语“长效β2肾上腺素受体激动剂”或“长效β2激动剂”或“laba”是指作用持续时间长达12小时的β2肾上腺素受体激动剂。可用于本发明的laba的优选实例是班布特罗、克仑特罗、福莫特罗和沙美特罗。
[0017]
本文中的术语“超长效β2肾上腺素受体激动剂”或“超长效β2激动剂”或“ultra-laba”是指具有24小时持续时间的β2肾上腺素受体激动剂，允许每日一次给药。可用于本发明的ultra-laba的优选实例是茚达特罗和奥达特罗。
[0018]
本文中的术语“福莫特罗”是指福莫特罗游离碱。
[0019]
本文中的术语“约”和“大约”是指在测量中可能出现的实验误差的范围。
[0020]
术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应被解释为开放式术语(即意思是“包括但不限于”)，并且也应被视为对术语“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”提供了支持。
[0021]
术语“基本上由
……
组成”将被解释为半封闭式术语，意味着不包括实质上影响本发明的基本的和新颖的特征的其他成分(因此可以包括任选的赋形剂)。
[0022]
术语“由
……
组成”应解释为封闭式术语。


技术实现要素：

[0023]
布地奈德几乎不溶于水，但易溶于醇。为此，通常制备水醇溶液，用于将足量的活性物质溶解在增溶剂，例如水溶性醇中。然而，由于大量布地奈德在短时间内分解，因此，如此制备的溶液稳定性低。此外，迄今为止，布地奈德制剂一直以水悬浮液的形式制备，其中
固相倾向于很快地沉积到容器底部，因此需要化学添加剂或剧烈搅拌。这些是布地奈德不适合通过电动雾化器给药的原因。
[0024]
已经制备出了几种皮质类固醇的21-磷酸一酯，并主要用作几种药物组合物的活性成分。这些分子具有母体类固醇(parent steroid)所不具备的宝贵特性。首先，它们是水溶性的，因此可以以水溶液给药。
[0025]
布地奈德21-磷酸酯(以下也称为bud-21p或b)(式iii)已在一些研究[5-8]中被使用，其中它被描述为用于靶向递送抗体-药物缀合物的连接子。
[0026][0027]
在本发明中，式iii化合物被描述为具有抗炎和抗哮喘特性的水溶性更好的化合物。
[0028]
近来，大量用于治疗炎性气道疾病的药物获批，这些药物的特点是将不同作用机制的分子联合，例如倍氯米松/福莫特罗、糠酸氟替卡松/维兰特罗、布地奈德/福莫特罗、茚达特罗/格隆溴铵等，旨在获得协同的治疗效果。
[0029]
本发明的目的是提供具有协同治疗作用的新型布地奈德21-磷酸酯盐。
[0030]
根据第一方面，本发明涉及布地奈德21-磷酸酯与β2肾上腺素激动剂的盐。
[0031]
本发明人惊奇地发现本发明的盐在控制过敏原诱导的气道功能障碍中显示出协同作用。
[0032]
本发明的第二方面是制备布地奈德21-磷酸酯盐的方法。
[0033]
本发明的第三方面是药物组合物，其包含布地奈德21-磷酸酯盐及至少一种生理学上可接受的赋形剂。
[0034]
本发明的第四方面是上述的布地奈德21-磷酸酯盐和药物组合物用作药物。
[0035]
本发明的第五方面是布地奈德21-磷酸酯或其药物组合物与至少一种生理学上可接受的赋形剂组合，用作抗炎剂或抗哮喘剂。
[0036]
本发明的第六方面是上述的布地奈德21-磷酸酯盐、布地奈德21-磷酸酯及其药物组合物，用于治疗呼吸道炎症性疾病、阻塞性疾病、过敏原诱导的气道功能障碍。
附图说明
[0037]
图1示出了布地奈德21-磷酸酯在cd3od-d4中的
31
p nmr；
[0038]
图2示出了布地奈德21-磷酸酯的x射线粉末衍射图；
[0039]
图3示出了布地奈德21-磷酸酯的ft-ir光谱；
[0040]
图4示出了布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐在cd3od-d4中的1h nmr；
[0041]
图5示出了布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐在cd3od-d4中的
13
c nmr；
[0042]
图6示出了布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(下划线数据)、布地奈德21-磷酸酯和
福莫特罗(无下划线数据)的1h-nmr比较波谱；
[0043]
图7示出了布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(下划线数据)、布地奈德21-磷酸酯和福莫特罗(无下划线数据)的
13
c-nmr比较波谱；
[0044]
图8示出了布地奈德21-磷酸酯(b)、福莫特罗(f)和布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(fb)的x-射线粉末衍射叠加图；
[0045]
图9示出了布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐的ft-ir光谱；
[0046]
图10示出了fb、f和b对ova致敏小鼠的支气管反应性和血浆ige水平的影响。每个数据点代表n＝6只动物/组的平均值
±
sem。图a：载体相对于ova，p《0.001；f相对于ova，***p《0.001，fb相对于ova，p《0.001；图b：载体相对于ova，p《0.001；fb相对于ova，p《0.001，通过双因素方差分析(two-way anova)和随后的bonferroni检验分析数据；图c：载体相对于ova，p《0.01；b相对于ova，p《0.01；fb相对于ova，p《0.01，通过单因素方差分析分析数据；
[0047]
