一种细菌素抑菌组合物及其制备方法与应用

1.本发明属于食品保鲜技术领域，涉及一种细菌素抑菌组合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.当前，我国主要的食品安全问题是食品本身的腐败变质，食品加工过程中的致病菌等微生物的控制已然成为急需解决的难题。随着国民生活质量的不断改善，食品添加剂的使用变得更加严苛，因为传统的化学防腐剂具有一定的毒性，而研究表明了细菌素是无毒无害，且具有不易产生耐药性的特点，故其可能成为未来化学防腐剂的替代品。
3.细菌素是由细菌产生的抗生代谢产物，是一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。近年来，由于抗生素的滥用，导致了细菌产生了耐药性等问题，迫切需要寻找一种无公害，不易产生耐药性的天然抑菌物质，而细菌素就具备了这样的特点，因而成为了研究热门话题。nisin是目前唯一运用在食品防腐方面的乳酸菌细菌素，被广泛运用在食品加工和保藏，但其仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，抑菌谱较窄，因而极大地限制了nisin在食品防腐保鲜中的应用。且抑菌素单独使用时，往往抑菌保鲜效果也较差。此外，鸡肉因其具有营养价值高，价格低廉的特点而受到了广大人民的追捧，但又因其营养丰富和含水量高，容易受到腐败微生物的污染，导致冷鲜鸡肉的保藏期非常短。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有更佳抑菌效果，可以应用于食品保鲜中的细菌素抑菌组合物及其制备方法。
5.本发明的另一目的是提供上述细菌素抑菌组合物在鸡肉保鲜中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种细菌素抑菌组合物，包括以下质量份的组分：0.2～2份细菌素、0.1～20份天然抑菌剂；
7.所述天然抑菌剂为茶多酚、柚子精油中的至少一种。
8.化学防腐剂大多含有毒性，容易危害人体健康，并且可能产生其它品质方面的问题，而天然防腐剂来源于动植物或微生物体内，通过提取或发酵加工制成，添加天然防腐剂的食品相对来说更具有安全性，也更容易受消费者的青睐。天然防腐物质主要通过抑制氧化作用、抑制微生物繁殖、改进感官等来实现防腐目的，目前天然防腐剂有很多，常见的有植物精油、茶多酚、黄酮类化合物、柠檬苦素类似物等，此类物质均具有纯天然无公害、对特定菌株有较好的抑菌效果等优点。本发明选用柚子精油、茶多酚分别与细菌素复配。
9.更优选地，所述细菌素抑菌组合物，包括以下质量份的组分：1.5份细菌素、10份柚子精油。
10.更优选地，所述细菌素抑菌组合物，包括以下质量份的组分：1.5份细菌素、0.2份茶多酚。
11.更优选地，所述细菌素从乳酸菌中提取，所述细菌素的制备方法包括以下步骤：
(1)将乳酸菌接种于mrs肉汤培养基中，置于恒温摇床培养箱中，摇床振荡培养，取其发酵液；(2)将菌种发酵液在4℃下，离心，取上清液；(3)将上清液经60％～75％饱和硫酸铵进行沉淀，离心，取沉淀；(4)将沉淀用透析袋扎好，置于蒸馏水或纯净水中搅拌过夜，冷冻干燥得到细菌素。
12.本发明所述细菌素可以抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌，所述革兰氏阳性菌包括枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。
13.鸡肉产品在屠宰、运输、销售过程中都可能腐败变质，受到许多因素的影响，包括加工操作存在的漏洞、环境的污染等。很容易使病原微生物污染鸡肉，引起食源性疾病甚至造成人体食物中毒，严重威胁到消费者的生命健康安全。导致鸡肉腐败的主要致病菌和腐败菌包括大肠杆菌、假单胞杆菌和金黄色葡萄球菌。大肠杆菌可以加速鸡肉脂肪的氧化，且因为其具有氨酸脱羧酶的活性，因此被污染的食品会产生组胺，从而导致过敏性食物中毒；假单胞杆菌具有降解碳氢化合物的能力，容易导致食物腐败变质，因此具有致病性；金黄色葡萄球菌主要起源于禽肉本身，拥有在细胞生物膜内快速增长的能力。
