细胞衰老抑制用组合物及抑制细胞衰老的方法与流程

1.本发明涉及细胞衰老抑制用组合物。此外，本发明还涉及抑制细胞衰老的方法等。


背景技术：

2.细胞衰老是指细胞的增殖不可逆地停止的状态。例如，对于人类等哺乳类的正常的体细胞，可分裂的次数有限，重复细胞分裂达到一定次数后，细胞分裂会不可逆地停止。
3.与细胞凋亡不同，发生细胞衰老的细胞(衰老细胞)不会自行死亡。因此，伴随年龄增加，衰老细胞在组织及器官中累积(非专利文献1)。衰老细胞不仅细胞周期停止，且其作为细胞的功能也降低。此外，因由衰老细胞分泌的生理活性因子而对周围的正常细胞带来妨碍，引起脏器的功能降低等。作为用于抑制细胞衰老的技术，例如专利文献1中记载有含有虾青素及烟酸生育酚酯作为有效成分的间叶类干细胞的细胞衰老抑制剂。
4.作为与细胞衰老相关的标志物，已知衰老相关酸性β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase：sa-β-gal)等。
5.专利文献
6.专利文献1：日本特开2019-218377号公报
7.非专利文献
8.非专利文献1：herbig u，ferreira m，condel l，carey d，sedivy jm.cellular senescence in aging primates.science.2006；311(5765)：1257-1257.


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供可有效抑制细胞衰老的细胞衰老抑制用组合物。此外，本发明的目的还在于提供抑制细胞衰老的方法。
10.本发明者等为了解决上述课题进行深入研究，结果发现芝麻素类具有抑制细胞衰老的作用。
11.本发明虽不限定于这些，但包含以下细胞衰老抑制用组合物、抑制细胞衰老的方法等。
12.[1]一种细胞衰老抑制用组合物，其特征在于，含有1种以上的芝麻素类作为有效成分。
[0013]
[2]根据上述[1]所述的组合物，其特征在于，1种以上的芝麻素类为芝麻素及/或表芝麻素。
[0014]
[3]根据上述[1]或[2]所述的组合物，其特征在于，为口服用组合物。
[0015]
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的组合物，其特征在于，为饮食品。
[0016]
[5]根据上述[1]或[2]所述的组合物，其特征在于，为皮肤外用剂。
[0017]
[6]根据上述[5]所述的组合物，其特征在于，为化妆料。
[0018]
[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的组合物，其特征在于，附有选自“抑制细胞衰老”、“抑制衰老细胞化”、“预防细胞衰老”、“不使衰老细胞产生”及“抑制衰老细胞的增
加”中的1种以上的标示。
[0019]
[8]一种抑制细胞衰老的方法，其特征在于，投用1种以上的芝麻素类。
[0020]
[9]一种应用，其特征在于，将1种以上的芝麻素类用于抑制细胞衰老。
[0021]
根据本发明，可提供可有效抑制细胞衰老的细胞衰老抑制用组合物。此外，根据本发明，可提供抑制细胞衰老的方法。
附图说明
[0022]
图1为表示以过氧化氢进行处理，于添加芝麻素类的培养基或未添加培养基中进行培养的正常人类成纤维细胞的sa-β-gal活性的图表。
具体实施方式
[0023]
本发明的细胞衰老抑制用组合物(以下，有时仅称作本发明的组合物)含有1种以上的芝麻素类作为有效成分。
[0024]