图11a和11b示出了fb、f和b对ova诱导的过敏性哮喘小鼠的penh测量值的影响。通过在所有动物暴露于吸入性生理盐水溶液(图b)或浓度递增的吸入性乙酰甲胆碱(mch；图a)后测量的增强呼气间歇反应(penh)评估支气管收缩；fb、f或b在2周时间内每天给药，且总是在ova刺激(每周两次)前60分钟给药。每个数据点代表n＝6只动物/组的平均值
±
sem，假手术组除外(n＝5)。图a：mch剂量相对于反应的曲线；图c：峰值penh反应(emax)；图d：penh相对于mch剂量的曲线下面积(auc)。相对于假手术组，**p《0.01；相对于未经处理的ova组，#p《0.05、##p《0.01、###p《0.001。通过单因素方差分析(one-way anova)和随后的dunnett检验分析数据；
[0048]
图12a、12b和12c示出了fb、f和b对来自ova诱导的过敏性哮喘小鼠的bal液中白细胞总数和分类计数的影响；从未经处理的假手术组和ova诱导的过敏动物中收集bal液。fb、f或b在2周内每天给药，并且总是在ova刺激(每周两次)前60分钟给药。每个柱形代表n＝6动物/组的平均值
±
sem，假手术组除外(n＝5)。图a：bal白细胞总数；图b：bal嗜酸性粒细胞；图c：bal中性粒细胞；图d：bal巨噬细胞；图e：bal淋巴细胞；相对于假手术组，*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001；相对于未经处理的ova组，##p《0.01、###p《0.001；通过单因素方差分析和随后的dunnett检验分析数据；
[0049]
图13a、13b和13c示出了fb、f和b对ova诱导的过敏性哮喘小鼠的循环白细胞总数和分类计数的影响；从未经处理的假手术组和ova诱导的过敏动物收集血样。fb、f或b在2周内每天给药，并且总是在ova刺激(每周两次)前60分钟给药。每个柱形代表n＝6动物/组的平均值
±
sem，假手术组除外(n＝5)。图a：血液白细胞总数；图b：血液嗜酸性粒细胞；图c：血液中性粒细胞；图d：血液巨噬细胞；图e：血液淋巴细胞；相对于假手术组，**p《0.01和***p《0.001；相对于未经处理的ova组，#p《0.05、##p《0.01和###p《0.001；通过单因素方差分析和随后的dunnett检验分析数据；
[0050]
图14a、14b和14c.布地奈德(bud)及其21-磷酸酯(bud-21p)对ova诱导的过敏性哮喘小鼠支气管收缩的影响比较。增强呼气间歇反应(penh)是在(第一次ova刺激后)4周内每天施用化合物后，在所有动物暴露于浓度递增的吸入性乙酰甲胆碱(图a和b)后测量的；每个数据点代表n＝5-6动物/组的平均值
±
sem；图c：基础penh测量(即未暴露于乙酰甲胆碱)；图e：penh相对于mch剂量的曲线下面积(auc)；图d：峰值penh反应(emax)，通过单因素方差分析和随后的用于多重均值比较的fisher's lsd检验分析数据；相对于假手术组，*p《
0.05；相对于未经处理的ova组，#p《0.05、##p《0.01和###p《0.001。
[0051]
图15a、15b和15c.布地奈德(bud)及其21-磷酸酯(bud-21p)对ova诱导的过敏性哮喘小鼠的bal液中白细胞总数和分类计数的影响比较；在(第一次ova刺激之后)4周内每天施用化合物后，从未经处理的假手术组动物和ova诱导的过敏动物收集bal液；柱形代表n＝5-6动物/组的平均值
±
sem。图a：bal白细胞总数；图b：bal嗜酸性粒细胞；图c：bal中性粒细胞；图d：bal淋巴细胞；图e：bal巨噬细胞。数据通过单因素方差分析和随后的用于多重均值比较的fisher's lsd检验分析数据；相对于假手术组，*p《0.05、**p《0.01和、***p《0.001；相对于未经处理的ova组，#p《0.05、##p《0.01和###p《0.001；
[0052]
图16.在i.d.注射水肿诱导剂后30分钟，通过伊文思蓝(evans blue)法评估血浆外渗。在水肿诱导前60分钟，用等摩尔剂量的皮质类固醇对动物进行预处理(i.p.)。图a示出了用2.32μmol/kg的每种测试化合物(相当于1.0mg/kg bud和1.2mg/kg bud 21-p)处理后获得的结果；图b示出了用0.70μmol/kg每种测试化合物(相当于0.30mg/kg bud和0.36mg/kg bud 21-p)处理后获得的结果；相对于tyrode，**p《0.01、***p《0.001；相对于载体处理组，#p《0.05、##p《0.01，通过单因素方差分析和随后的fisher检验进行分析。
具体实施方式
[0053]
本发明涉及布地奈德21-磷酸酯与β2肾上腺素激动剂的盐。
[0054]
在本发明的一个优选实施方案中，β2肾上腺素激动剂选自短效β2激动剂、长效β2激动剂或超长效β2激动剂。
[0055]
在本发明的另一个优选实施方案中，β2肾上腺素激动剂选自非诺特罗、奥西那林、沙丁胺醇、特布他林、班布特罗、克仑特罗、福莫特罗、沙美特罗、茚达特罗和奥达特罗。
[0056]
更优选地，β2肾上腺素激动剂是福莫特罗。
[0057]
布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(式iv)代表一种能够提高治疗可能性的药学上可接受的盐，其设计目的是为了将更好的溶解性与通过不同作用机制起作用的同时存在的两种药物而产生的协同作用进行结合。
[0058][0059]
盐可以是固态并且包括所有晶型、多晶型和假多晶型盐。
[0060]
在根据本发明的一个实施方案中，布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐的晶型iv的特征是：在通过使用cukα辐射获得并以