14.更优选地，所述乳酸菌来源于海洋动物，将海洋动物用无菌水处理，取其胃肠道，用无菌生理盐水浸泡，均质后制得悬液，取悬液进行10-1-10-5
梯度稀释获得肠道微生物原液；
15.所述海洋动物为金仓鱼、鯆鱼、石斑鱼、小黄鱼、马鲛鱼、方斑东风螺中的至少一种。
16.更优选地，所述乳酸菌的分离与鉴定方法包括以下步骤：
17.(1)选用含有不同溶解钙浓度的mrs培养基进行乳酸菌的分离：取适宜稀释度的菌悬液分别涂布于含0.01～0.1％caco3的mrs培养基上培养，选取有溶钙圈的菌为分离目的菌；
18.所述mrs培养基的配方包括以下组分：10～20g蛋白胨、5～10g牛肉粉、4～8g酵母粉、2～4g葡萄糖、1～2ml吐温80、2～4g磷酸氢二钾、5～10g乙酸钠、2～4g柠檬酸三铵、0.2～0.4g硫酸镁、0.05～0.1g硫酸锰、15～30g琼脂粉、1～2l蒸馏水；
19.(2)革兰氏染色为阳性；
20.(3)过氧化氢酶反应：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加1～6％h2o2，立即观察结果，不产气泡为阴性，选取阴性的菌；
21.(4)发酵液的ph为3.9；
22.(5)16s rrna分子生物学鉴定；
23.(6)从ncbi数据库对抗菌活性乳酸菌的16s rrna基因序列进行相似性搜索，所述乳酸菌属于明串珠菌属、戊糖片球菌属、魏氏斯菌属、粪肠珠菌属中的至少一种。
24.本发明所述明串珠菌属乳酸菌(记为乳酸菌a)、戊糖片球菌属乳酸菌(记为乳酸菌b)，魏氏斯菌属乳酸菌(记为乳酸菌c)，粪肠珠菌属乳酸菌(记为乳酸菌2h)。
25.所述乳酸菌a的16s rrna分子生物学鉴定：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’与5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’。
26.更优选地，所述乳酸菌的筛选方法包括以下步骤：(1)按照1～4％的接种量将乳酸菌接入mrs肉汤培养基中，振荡培养，0～48h取发酵液；(2)将菌种发酵液离心，取上清；(3)用牛津杯法测定发酵上清液对指示菌的抑菌活性，测定抑菌圈直径大小，筛选出产抑菌物
质的菌株。
27.更优选地，所述细菌素抑菌组合物的制备方法包括以下步骤：将细菌素、天然抑菌剂加入到溶剂中，搅拌均匀，即得细菌素抑菌组合物。
28.更优选地，本发明提供了所述细菌素抑菌组合物在鸡肉保鲜中的应用。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的细菌素抑菌组合物对冷鲜鸡肉具有抑菌效果，是具有较优抑菌效果的细菌素组合物，可以抑制导致鸡肉腐败的主要致病菌和腐败菌，其浸泡处理过的冷鲜鸡肉各项检测数据指标上升速度整体上慢于单独的细菌素抑菌液，能够较好的延长冷鲜鸡肉的保藏期。
附图说明
30.图1为产抑菌物质乳酸菌的筛选结果图。
31.图2为乳酸菌生长曲线图。
32.图3为不同浓度细菌素对指示菌的抑菌效果图。
33.图4为ph值的测定结果图。
34.图5为汁液流失率的测定结果图。
35.图6为色度的测定结果图。
36.图7为菌落总数的测定结果图。
37.图8为挥发性盐基氮的测定结果图。
38.图9为感官评定结果图。
具体实施方式
39.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
40.实施例1
41.从小黄鱼的胃肠道分离乳酸菌，将小黄鱼用无菌水冲洗三次，无菌条件下对小黄鱼进行解剖，取其胃肠道，加入2ml无菌生理盐水浸泡，均质后制得悬液，取悬液进行10-1-10-5
梯度稀释获得肠道微生物原液；
42.乳酸菌的分离与鉴定方法包括以下步骤：
43.(1)将0.1ml不同梯度的菌悬液分别涂布于含0.05％caco3的mrs培养基上，30℃培养，选取有溶钙圈的菌为分离目的菌；