在本发明中，芝麻素类为包括芝麻素及其类似物的化合物的总称。芝麻素为芝麻中所含的主要的木脂素化合物的一种。作为芝麻素类似物，除表芝麻素之外可列举例如日本特开平4-9331号公报中记载的二氧杂双环[3.3.0]辛烷衍生物。作为1种以上的芝麻素类，可单独使用这些化合物的1种，也可使用2种以上。作为芝麻素类的具体例，可例示芝麻素、表芝麻素、芝麻素酚、表芝麻素酚、芝麻酚、芝麻林素等，可单独或混合使用这些的立体异构体或外消旋体。在本发明中，作为1种以上的芝麻素类，可优选使用芝麻素及/或表芝麻素，可更优选使用芝麻素及表芝麻素。使用芝麻素及表芝麻素时，它们的比率并无特别限定，例如芝麻素：表芝麻素(重量比)优选为1:0.1～1:9，更优选为1:0.3～1:3，进一步优选为1:0.5～1:2。
[0025]
本发明中使用的芝麻素类，不因其形态或制造方法等而有任何限制。例如，为芝麻素的情况下，可使用通过公知的方法(例如，日本特开平4-9331号公报中记载的方法)从芝麻油中提取的芝麻素(称作芝麻素提取物或精制物)。此外，也可直接使用市售的芝麻油(液状)。然而，使用芝麻油时，由于有时芝麻油特有的风味在感官上评价不好，从而优选使用从芝麻油中提取的无味无臭的芝麻素提取物(或芝麻素精制物)。此外，使用芝麻油时，由于芝麻素含量低，若想调配优选量的芝麻素，则配方组合物的每单位投用量的体积变得过大，因此有时摄取时会产生不便。尤其，制剂化为用于口服投用时，制剂(片剂、胶囊剂等)变得过大，而在摄取时产生障碍。从而，从摄取量可为少量的观点出发，优选使用来自芝麻油的芝麻素提取物(或芝麻素精制物)。也可通过合成获得芝麻素类。作为其方法，例如，关于芝麻素、表芝麻素，可通过beroza等的方法(j.am.chem.soc.，78，1242(1956))来合成。
[0026]
所谓细胞衰老，如上述一般，是指细胞的增殖停止的状态。个体的衰老的因素涉及许多方面，个体级别的衰老与细胞衰老的关联尚不明确，已发现在老龄的动物中，伴随年龄增加，发生细胞衰老的细胞(衰老细胞)增加，此外，若对人类的原代培养细胞进行继代培养，终会迎来分裂极限，而成为衰老细胞。一般认为衰老细胞分泌的生理活性因子，会对周围的正常细胞带来不良影响。衰老细胞其作为细胞的功能降低。抑制细胞衰老，对预防或改善起因于细胞衰老或衰老细胞的增加的状态或疾病，例如，细胞的功能降低、脏器的功能降低、全身的功能降低等有效。通过在对象中抑制细胞衰老来抑制衰老细胞的增加(累积)，期
待可获得维持细胞的功能、维持脏器的功能、维持全身的功能等效果。
[0027]
如后述实施例所示，由于芝麻素类抑制作为细胞衰老的指标的衰老相关酸性β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)的活性上升，从而具有抑制细胞衰老的作用。芝麻素类可作为用于在对象中抑制细胞衰老的有效成分使用。
[0028]
芝麻素类含于天然物或饮食品中，为有食用经验的化合物。因此从安全性的观点出发，一般认为芝麻素类例如即使每日摄取也少有问题。根据本发明，可提供含有安全性高的物质作为有效成分，具有抑制细胞衰老的作用的细胞衰老抑制用组合物等。
[0029]
本发明中的细胞衰老抑制效果可通过公知的细胞衰老标志物来确认。作为伴随细胞衰老的现象，例如可列举sa-β-gal活性的上升等。在一种方式中，作为本发明的细胞衰老抑制用组合物，优选抑制sa-β-gal活性的上升。
[0030]
在人类等哺乳动物中，通常伴随年龄增加，代谢等降低，从而推测伴随年龄增加，衰老细胞的除去速度变慢。一般认为抑制细胞衰老，例如在中老年者中对于抑制衰老细胞的增加特别有效。中老年者包含高龄者。
[0031]
在人类等的对象中，通过抑制细胞衰老，可抑制对象的衰老细胞的增加。在一种方式中，本发明的组合物可用于预防或改善细胞的功能降低、脏器的功能降低、全身的功能降低等状态或疾病。在一种方式中，本发明的组合物可用于通过抑制细胞衰老，来预防或改善伴随年龄增加的脏器的功能降低、伴随年龄增加的全身的功能降低等。
[0032]