°
2θ角表示的x射线粉末衍射图中，在约5.82、8.21、11.67、13.02、13.54、14.17、14.87、16.40、16.92、18.39、19.69、20.15、20.65、21.41、22.28、23.41、23.69、24.16、24.77、25.27、26.41、27.38、27.84、28.58、30.15、31.69、33.58、34.41、35.47、36.02、37.59、38.63 2θ
±
0.20
°
处存在特征峰。
[0061]
在根据本发明的一个实施方案中，布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐的晶型iv的特征在于，通过采用如下操作条件的自动衍射仪获得的x射线粉末衍射图：cukα辐射，从4
°
到40
°
的
°
2θ角范围，每步时间相当于120秒。
[0062]
特征峰列于表1。
[0063]
表1
–
布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐的特征峰
[0064]
[0065][0066]
在根据本发明的另一个实施方案中，布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐的晶形iv的特征在于如图8所示的x射线粉末衍射图谱。
[0067]
如实验部分所示，布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(fb)已在临床前研究中进行了评估。该研究是通过使用两种过敏性哮喘模型进行的。
[0068]
第一组实验获得的数据证明了对致敏动物使用1mg/kg剂量的fb腹膜内给药处理后，其支气管高反应性显著降低。
[0069]
因此，与相同剂量的母体化合物福莫特罗(f)或布地奈德21-磷酸酯(b)相比，fb在保护气道功能障碍方面表现出显著功效。
[0070]
第二组实验获得的数据表明了当以母体化合物f和b的1/10剂量给药时，fb对过敏
小鼠mch诱导的支气管收缩的影响。
[0071]
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含作为活性成分的布地奈德21-磷酸酯和β2肾上腺素激动剂的盐以及至少一种生理学上可接受的赋形剂。
[0072]
优选地，所述组合物为粉末、悬浮液或溶液，更优选地，所述组合物通过吸入或口服途径给药。
[0073]
该组合物可用于通过粘膜的吸入法或存在于溶液中用于气溶胶疗法。对于通过吸入法给药，本发明的化合物可以以加压包装中的气溶胶喷雾剂的形式或通过使用雾化器来递送。此外，该制剂还可以作为吸入性粉末通过吸入器装置的吹入递送。用于吸入法的优选递送系统是定量剂量的吸入气溶胶，其配制成各成分以悬浮液或溶液存在于用于可吸入药物制剂的合适的推进剂中。
[0074]
适合口服给药的药物组合物可以以片剂、胶囊或糖浆剂施用。
[0075]
本发明的另一方面涉及根据本发明的布地奈德21-磷酸酯盐或其药物组合物用作药物。
[0076]
根据本发明的一个优选实施方案，布地奈德21-磷酸盐或其药物组合物在治疗呼吸道炎症性疾病，阻塞性疾病，过敏原诱导的气道功能障碍，例如哮喘、copd和肺纤维化中是有用的。
[0077]
有利地，即使以低于单一药物的剂量给药，本发明的布地奈德21-磷酸酯盐也显著地降低过敏原诱导的气道功能障碍。
[0078]
特别是，考虑到所测试的最低fb剂量显示出显著的有益效果(无论是在呼吸功能方面，还是在循环白细胞数量和肺部细胞募集方面)，与单独使用b或f的效果相当甚至更好，本发明人提出，当以fb给药时，f和b之间在控制哮喘样特征方面存在积极的协同作用。
[0079]
本发明的另一方面涉及制备根据本发明的布地奈德21-磷酸酯盐的方法，包括以下步骤：
[0080]
i)将布地奈德21-磷酸酯溶解或悬浮于有机溶剂中；
[0081]
ii)在搅拌下加入β2肾上腺素激动剂，优选福莫特罗；
[0082]
iii)将布地奈德21-磷酸酯与β2肾上腺素激动剂的盐且优选与布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐分离。
[0083]
用于成盐的有用溶剂包括c
1-c4脂肪醇(甲醇、乙醇、异丙醇)、c
2-c6脂肪酮(丙酮、甲基乙基酮、甲基异丙基酮、二乙基酮)、c
4-c8脂肪醚(乙醚、异丙基醚、叔丁醚)、c
4-c6环醚(四氢呋喃、二恶烷)、c
3-c8脂肪酸酯(乙酸乙酯)、c
5-c8烃(甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、庚烷)、c
1-c4氯代烃(二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷)、脂肪族c
2-c4腈(乙腈)或其混合物。
[0084]
用于成盐的优选溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、乙酸乙酯或其混合物。
[0085]
优选地，在根据本发明的方法中，布地奈德21-磷酸酯与有机溶剂的mmol/ml比为1:20至1:40，优选1:30。
[0086]
优选地，在根据本发明的方法中，布地奈德21-磷酸酯与β2肾上腺素激动剂，优选与福莫特罗的摩尔比为1:1至1:1.5。
[0087]
根据本发明方法的一个优选实施方案，通过添加反溶剂进行分离步骤iii)，该反溶剂选自c
5-c8脂肪族直链烃(优选己烷)、c
4-c8醚(优选乙醚)或其混合物。
[0088]
优选地，有机溶剂与反溶剂的体积比为2:1至1:2，优选体积比1:1。
[0089]
或者，通过结晶进行分离步骤iii)。
[0090]
用于结晶的有用溶剂与上述用于成盐的溶剂相同，优选正己烷。
[0091]