44.所述mrs培养基的配方包括以下组分：10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉、1000ml蒸馏水；
45.(2)革兰氏染色为阳性；
46.(3)过氧化氢酶反应：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3％h2o21滴，立即观察结果，不产气泡为阴性，选取阴性的菌；
47.(4)发酵液的ph为3.9；
48.(5)16s rrna分子生物学鉴定；
49.(6)从ncbi数据库对抗菌活性乳酸菌的16s rrna基因序列进行相似性搜索，所述
乳酸菌属于明串珠菌属、戊糖片球菌属、魏氏斯菌属、粪肠珠菌属中的至少一种。其中，明串珠菌属乳酸菌(记为乳酸菌a)、戊糖片球菌属乳酸菌(记为乳酸菌b)，魏氏斯菌属乳酸菌(记为乳酸菌c)，粪肠珠菌属乳酸菌(记为乳酸菌2h)。
50.乳酸菌的筛选方法包括以下步骤：(1)按照2％的接种量将乳酸菌接入100ml mrs肉汤培养基中，37℃、200r/min摇床振荡培养48h，分别在0、8、16、24、32、40、48h取其发酵液；(2)将菌种发酵液在4℃下，8000r/min离心15min，取上清；(3)用牛津杯法测定发酵上清液在这7个时间段对指示菌的抑菌活性，测定抑菌圈直径大小，筛选出产抑菌物质的菌株。
51.用牛津杯法抑菌实验筛选产抑菌物质的乳酸菌，结果如图1所示，与乳酸菌b、乳酸菌c、乳酸菌2h相比，乳酸菌a发酵上清液对大肠杆菌的抑菌效果最好，所呈现的抑菌圈直径最大，且乳酸菌a对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌作用，均呈现出最佳的抑菌谱。
52.不同发酵时间乳酸菌a发酵上清液的抑菌活性测定：将指示菌接种于100ml lb液体培养基中，37℃培养24h，od
600
为0.8。取指示菌菌悬液1ml，与融化后的lb琼脂培养基混合，待其凝固后，用灭菌后直径为8mm的牛津杯在培养皿上打孔，再往孔中添加乳酸菌a发酵上清液0.1ml，将此平板正面静置于37℃恒温培养箱中培养48h，再分别于0、8、16、24、32、40、48h取其发酵液，测量不同时间段其抑菌圈大小及测定其发酵液的od
600
值。图2为乳酸菌a生长曲线，在40h乳酸菌a发酵上清液所表现出的抑菌活性最佳。
53.产抑菌物质菌株的检测方法：
54.1.抗菌活性：指示菌菌悬液1ml，与lb琼脂培养基混合凝固后，用灭菌后的牛津杯在培养皿上打孔，再往孔中添加100μl乳酸菌发酵上清液，将平板置于37℃恒温培养箱中，48h后测其抑菌圈大小，见表1。
55.表1
56.指示菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌抑菌圈直径(mm)15.0
±
0.219.0
±
0.1212.5
±
0.22
57.抑菌圈直径都未减掉牛津杯直径(8mm)。
58.2.酸的排除
59.乳酸菌在代谢发酵时不仅能够代谢产生细菌素，还会代谢产生某些有机酸，如乙酸、乳酸等对细菌也有一定的抑制效果。为排除并确定乳酸菌产抑菌物质的性质，配制0.1mol/l的盐酸、乙酸以及乳酸，用浓度为1mol/l的naoh溶液将乙酸、乳酸及盐酸ph调整至与发酵上清液相同的ph(ph＝3.9)，并用发酵上清液作为对照，采用与牛津杯法进行抑菌实验，测量其抑菌圈直径，见表2。
60.表2
[0061][0062]
抑菌圈直径都已减掉牛津杯直径(8mm)。
[0063]
3.过氧化氢排除实验
[0064]
取乳酸菌的发酵上清液10ml，用浓度1.0mol/l的hcl、naoh溶液将其上清液ph调至
过氧化氢酶的最适ph(ph＝7.0)，并按其最终浓度为1.0mg/ml的量加入乳酸菌上清液中；将其放置于恒温水浴锅中保温2小时，再用1.0mol/l的naoh、hcl溶液将ph调回乳酸菌上清液的初始ph(ph＝3.9)，并以未加入过氧化氢酶处理的发酵上清液为对照组，采用牛津杯法进行实验。测量其抑菌圈直径，见表3。