本说明书中预防包含：防止发病、延迟发病、降低发病率、降低发病的风险等。状态或疾病的改善包含：从状态或疾病中恢复、减轻状态或疾病的症状、使状态或疾病的症状好转、延缓、防止状态或疾病的发展等。
[0033]
本发明的细胞衰老抑制用组合物可适用于治疗性用途(医疗用途)或非治疗性用途(非医疗用途)的任一种。所谓非治疗性，是指不包含医疗行为，即人类的手术、治疗或诊断的概念。
[0034]
本发明的细胞衰老抑制用组合物，例如可制成饮食品、化妆料、医药品、医药部外品、饲料等形态。就本发明的组合物而言，其自身可为用于抑制细胞衰老的饮食品、化妆料、医药品、医药部外品、饲料等，也可为调配于这些中而使用的材料或制剂等。
[0035]
本发明的细胞衰老抑制用组合物，作为一个例子，可以制剂的方式提供，但不限定于本方式。可将该制剂直接作为组合物提供，或作为含有该制剂的组合物提供。作为本发明的一种方式，本发明的组合物也可称作细胞衰老抑制剂。
[0036]
本发明的细胞衰老抑制用组合物为口服用组合物或非口服用组合物的任一种均可。在一种方式中，本发明的组合物优选为口服用组合物。作为口服用组合物，可列举饮食品、口服用的医药品、医药部外品、饲料，优选为饮食品或口服用医药品，更优选为饮食品。
[0037]
在另一种方式中，细胞衰老抑制用组合物可作为皮肤外用剂(皮肤外用组合物)使用。皮肤外用剂包括化妆料、医药品、医药部外品等，优选为化妆料。在一种方式中，将本发明的组合物用于抑制皮肤的细胞衰老时，优选将该组合物制成皮肤外用剂，更优选化妆料。
[0038]
本发明的细胞衰老抑制用组合物，只要不损害本发明的效果，除1种以上的芝麻素类外，可含有任意的添加剂、任意的成分。这些添加剂及成分可根据组合物的形态等进行选择，可使用一般的可用于饮食品、化妆料、医药品、医药部外品、饲料等中的物质。将本发明的组合物制成饮食品、化妆料、医药品、医药部外品、饲料等时，其制造方法并无特别限定，
可通过一般的方法来制造。
[0039]
例如将本发明的细胞衰老抑制用组合物制成饮食品时，可向1种以上的芝麻素类中调配饮食品中可使用的成分(例如，食品材料，根据需要使用的食品添加物等)制成各种饮食品。饮食品并无特别限定，例如可列举一般性的饮食品、健康食品、健康饮料、功能性标示食品、特定保健用食品、健康辅助食品、患者用饮食品等。上述健康食品、功能性标示食品、特定保健用食品、健康辅助食品等可以例如细粒剂、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、咀嚼剂、干糖浆剂、糖浆剂、液剂、饮料、流食等的各种制剂方式使用。
[0040]
将本发明的细胞衰老抑制用组合物制成化妆料时，可向1种以上的芝麻素类中调配可用于化妆料的成分(例如，化妆料所允许的载体、添加剂等)制成各种化妆料。化妆料的制品形态并无特别限定，例如，可列举化妆水、美容液、面膜、乳液、乳霜、防晒品等护肤化妆料等。
[0041]
将本发明的细胞衰老抑制用组合物制成医药品或医药部外品时，例如，可向1种以上的芝麻素类中调配药理学允许的载体，根据需要而添加的添加剂等，制备各种剂型的医药品或医药部外品。这样的载体、添加剂等，为可用于医药品或医药部外品的药理学上允许的物质即可，例如，可列举赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、着色剂等的1种或2种以上。作为医药品或医药部外品的投用(摄取)方式，可列举口服或非口服(经皮、经粘膜、经肠、注射等)投用的方式。在一种方式中，将本发明的组合物制成医药品或医药部外品时，优选制成口服用医药品或医药部外品。作为用于口服投用的剂型，可列举液剂、片剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片剂、胶囊剂、悬浊液、乳剂、咀嚼剂等。
[0042]