在根据本发明的一个实施方案中，该方法还包括在30-80℃、优选40-50℃的温度下的干燥步骤。优选地，干燥步骤在烘箱中进行。
[0092]
本发明的另一方面涉及布地奈德21-磷酸酯或其药物组合物与至少一种生理学上可接受的赋形剂组合，用作抗炎剂或抗哮喘剂。
[0093]
有利地，本发明人已发现式iii的化合物(下文也称为b或bud-21p)是布地奈德的水溶性更好的衍生物，其表现出抗炎和抗哮喘特性。布地奈德21-磷酸酯在测试剂量下系统给药时，可抑制支气管高反应性并降低血浆ige水平。另一方面，当鼻内给药时，在肺中表现出显著的抗炎作用。
[0094]
此外，布地奈德21-磷酸酯比母体布地奈德更有效地发挥其对ova诱导的过敏性哮喘和皮肤水肿的小鼠的有益作用。
[0095]
根据本发明的一个优选实施方案，布地奈德21-磷酸酯或其药物组合物在治疗呼吸道炎症性疾病、阻塞性疾病、过敏原诱导的气道功能障碍，例如哮喘、copd和肺纤维化中是有用的。
[0096]
实验部分
[0097]
材料和方法
[0098]
a)化学
[0099]
1.材料和方法
[0100]
所有其他商业产品均购自merck-sigmaaldrich。在agilent inova波谱仪上记录1h(500mhz)和
13
c(125mhz)nmr波谱；化学位移参考残留溶剂信号(cd3od：δh＝3.31，δc＝49.0)。同核1h联结由cozy实验确定。二键和三键1h-13
c联结由梯度2d hmbc实验确定，该实验针对8hz的
2，3
j进行了优化。使用panalytical x
′
pert pro衍射仪进行x射线粉末衍射(xrpd)。在40kv和30ma条件下，使用ni过滤的cuk
∝
辐射在4-40
°
的2θ范围内获得强度曲线，步长为0.02
°
，扫描时间为120秒/步。使用highscore plus套件处理衍射图案。在thermo nicolet 5700ft-ir光谱仪上记录ir光谱。
[0101]
2.布地奈德21-磷酸酯(iii)的合成
[0102]
向-40℃的搅拌下的布地奈德(10g，0.023mol)无水thf(35ml)溶液中加入二磷酰氯(8.0ml，0.058mol)，并将所得混合物在-40℃搅拌20分钟。将反应用水淬灭并用饱和碳酸氢钠溶液处理直至ph～8，在室温下将混合物保持搅拌1小时。溶液用乙酸乙酯萃取，使用1n hcl溶液使水相呈酸性并用乙酸乙酯萃取数次。合并的有机相用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩得到布地奈德21-磷酸酯(10.1g，86％)。熔点219-221℃，lrms(es)(m h) ：计算值510.5，实际值511.2。
[0103]
1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.45(d，j＝10.1hz，1h)，6.25(d，j＝10.1hz，1h)，6.01(s，1h)，5.21(t，j＝4.9hz，0.5h)，5.14(d，j＝7.2hz，0.5h)，5.01-4.83(m，2h)，4.77-4.59(m，2h)，4.47-4.37(m，1h)，2.65(td，j＝13.4，5.3hz，1h)，2.37(d，j＝9.6hz，1h)，2.28-2.07(m，3h)，2.01-1.92(m，1h)，1.87-1.79(m，1.5h)，1.77-1.67(m，1.5h)，1.64-1.56(m，3h)，1.54-1.45(m，4h)，1.03-0.88(m，7h).13c nmr(126mhz，cd3od)δ206.14，204.88，190.12，175.51，160.99，133.16，129.17，123.87，110.73，106.88，101.11，100.26，85.59，
84.37，71.71，58.41，55.43，52.57，48.30，47.18，42.53，39.49，37.38，36.76，35.60，34.27，33.68，32.95，22.83，19.68，19.32，19.21，18.93，15.63，15.55.
[0104]
布地奈德21-磷酸酯(式iii)的
31
p nmr如图1所示。
[0105]
xrpd分析在图2中报告，显示了化合物的无定形模式。图3显示了布地奈德21-磷酸酯的ft-ir光谱。
[0106]
3.布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(iv)的合成
[0107]
3.1.实施例1
[0108]
将布地奈德21-磷酸酯(1g，2.0mmol)溶解在60ml乙酸乙酯中。加入福莫特罗(0.69g，2.0mmol)并剧烈搅拌溶液。1小时后，加入60ml正己烷，再搅拌12小时。滤出形成的固体，用正己烷(2
×
10ml)洗涤并在烘箱中干燥(50℃，12h)。产量1.44克(85％)。熔点170.0
±
172.5℃。
[0109]1h nmr(cd3od-d4)δ8.31(s，1h)，8.10(s，1h)，7.46(d，1h)，7.17(d，2h)，7.09(t，1h)，6.89(d，3h)，6.24(t，1h)，6.00(s，1h)，5.19(t，0.5h)，5.12(t，0.5h)，4.97-4.80(m，3h)，4.73-4.65(m，2h)，4.60(m，1h)，4.41-4.39(m，1h)，3.77(s，3h)，3.57-3.47(m，1h)，3.18(dd，2h)，2.66(ddd，1h)，2.37-2.35(m，1h)，2.20-2.09(m，3h)，1.93-1.89(m，1h)，1.70-1.66(m，2h)，1.63-1.56(m，4h)，1.48(s，3h)，1.23(d，3h)，1.00-0.87(m，7h).