[0065]
表3
[0066] 空白过氧化氢酶上清液抑菌圈直径(mm)06.77
±
0.217.33
±
0.24
[0067]
抑菌圈直径都已减掉牛津杯直径(8mm)。
[0068]
4.蛋白酶敏感性实验
[0069]
取乳酸菌上清10ml，用1.0mol/l的氢氧化钠、盐酸将其上清液ph分别调至胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适ph(胰蛋白酶ph＝7.8、胃蛋白酶ph＝2.0、木瓜蛋白酶ph＝7.0)，并按最终浓度为1.0mg/ml的量加入乳酸菌上清中，将其放置于恒温水浴锅中保温2小时，然后在80℃下灭活10min。再用1.0mol/l的氢氧化钠、盐酸溶液将其上清液ph调回其初始的ph，并以未加入蛋白酶处理的上清液为对照组，按照牛津杯方法测定，确定乳酸菌抑菌物质的抑菌作用受蛋白酶的影响。采用牛津杯法进行实验。测量其抑菌圈直径，见表4。
[0070]
表4
[0071][0072]
抑菌圈直径都已减掉牛津杯直径(8mm)。
[0073]
实施例2
[0074]
细菌素的制备：(1)将实施例1所述乳酸菌a接种于500ml mrs肉汤培养基中，置于37℃恒温摇床培养箱中，200r/min摇床振荡培养40h，取其发酵液；(2)将菌种发酵液在4℃下，8000r/min离心15min，取上清液；(3)将上清液经60％～75％饱和硫酸铵进行沉淀，8000r/min离心15min，取沉淀；(4)将沉淀用透析袋扎好，置于蒸馏水或纯净水中搅拌过夜，冷冻干燥得到细菌素。
[0075]
用牛津杯法抑菌实验筛选细菌素抑菌液最佳浓度，结果如图3所示，当细菌素的质量份为1.5份时，对指示菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直径大小均值达到了11.43mm。
[0076]
将制得的细菌素溶于无菌去离子水中，搅拌均匀，配置成质量份为1.5份的细菌素抑菌液。
[0077]
检测细菌素抑菌液的抑菌效果：
[0078]
(一)ph值的测定
[0079]
称取2g上述处理后的肉样置于准备好的研钵中，加入18ml去离子水，进行充分研磨后，于1d、3d、5d、7d、9d用ph计测量浆液的ph值。
[0080]
(二)汁液流失率的测定
[0081]
依据自然流失法，浸泡肉样前取一个干净的保鲜袋，测其质量(m3)，将肉样放进密封冷藏。称量保鲜袋和肉样的质量(m1)，剪开保鲜袋后，取出肉样，放在感官评定台上。冷藏期间留出的汁液仍留在保鲜袋中，称取盛有汁液的保鲜袋的质量(m2)，计算汁液流失率
(w)。根据以下公式计算出汁液流失率：
[0082][0083]
式中：w：汁液流失率(％)；m1：包装袋和肉的质量(g)；m2：盛有汁液的包装袋质量(g)；m3：包装袋的质量(g)。
[0084]
(三)色度的测定
[0085]
取一定量肉样于透明玻璃平板上，将肉样均匀铺平，进行测定时，先进行白板校正，再用黑板校正，对肉样不同位置进行测定，并记录肉样亮度l*的变化，l*代表黑白，即肉的白度，“ ”代表偏白,“－”表示偏暗。
[0086]
(四)菌落总数的测定
[0087]
参照gb4789.2-2016标准严格进行测定，分别于1d、3d、5d、7d、9d测定菌落总数，记录实验数据。
[0088]
(五)挥发性盐基氮(tvb-n)的测定
[0089]
参照gb5009.228—2016严格进行实验操作，分别于1d、3d、5d、7d、9d测定挥发性盐基氮(tvb-n)，记录实验数据。评价标准：一级鲜度tvb-n≤15mg/100g，二级鲜度15mg/100g＜tvb-n≤20mg/100g，变质肉tvb-n＞20mg/100g。
[0090]
(六)感官评定
[0091]
由具备相关知识和经验的6人组成的感评小组对肉的色泽、气味、弹性进行感官评定，采用5级评分法。具体见表5。
[0092]
表5
[0093][0094]
实施例3
[0095]