在另一种方式中，医药品或医药部外品优选制成皮肤外用剂。皮肤外用剂的剂型等并无特别限定，例如可制成溶液、乳液、乳霜、凝胶、粉末、气雾式药剂、喷雾、胶囊及片剂等任意的形态。
[0043]
医药品也可为非人类动物用医药。
[0044]
将本发明的细胞衰老抑制用组合物制成饲料时，将1种以上的芝麻素类调配于饲料中即可。饲料也包括饲料添加剂。作为饲料，例如可列举用于牛、猪、鸡、羊、马等的家畜用饲料；用于兔子、大鼠、小鼠等的小动物用饲料；用于狗、猫、小鸟等的宠物食品等。
[0045]
本发明的细胞衰老抑制用组合物中所含的芝麻素类的含量并无特别限定，可根据其形态等进行设定。
[0046]
本发明的组合物中的芝麻素类的总含量，例如，在该组合物中优选0.001重量％以上，更优选0.01重量％以上，进一步优选0.05重量％以上，此外，优选10重量％以下，更优选5重量％以下。在一种方式中，芝麻素类的总含量，在本发明的组合物中优选0.001～10重量％，更优选0.01～5重量％，进一步优选0.05～5重量％。上述总含量，在含有2种以上的芝麻素类的化合物时，为它们的合计含量。
[0047]
本发明的细胞衰老抑制用组合物，可根据其形态或剂型以自身公知的各种方法摄取或投用。在一种方式中，本发明的组合物优选口服摄取(口服投用)。在另一种方式中，将本发明的组合物制成皮肤外用剂时，可适用于皮肤。
[0048]
本发明的细胞衰老抑制用组合物的投用量(也可称作摄取量)并无特别限定。本发明的细胞衰老抑制用组合物的投用量，只要为可获得细胞衰老抑制效果的量即可，根据投用方式、投用方法、对象的体重等适当设定即可。
[0049]
在一种方式中，以人类(成人)为对象通过摄取或投用本发明的细胞衰老抑制用组合物时，芝麻素类的总投用量，每1天，体重每60kg，优选为0.5mg以上，更优选为1mg以上，进一步优选为3mg以上，此外，优选为200mg以下，更优选为100mg以下，进一步优选为80mg以下。在一种方式中，芝麻素类的总投用量，若为人类(成人)，则每1天，体重每60kg，优选为0.5～200mg，更优选为1～100mg，进一步优选为3～80mg。优选将上述量分为1天1次以上，例如1天1次或多次(例如2～3次)来摄取或投用。在一种方式中，优选使人类通过口服摄取或向其投用上述量的芝麻素类。在一种方式中，作为芝麻素及表芝麻素的总投用量，每1天，体重每60kg，使人类(成人)通过口服摄取或向其投用优选为0.5～200mg，更优选为1～100mg，进一步优选为3～80mg的芝麻素及/或表芝麻素。在一种方式中，本发明的细胞衰老抑制用组合物，可用于使人类，体重每60kg，每1天摄取或对其投用上述量的芝麻素类。上述总投用量，在使用2种以上的芝麻素类的化合物时，为它们的合计量。
[0050]
本发明的细胞衰老抑制用组合物优选持续摄取或投用。芝麻素类通过持续性摄取或投用，而期待获得更高的细胞衰老抑制效果。在一种方式中，本发明的细胞衰老抑制用组合物，优选持续1周以上，更优选持续4周以上，进一步优选持续8周以上，特别优选持续12周以上，进行摄取或投用。
[0051]
摄取或投用本发明的细胞衰老抑制用组合物的对象(也可称作投用对象)并无特别限定。优选为人类或非人类哺乳动物，更优选为人类。
[0052]
在一种方式中，作为投用对象，可列举需要或希望抑制细胞衰老的对象等。作为这样的对象，例如，可列举中老年者等。在一种方式中，本发明的组合物适合作为中老年者用的细胞衰老抑制用组合物使用。中老年者，例如可为40岁以上的人类。在一种方式中，中老年者中，作为对象优选高龄者。高龄者例如可为60岁以上或65岁以上的人类。投用对象可为健康者。本发明的组合物，例如也可以通过抑制细胞衰老而可期待预防或改善的状态或疾病的预防等为目的，来对健康者使用。
[0053]