[0110]
13c nmr(cd3od-d4)δ208.21，206.87，190.37，175.49，163.31，161.61，161.16，149.80，134.54，132.68，130.55，129.13，128.14，125.07，123.83，121.59，117.42，116.54，110.64，106.74，101.21，100.32，96.72，85.31，84.20，71.80，71.31，58.46，58.30，56.96，53.66，52.60，48.23，47.22，42.79，42.44，40.74，39.54，39.05，37.42，36.78，36.63，35.59，35.08，34.29，33.69，32.98，22.84，19.67，19.30，19.20，18.93，16.83，15.67，15.55.
[0111]
3.2.实施例2
[0112]
将布地奈德21-磷酸酯(500mg)和福莫特罗(350mg)悬浮在乙腈(30ml)中。在沸点下剧烈搅拌4小时后，将混合物冷却，过滤回收沉淀物。用乙腈洗涤粉末。用乙醚重结晶得到期望化合物。产率58％。
[0113]
3.3.实施例3
[0114]
将布地奈德21-磷酸酯(500mg)溶解在乙醇(50ml)和水(25ml)中。加入福莫特罗(350mg)并将混合物强烈搅拌4小时。然后冻干除去溶剂并将获得的固体在正己烷中重结晶并在烘箱中干燥(50℃，12h)。产率65％。
[0115]
按照实施例1中描述的程序对获得的盐进一步分析其具体的化学特征。在图4和图5中，报告了该盐的1h和
13
c nmr波谱。
[0116]
此外，为了验证表现为有机酸和碱的两种成分之间的特定相互作用，进行了一维和二维nmr分析。特别是，如前所分析，布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐的1h nmr波谱显示，与布地奈德21-磷酸酯和福莫特罗相比，化学位移值存在差异。特别是，化学位移值最显著的变化是与在福莫特罗仲胺附近的化学区域中与碳原子结合的质子相关的变化，如下图6所示。
[0117]
布地奈德21-磷酸酯质子化学位移值显示的变化较小。但是，在这种情况下，δ
p
位移非常重要(从游离酸的0.99ppm到盐的1.76ppm)。
[0118]
13
c nmr分析证实了用1h nmr获得的结果，当比较母体化合物和盐时，突出显示了相同化学区域中化学位移的变化(图7)。
[0119]
图8报告了布地奈德21-磷酸酯(红色)、福莫特罗(蓝色)和布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(黑色)这三种化合物的xrpd分析，图9显示了布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐的ft-ir光谱。
[0120]
b)药理学
[0121]
1.动物
[0122]
1.1.方案-1
[0123]
雌性balb/c(8周大，charles river,calco,意大利)被安置在意大利那不勒斯大学药学系的动物护理设施中，处于受控环境(温度21
±
2℃和湿度60
±
10％)并提供标准啮齿动物食物和水。在实验前让所有动物适应四天，并接受12小时光照-12小时黑暗的安排。实验在光照阶段进行。实验程序被意大利政府部门根据国际和国家法律和政策(用于动物实验的欧盟指令2010/63/eu和意大利dl 26/2014)批准。
[0124]
1.2.方案-2和3
[0125]
雄性balb/c spf小鼠(25
±
2g，6周大)购自圣保罗医学院(巴西圣保罗联邦大学)的动物房设施。它们被集体安置在22℃的温度受控的空间中，进行12/12小时光/暗循环，并允许自由获取食物和水。该研究符合巴西动物实验学院(cobea)制定的动物研究伦理原则。根据内部实验室规则，如果在实验过程中出现与测试试剂相关的严重痛苦，则执行安乐死。
[0126]
1.3.方案-4
[0127]
雄性c57bl/6spf小鼠(25
±
2g，6周大)购自圣保罗医学院(巴西圣保罗联邦大学)的动物房设施。它们被集体安置在22℃的温度受控的空间中，并进行12/12小时的光/暗循环，可以自由获取食物和水，并让它们在实验程序开始前一周适应我们当地的设施。该研究符合巴西动物实验学院(cobea)制定的动物研究伦理原则。根据内部实验室规则，如果在实验过程中出现与测试试剂相关的严重痛苦，则执行安乐死。
[0128]
2.测试物质和试剂
[0129]
在每次ova刺激前30分钟以1mg/kg剂量的腹膜内施用测试化合物布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐(fb)和对照化合物布地奈德21-磷酸酯(b)和福莫特罗(f)。在另一组实验中，fb(剂量为0.26、0.85和2.56μg/动物，分别相当于0.3、1.0和3.0nmol/动物)、b和f(剂量分别为1.53和1.03μg/动物，均相当于3nmol/动物)鼻内给药。将化合物以以下浓度溶解在dmso(西格玛化学品公司,圣路易斯市,密苏里州)中，该浓度使得腹膜内给药100μl溶液(1:10dmso)和鼻内给药(i.n.)10μl溶液/动物(5μl/鼻孔)实现每只动物的确定剂量。
[0130]