细菌素-柚子精油组合物的制备：将细菌素、柚子精油溶于无菌去离子水中，搅拌均匀，配置成质量份为1.5份细菌素、10份柚子精油的细菌素-柚子精油组合物。
[0096]
检测细菌素-柚子精油组合物的抑菌效果，检测方法同实施例2。
[0097]
实施例4
[0098]
细菌素-茶多酚组合物的制备：将细菌素、茶多酚溶于无菌去离子水中，搅拌均匀，配置成质量份为1.5份细菌素、0.2份茶多酚的细菌素-茶多酚组合物。
[0099]
检测细菌素-茶多酚组合物的抑菌效果，检测方法同实施例2。
[0100]
实施例5
[0101]
乳酸链球菌素抑菌液的制备：将乳酸链球菌素溶于无菌去离子水中，配置成质量浓度为40mg/l的乳酸链球菌素抑菌液。
[0102]
检测乳酸链球菌素抑菌液的抑菌效果，检测方法同实施例2。
[0103]
对比例1
[0104]
空白对照组的制备：取等量的蒸馏水进行试验对照。
[0105]
检测空白对照组的抑菌效果，检测方法同实施例2。
[0106]
效果例1
[0107]
对实施例2～5及对比例1进行ph值的测定，结果如图4所示，随着储藏时间的增加，对比例和实施例中的鸡肉的ph值均呈上升趋势，但细菌素的ph值低于空白对照组，说明细菌素具有一定的保鲜效果，且保鲜效果较细菌素-茶多酚组合物、乳酸链球菌素强，但较细菌素-柚子精油组合物弱。在第9d时，细菌素-柚子精油组合物的ph值最低，说明细菌素-柚子精油组合物呈现出最佳的抑菌保鲜效果。
[0108]
效果例2
[0109]
对实施例2～5及对比例1进行汁液流失率的测定，结果如图5所示，在1-9d的储藏期间，对照组的汁液流失率增加了32.47％，较其他组别变化最大，第9d达到了33％。细菌素-柚子精油组合物的汁液流失率变化最小，只增加了25.71％，说明细菌素-柚子精油组合物对冷鲜鸡肉的抑菌保鲜效果最好。
[0110]
效果例3
[0111]
对实施例2～5及对比例1进行汁液色度的测定，结果如图6所示，对照组的亮度值下降最明显，细菌素-柚子精油组合物的亮度整体上高于其他几组，尤其是第5d之后，该组亮度均高于其他组别。表明细菌素-柚子精油组合物对冷鲜鸡肉的保鲜效果最佳。
[0112]
效果例4
[0113]
对实施例2～5及对比例1进行菌落总数的测定，结果如图7所示，随着储藏时间的增加，对照组和实验组菌落总数均呈上升趋势，其中，对照组变化最明显，在储藏第7d，对照组菌落总数的对数值已经超过了6.0，根据冷鲜肉国家标准，菌落总数的对数值》6.0，说明肉变质。在储藏第9d时，所有组别菌落总数的对数值均超过6.0，均已成为变质肉，对照组菌落总数对数值超过了8.0，呈现明显的腐败迹象，而乳酸链球菌素抑菌液和细菌素-柚子精油组合物此时的菌落总数最少，说明其对冷鲜鸡肉的保鲜效果较好。
[0114]
效果例5
[0115]
对实施例2～5及对比例1进行挥发性盐基氮(tvb-n)的测定，结果如图8所示，对照组和实验组冷鲜鸡肉的tvb-n值曲线均随着时间的增加呈现正增长的趋势。在第1-3d的储藏期间，对照组和实验组冷鲜鸡肉均处于一级鲜度；在第3-5d的储藏期间，细菌素-茶多酚组合物、细菌素-柚子精油组合物的tvb-n值分别为10.54和13.23，此时的鸡肉均处于一级鲜度范围，而其它组则已处在二级鲜度范围。到了第7d，所有组合均处在二级鲜度范围。在第9d时，对照组的tvb-n值变化最大，第1d增加了25.31mg/100g，除了乳酸链球菌素抑菌液和细菌素-柚子精油组合物仍处在二级鲜度范围外，其余均已成为变质肉。说明乳酸链球菌素抑菌液和细菌素-柚子精油组合物对冷鲜鸡肉的保鲜效果较佳。
[0116]
效果例6
[0117]
对实施例2～5及对比例1进行感官评定，结果如图9所示，随着时间的增加，在处理期内的冷鲜鸡肉各项指标的感官得分逐渐下降，尤其是对照组感官评分变化最明显，在第1-7d始终处于下降趋势。但是，细菌素-柚子精油组合物到第9d时仍然能够保持较高的感官得分，较其他组别高，说明细菌素-柚子精油组合物可以有效的延缓冷鲜鸡劣变。
[0118]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。