作为细胞衰老抑制的对象的细胞的种类并无特别限定，例如，可列举成纤维细胞、上皮细胞、表皮细胞、基底细胞、干细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肌成纤维细胞、肌卫星细胞、卫星细胞、成骨细胞、肝细胞、肝星状细胞、肾细胞、间质细胞、血液细胞、免疫系细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、周皮细胞、晶状体细胞、视网膜细胞等。在一种方式中，本发明的细胞衰老抑制用组合物优选用于抑制成纤维细胞的细胞衰老。成纤维细胞为在几乎所有脏器中，对组织的支撑、结构的形成所必需的细胞。
[0054]
本发明的细胞衰老抑制用组合物上也可附有例如选自“抑制细胞衰老”、“抑制衰老细胞化”、“预防细胞衰老”、“不使衰老细胞产生”及“抑制衰老细胞的增加”中的1种或2种以上的功能的标示。
[0055]
在本发明的一种方式中，本发明的组合物优选为附有上述标示的饮食品或皮肤外用剂，更优选为饮食品或化妆料，进一步优选为饮食品。此外，上述标示也可为用于获得上述功能而使用的含义的标示。上述标示可附在组合物本身上，也可附在组合物的容器或包装上。
[0056]
本发明还包含以下方法。
[0057]
一种抑制细胞衰老的方法，其特征在于，投用1种以上的芝麻素类。
[0058]
通过向对象投用1种以上的芝麻素类，可在对象中抑制细胞衰老。
[0059]
上述方法可为治疗性的方法，也可为非治疗性的方法。
[0060]
本发明还包含以下应用。
[0061]
一种应用，其特征在于，将1种以上的芝麻素类用于抑制细胞衰老。
[0062]
1种以上的芝麻素类可用于抑制细胞衰老。
[0063]
上述应用可为治疗性的应用，也可为非治疗性的应用。
[0064]
在上述方法及应用中，芝麻素类及其优选方式与上述本发明的细胞衰老抑制用组合物相同。作为1种以上的芝麻素类，可使用1种芝麻素类的化合物，也可使用2种以上。在上述方法及应用中，优选1日1次以上，例如，1日1次～数次(例如2～3次)向对象投用(或使其摄取)1种以上的芝麻素类。在一种方式中，在上述方法及应用中，优选口服投用(摄取)芝麻素类。在另一种方式中，例如，将芝麻素类用于抑制皮肤的细胞衰老时，优选将1种以上的芝麻素类适用于皮肤。
[0065]
上述应用，优选为人类或非人类哺乳动物，更优选为人类中的应用。
[0066]
上述方法及应用中，只要使用可获得所期望的作用的量(也可称作有效量)的1种以上的芝麻素类即可。芝麻素类的优选投用量或投用对象等与上述本发明的细胞衰老抑制用组合物相同。芝麻素类可直接投用，也可作为含有其的组合物投用。例如，也可使用上述本发明的细胞衰老抑制用组合物。在一种方式中，可将1种以上的芝麻素类用于预防或改善细胞的功能降低、脏器的功能降低、全身的功能降低等状态或疾病。在一种方式中，可将1种以上的芝麻素类用于通过抑制细胞衰老，来预防或改善伴随年龄增加的脏器的功能降低、伴随年龄增加的全身的功能降低等。
[0067]
本发明还包含将1种以上的芝麻素类用于制造细胞衰老抑制用组合物的应用。细胞衰老抑制用组合物及其优选方式等与上述相同。
[0068]
实施例
[0069]
以下，基于实施例对本发明进行更具体地说明。另外，本发明不限定于这些实施例。
[0070]
＜实施例1＞
[0071]
(被检物质制备)
[0072]
将芝麻素类(以芝麻素：表芝麻素的比率(重量比)达到1：1的方式制造的芝麻素及表芝麻素混合物，纯度98％)作为被检物质使用。以芝麻素类达到10mm的方式溶解于二甲基亚砜(dmso)中，以芝麻素类的最终浓度达到0.1、0.3、1、3或10μm的方式，以培养基(添加10％牛胎儿血清(fbs)、1％penicillin-streptomycin mixed solution的dulbecco改良eagle培养基(dmem))进行稀释，作为含有被检物质的培养基。将仅溶解有dmso的培养基作为未添加培养基。