在方案3中，测试化合物布地奈德(bud；mw：430，53g/mol)和布地奈德21-磷酸酯游离酸(bud-21p；mw：510，51g/mol)以3、10、30nmol/动物/天的等摩尔剂量给药，分别相当于1.3、4.3、12.9μg/动物/天的bud，1.5、5.1和15.3μg/动物/天的bud-21p。化合物以相应的浓度溶解在10％无菌盐水 90％dmso(西格玛化学品公司,圣路易斯市,密苏里州)中，该浓度使得鼻内(i.n.)给药10μl/动物(5μl/鼻孔)的每种溶液实现每只动物的上述剂量。
[0131]
将卵清蛋白(ova；v级，货号a5503，西格玛化学品公司,圣路易斯市,密苏里州)溶解在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液(250μg/ml)中，并添加al(oh)3(13mg/ml)。该混合物用于通过皮下注射诱导动物的变应性致敏。ova以1％浓度溶解在无菌pbs溶液中，并将该溶液
雾化(作为免疫刺激)。
[0132]
在方案4中，bud(剂量为1.0和0.30mg/kg)和bud 21-p(剂量为1.2和0.36mg/kg)基于摩尔量施用，这些剂量相分别当于每种化合物0.70和2.32μmol/kg。溶解化合物的载体是含有12.5％dmso(西格玛化学品公司,圣路易斯市,密苏里州)的无菌盐水溶液(0.9％nacl)。化合物溶液的制备浓度使得每种溶液通过腹膜内(i.p.)给药10ml/kg实现每公斤体重的给药剂量。醋酸缓激肽(bk；货号b3259,西格玛化学品公司,圣路易斯市,密苏里州)和化合物48/80(c48/80；货号c2313,西格玛化学品公司,圣路易斯市,密苏里州)分别溶解在无菌台式(tyrode)液中，浓度分别60μm和200μg/ml。(通过这种方式，i.d.注射50μl每种药剂分别导致每个注射部位的剂量分别为3nmol和10μg)。
[0133]
3.实验组i
[0134]
下表显示了用于评估的组：
[0135]
组处理剂量n假手术组载体100μl/动物,i.p.6ova载体100μl/动物,i.p.6ova fb布地奈德21-磷酸酯福莫特罗盐1.0mg/kg,i.p.6ova b布地奈德21-磷酸酯1.0mg/kg,i.p.6ova f福莫特罗1.0mg/kg,i.p.6
[0136]
3.1哮喘小鼠模型
[0137]
对雌性balb/c小鼠(8周；charles river)采用以下方式致敏：在第0天和第8天通过皮下施用卵清蛋白(ova100μg溶解在400μl的13.5mg/ml的al(oh)3中)，在第21天对小鼠喷雾施用ova进行刺激(3％，持续20分钟)。48小时后处死小鼠，支气管用于评价支气管对卡巴胆碱和沙丁胺醇的反应性。在每次暴露于过敏原之前将药物通过腹膜内给药。所有化合物均以1mg/k的剂量给药。测量血浆ige水平作为致敏指数。
[0138]
3.2支气管高反应性
[0139]
快速解剖主支气管并清除脂肪和结缔组织。切割1-2mm长的环并放置在2.5ml含有krebs溶液的器官浴槽中，温度为37℃，充氧(95％o2和5％co2)，并连接到与生理记录仪(powerlab 800)(ad instruments(埃德仪器))相关联的等距测力传感器(7006型，ugo basile，科梅里奥,意大利)。最初将环拉伸至0.5g的静息张力，并保持平衡至少30分钟。在每个实验中，支气管环预先用乙酰胆碱(10-6
m)进行刺激，直到获得可重现的反应曲线。随后，在洗涤组织后，绘制对卡巴胆碱(10-9
m-3
×
10-6
m)的累积浓度反应曲线。在用卡巴胆碱预收缩的环上，绘制对沙丁胺醇的浓度曲线。结果以达因每毫克组织表示。
[0140]
3.3血浆ige水平
[0141]
使用柠檬酸盐作为抗凝剂通过心内穿刺收集血液。然后在4℃下以800
×
g离心10分钟获得血浆，并立即在-80℃下冷冻。使用匹配的抗体对(bd biosciences pharmingen，圣何塞，加州)通过elisa测量总ige水平。
[0142]
4.实验组ii
[0143]
下表显示了用于评估的组：
[0144]
组处理剂量n假手术组载体10μl/动物,i.n.5
mod 2400；圣保罗，巴西)中进行分类计数。根据正常形态学标准对白细胞进行分类。
[0154]
5.实验组iv
[0155]
下表显示了用于评估的实验组：
[0156]
实验#1
[0157]
处理剂量n载体10ml/kg；i.p.5bud1.0mg/kg；i.p.5bud 21-p1.2mg/kg；i.p.5
[0158]
实验#2
[0159]
处理剂量n载体10ml/kg；i.p.5bud0.30mg/kg；i.p.5bud 21-p0.36mg/kg；i.p.5
[0160]
5.1皮肤水肿的诱导和治疗
[0161]
根据costa等人(2006)[10]和yshii等人(2009)[11]先前描述的方法评估小鼠中的皮肤水肿。用氨基甲酸乙酯(25％w/v,10ml/kg,i.p.)麻醉小鼠，剃掉背部皮肤，然后用载体/测试化合物进行i.p.处理。55分钟后，通过尾静脉静脉内注射(i.v.)100μl体积的伊文思蓝(evans blue)染料溶液(0.25％，在无菌盐水中)。五分钟后，使用随机方案将bk和c48/80以50μl的固定体积皮内注射(i.d.)到背部皮肤。注射相同体积的tyrode溶液50μl作为对照。30分钟后，通过心脏穿刺获得1ml血液样品，小鼠因氨基甲酸乙酯过量及随后的脱颈致死。将血液样品以6000g离心4分钟以获得血浆。去除背部皮肤，并使用8mm直径的软木钻孔器将注射部位打孔。远离注射部位的未注射皮肤部位也被打孔并作为空白对照。使用甲酰胺从每片皮肤和血浆(100μl)样品中提取染料，并在620nm处测量所得溶液的吸光度。每种试剂引起的血浆外渗(以μl/部位表示)计算为每个皮肤片的吸光度之间的比率，通过空白值和血浆样品溶液进行校正，通过稀释因子进行适当调整[10]。为平均由于不同动物组的变异性(组间变异)导致的数据，将水肿数据表示为相对于每个实验的平均tyrode(对照)反应的倍数变化反应。
[0162]
6.统计分析
[0163]
数据表示为来自n个个体动物的算术平均值
±
sem。使用软件graphpad prism v5.01对数据进行统计分析。结果通过单因素方差分析(anova)及随后的dunnett的多重比较检验进行分析；p《0.05值的组平均值之间的差异被认为是显著的。
[0164]
结果
[0165]
1.实验组i
[0166]
ova诱导的致敏显著增加了支气管反应性，如通过与载体组相比分离的支气管对卡巴胆碱反应的增加所评估的。在经f或fb腹膜内给药处理的过敏动物中观察到支气管高反应性显著降低(图10a)。相反，1mg/kg剂量的b对卡巴胆碱反应的增加没有显著影响(图10a)。ova雾化引起了由沙丁胺醇导致的支气管松弛的显著降低。用f或b预处理并没有改善支气管对沙丁胺醇反应的缺失，而fb显著增加了支气管松弛(图10b)。通过心内穿刺收集血液并测量血浆ige水平。如图c所示，用b和fb的处理都显著降低了ova诱导的ige血浆水平的
增加。
[0167]
2.实验组二
[0168]
2.1肺高反应性/penh功能
[0169]
ova诱导的过敏显著增加了气道反应性，如通过基础条件下(吸入pbs溶液；图11b，图b)的penh测量所评估的。所有处理均未导致基础反应降低。吸入性乙酰甲胆碱(mch)浓度的增加导致penh功能的剂量依赖性增加。在ova诱导的过敏状况中，这种气道反应性显著增强(图11a，图a)，如以下所证实：i)增加的最大反应(e
max
；图11a，图c)；ii)penh-乙酰甲胆碱浓度曲线下面积(auc；图11b，图d)。在所有测试剂量下用f或fb处理的过敏动物中观察到最大反应e
max
显著降低(图11a，图c)，尽管只有fb化合物在所有测试的剂量下在所有测试的mch剂量下显著降低penh(图11b，图d)。(即，在mch刺激预防性方案之前)。
[0170]
2.2bal流体细胞计数
[0171]
图12a、12b和12c显示了ova诱导的过敏显著增加了所收集的bal液中的白细胞总数(图a)。在接受fb(0.3和3nmol/动物的剂量)或b(3nmol/动物)的动物中，这种反应显著降低。图b显示了所有处理均减少了bal样品中嗜酸性粒细胞的数量。用fb或b(3nmol/动物)处理消除了ova诱导的bal巨噬细胞的增加(图d)。另一方面，实验组之间在中性粒细胞和淋巴细胞方面没有统计学上的显著差异(分别如图c和图e所示)。
[0172]
2.3循环白细胞计数
[0173]
图13a、13b和13c显示了ova诱导的过敏显著增加了收集的血液样品中的白细胞总数(图a)。这种反应仅在接受fb(3nmol/动物的剂量)的动物中显著降低，在其他处理中没有显著降低。类似地，关于淋巴细胞，只有用3nmol/天的fb处理的动物比未处理的过敏动物显示出较低数量的循环细胞(图d)。图13b显示了所有处理都减少了循环嗜酸性粒细胞的数量。用b或fb(在所有测试剂量下)的处理显著减少巨噬细胞的数量，尽管只有fb(在所有测试剂量下)将这些细胞的数量减少到低于在对照动物中观察到的值(图d)。另一方面，实验组之间在循环中性粒细胞方面没有统计学上的显著差异(图c)。
[0174]
3.实验组iii
[0175]
3.1肺高反应性/penh功能
[0176]
ova诱导的过敏显著增加了气道反应性，如在暴露于递增浓度的吸入性乙酰甲胆碱后的penh测量所评估的(曲线显示在图14a、14b和14c，图a和b)，如增加的penh-乙酰甲胆碱浓度曲线下面积(auc；图e)和最大反应(e
max
；图d)所证明的。基础penh(即在未暴露于乙酰甲胆碱的情况下)在各组之间没有显著差异。
[0177]
在所有测试剂量(3、10和30nmol/动物/天)下，布地奈德21-磷酸酯(bud-21p)均显著降低两个penh参数(auc和e
max
)，而用母体化合物bud处理时，仅最高剂量(30nmol/动物/天)才会导致这种反应的显著降低。
[0178]
3.2 bal液细胞计数
[0179]
图15a、15b和15c显示，与假手术组相比，过敏性哮喘动物的支气管肺泡间隙募集的总白细胞数量更高，所有处理均导致这些数量的显著减少，尽管在用3nmol/动物/天的剂量的bud处理的动物中观察到的反应仍然显著高于在假手术组小鼠中观察到的反应(图a)。在过敏但未经处理的动物中观察到更明显的嗜酸性粒细胞向肺部迁移，并且所有处理(除了3nmol/动物/天的bud)都显著减少了这种细胞募集(图b)。在过敏但未经处理的动物中，