[0073]
(细胞培养)
[0074]
将正常人类成纤维细胞(thermo fishsher scientific公司制，c0135c)使用培养基(添加10％fbs、1％penicillin-streptomycin mixed solution的dmem)以10，000个细胞/0.1ml/孔接种于96孔黑色板中，在co2恒温箱(37℃，5％co2，以下相同)中进行培养。24小时后，将培养基更换为含有被检物质的培养基(芝麻素类浓度：0.1、0.3、1、3或10μm)或未添加培养基(0.1ml)，在co2恒温箱中培养24小时。接着，更换为添加100μm h2o2(过氧化氢)的dmem或未添加h2o2的dmem，在co2恒温箱中进行1小时h2o2处理，来诱导细胞衰老。为了避免获
得直接的抗氧化作用的结果，将含有h2o2的培养基用磷酸缓冲液(pbs)清洗后，更换为含有被检物质的培养基或未添加培养基(0.1ml)，在co2恒温箱中培养3天细胞，用于解析。就含有被检物质的培养基或未添加培养基而言，h2o2处理前及处理后使用被检物质浓度相同的培养基。例如，h2o2处理前用芝麻素类的浓度为0.1μm的培养基进行培养的细胞，在h2o2处理后也用芝麻素类的浓度为0.1μm的含有被检物质的培养基进行培养。h2o2处理前用未添加被检物质的培养基进行培养的细胞，在h2o2处理后也用未添加被检物质的培养基进行培养。
[0075]
(sa-β-gal活性的测定)
[0076]
测定作为细胞衰老的标志物的sa-β-gal的活性。
[0077]
首先，使用cell count normalization kit(株式会社同仁化学研究所)测定细胞数。向各孔中添加100μl的working solution(以quenching buffer对staining solution进行500倍稀释来制备)，在co2恒温箱中孵育30分钟进行核染色，以荧光读板机对荧光强度(cell count rfu)进行测定(ex：350nm，em：461nm)。接着，将各孔以pbs进行清洗后，使用cellular senescence plate assay kit(株式会社同仁化学研究所)测定sa-β-gal活性。向各孔中添加lysis buffer 50μl，于室温下孵育10分钟使细胞溶解。接着，向各孔中添加spider-βgal working solution50μl，于37℃下孵育30分钟后，以荧光读板机对荧光强度(sa-β-gal rfu)进行测定(ex：535nm，em：580nm)。用核染色的荧光值对spider-βgal的荧光值进行校正，计算sa-β-gal活性。显著差异检验通过student’s t-test(vs未经h2o2处理)或dunnet’s test(vs h2o2处理、未添加被检物质)来实施。结果示于图1。
[0078]
(结果)
[0079]
图1为表示以过氧化氢进行处理，于添加被检物质(芝麻素类)的培养基或未添加培养基中进行培养的正常人类成纤维细胞的sa-β-gal活性的图表。图1所示结果为平均
±
标准误差(n＝3)。图1中，#及＊表示存在显著差异(#p＜0.05，student’s t-test(vs未经h2o2处理)，＊p＜0.05，dunnet’s test(vs h2o2处理，未添加被检物质))。纵轴(sa-β-gal rfu/cell count rfu)表示每细胞的sa-β-gal活性。未添加，表示以未添加被检物质的培养基培养的细胞。
[0080]
通过h2o2处理，sa-β-gal活性显著上升。芝麻素类显著抑制sa-β-gal活性的增加。由这些结果表明，芝麻素及表芝麻素具有抑制细胞衰老的效果。