巨噬细胞向支气管肺泡空间的募集也增加了，并且所有处理都显著降低了这种反应，尽管用3或10nmol/动物/天的bud处理的动物的反应仍然显著高于在假手术组中观察到的反应(图e)。未经处理的过敏动物在bal液中没有显示出显著的中性粒细胞(图c)或淋巴细胞(图d)增加，尽管一些处理能够减少甚至消除这些细胞向支气管肺泡空间的迁移。
[0180]
4.实验组iv
[0181]
4.1皮肤水肿
[0182]
如图16(图a和b)所示，bk和c48/80均诱导显著的血浆外渗，在注射后30分钟测量。如图a所示，在i.d.注射致水肿剂前60分钟施用等摩尔(2.32μmol/kg)剂量的两种化合物(相当于1.0mg/kg bud或1.2mg/kg bud21-p)显示出类似的效果，即消除bk诱导的反应或减少约50％c48/80诱导的血浆外渗。然而，如图b所示，当测试化合物以较低的等摩尔剂量0.70μmol/kg(相当于0.30mg/kg bud或0.36mg/kg bud 21-p)给药时，bud对bk或c48/80均无效。相反，bud 21-p显著降低bk反应并显著抑制c48/80诱导的水肿。
[0183]
结论
[0184]
通过使用两种过敏性哮喘模型进行该研究。因为不存在概括所有人类哮喘特征的单一动物模型，所以这种方法已被用于更好地定义新药的药理学特征。事实上，每个单一模型都提供了一些略微不同的信息，这些信息有助于定义药理活性特征。通过第一组实验获得的数据表明，在用1mg/kg剂量的f或fb腹膜内给药处理的致敏动物中，支气管高反应性显著降低。相反，相同剂量的b对过敏原诱导的气道高反应性的作用较弱。此外，过敏原雾化还显著降低了沙丁胺醇引起的支气管松弛。fb显著减轻了对沙丁胺醇所引起的支气管松弛的恢复药理反应。反之，用f或b预处理并不能防止支气管对沙丁胺醇反应的缺失。因此，与相同剂量的母体化合物f或b相比，fb在保护气道功能障碍方面表现出显著的功效。通过心内穿刺收集血液并测量了血浆ige水平。显然，b和fb的处理都显著降低了ova诱导的血浆ige水平的增加，证实了当与f组合时b也具有阻止ige介导的免疫反应的功效。
[0185]
在第二组实验中，我们测试了fb的鼻内功效。
[0186]
如通过penh测量所评估的那样，ova诱导的过敏性哮喘导致气道反应性增加，以e
max
或auc分析，在经0.3、1或3nmol/动物/天的fb处理的动物中消除了这种反应。为方便比较，当以3nmol/动物的剂量给药时，f仅部分降低了最大反应e
max
，而在该等摩尔剂量下，b没有效果。考虑到当以母体化合物f和b的1/10剂量给药时fb对过敏小鼠中mch诱导的支气管收缩的影响，很明显，fb盐比母体化合物具有优势。
[0187]
正如预期的那样，这种过敏状况的特征还在于募集到支气管肺泡空间的嗜酸性粒细胞数量的增加，这通过所有剂量的fb(显示出明显的剂量效应模式)以及b和f处理都得到了显著控制。此外，3nmol/动物的剂量的fb和b也能有效消除ova诱导的巨噬细胞数量的增加。
[0188]
ova诱导的过敏性哮喘也导致循环白细胞数量的增加，这仅被fb(3nmol/动物的剂量)几乎消除。在所有测试剂量下，通过fb处理也降低了未经处理的过敏小鼠中增加的循环嗜酸性粒细胞，这显示出剂量依赖性模式(在最高剂量下，循环嗜酸性粒细胞的数量甚至低于对照的假手术组动物)。循环巨噬细胞也是如此，即使在0.3nmol/动物的剂量下也观察到这种有效的降低作用，而b在3nmol/动物剂量下仅引起循环巨噬细胞的轻度减少，f则没有任何作用。
[0189]
值得一提的是，根据先前发表的使用了我们的卵清蛋白诱导的小鼠哮喘模型的结果计算了化合物的剂量。关于福莫特罗，剂量范围为0.5至3.8μg/动物，而布地奈德吸入的常用剂量范围为8-75μg/动物。这样，很明显，本研究中使用的f剂量(3nmol/动物相当于1.03μg/动物)在有疗效范围的最低值内，并且相同摩尔剂量的布地奈德(相当于1.53μg/动物)远远低于治疗剂量范围。考虑到f和b的摩尔比为1:1，我们根据f的剂量确定fb使用的剂量(否则，如果根据b的通常使用剂量考虑摩尔剂量，则应该出现由f引起的全身效应，主要是心脏效应)。
[0190]
通过这种方式，考虑到所测试最低fb剂量显示出显著的有益效果(无论是在呼吸功能方面，还是在循环白细胞数量和肺部细胞募集方面)，这与单独b或f相当甚至更好。我们认为f和b之间的积极的协同作用解释了化合物fb在我们的ova诱导的过敏性哮喘小鼠模型中的有益作用。
[0191]
考虑到由乙酰甲胆碱引起的支气管收缩反应(通过penh功能评估)，实验组iii的结果表明，对于使用最低剂量的布地奈德21-磷酸酯(3nmol/动物/天)所观察到的有益治疗效果，当施用布地奈德时，即使用更高的摩尔剂量(即3和10nmol/动物/天)，该效果也不存在。在白细胞募集到支气管肺泡空间(通过灌洗评估)，特别是嗜酸性粒细胞(这是参与过敏反应的主要白细胞类型)以及巨噬细胞甚至总白细胞中观察到类似的情况。
[0192]
考虑到皮肤水肿，实验组iv的结果表明bud对bk或c48/80均无效。相反，bud 21-p显著降低bk反应并显著抑制c48/80诱导的水肿。
[0193]
总之，这些事实清楚地证明了布地奈德21-磷酸酯比母体布地奈德在ova诱导的过敏性哮喘和皮肤的诱导水肿的小鼠中更有效地发挥其有益作用。
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