诱导记忆B细胞特异性分化的方法及其用途与流程

诱导记忆b细胞特异性分化的方法及其用途
技术领域
1.本技术要求于2020年1月22日提交的韩国专利申请号10-2020-0008914的优先权，并且将其整体通过引用引入本文。
2.本发明涉及特异性诱导记忆b细胞分化的方法及其用途，更具体地，涉及特异性诱导记忆b细胞分化的方法，包括采用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品，以及使用特定抗原检测对其具有特异性的记忆b细胞的方法。


背景技术：

3.当我们的身体受到病毒或细菌等病原体的攻击，或者遇到我们体内不存在的成分(如疫苗)的抗原时，我们的身体就会对病原体或抗原产生免疫记忆过程。免疫记忆过程被称为记忆应答，但由于我们体内形成的记忆，当我们的身体再次接触病原体或疫苗抗原时，相关的免疫应答发生得更强更快。导致这种免疫记忆应答的关键免疫细胞是b细胞和t细胞，其在获得性免疫中起重要作用。因此，如果这些免疫细胞被很好地分离和分析，那么每个人的免疫记忆的数量和质量可以被测量出来，不仅可以成为判断我们身体过去处于什么样的免疫状况的标准，而且还可以预测在未来病原体入侵的情况下，什么样的免疫防御机制会起作用。
4.然而，在临床实践中，由于细胞诊断技术的复杂性和难度限制，大多数医务人员并不能轻易地获得每位患者的最新免疫信息。目前，最常用的方法是间接测量和确定血液中抗体的方法，该抗体被认为是免疫记忆细胞活性的产物。然而，这种常规方法的缺点在于，抗体反应的维持程度因病原体的种类和宿主的不同而不同，且难以在没有形成抗体的疾病特定时期使用。
5.直接测量免疫记忆细胞的方法也有很大的局限性，最大的原因是体内负责免疫记忆的细胞数量非常少。此外，由于大多数细胞存在于免疫器官(脾脏、淋巴结和肠)中，而不是用于诊断的血液中，因此侵入性样本采集技术或制备过程复杂，需要使用间接成像医疗技术。
6.同时，根据clinical and experimental immunology 177:333-340，已知一种处理各种分化因子混合物以分析抗原特异性记忆b细胞的方法。然而，这种方法的局限性在于诱导分化为未暴露于抗原的幼稚b细胞而呈现非特异性抗原-抗体反应。
7.因此，通过避免需要接触免疫器官等的侵入性方法，并使用最容易获得的血液，只有记忆b细胞非常准确地特异性分化，因此需要一种能够确认是否存在对特定抗原特异的记忆b细胞的方法。
8.技术问题
9.因此，本发明人进行了许多研究以开发能够特异性地仅诱导记忆b细胞分化的方法，该方法使用可以通过非侵入性方法获得的血液，结果发现仅记忆b细胞的分化可以通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品来特异性诱导，进而完成了本发明。
10.本发明的一个目的是提供特异性诱导记忆b细胞分化的方法，包括用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品。
11.本发明的另一个目的是提供检测抗原特异性记忆b细胞的方法，包括(a)用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品；(b)用抗原处理生物学样品；(c)检测与所述抗原特异性结合的抗体。
12.本发明的另一个目的是提供用于特异性诱导记忆b细胞分化的组合物，其包含抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体。
13.本发明的另一个目的是提供用于特异性诱导记忆b细胞分化的组合物，该组合物由抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体组成。
14.本发明的另一个目的是提供用于特异性诱导记忆b细胞分化的组合物，其主要由抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体组成。
15.本发明的再一个目的是提供抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体在制备用于特异性诱导记忆b细胞分化的试剂中的用途。
16.技术方案
17.根据本发明的一个方面，提供了特异性诱导记忆b细胞分化的方法，包括用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品。
18.根据本发明的另一方面，提供了检测抗原特异性记忆b细胞的方法，包括(a)抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品；(b)用抗原处理所述生物学样品；(c)检测与所述抗原特异性结合的抗体。
19.根据本发明的另一方面，提供了用于特异性诱导记忆b细胞分化的组合物，其包含抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体。
20.根据本发明的另一方面，提供了用于特异性诱导记忆b细胞分化的组合物，其由抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体组成。
21.根据本发明的另一方面，提供了用于特异性诱导记忆b细胞分化的组合物，其主要由抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体组成。
22.根据本发明的另一方面，提供了抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体在制备特异性诱导记忆b细胞分化的试剂中的用途。
23.在下文中，将详述本发明。
24.根据本发明的示例性实施方案，证实了当用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理源自从对象获得的血液的pbmc时，诱导了记忆b细胞特异性分化，而幼稚b细胞分化没有被诱导。
25.因此，本发明提供了特异性诱导记忆b细胞分化的方法，包括用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品。
26.在本发明中，“对象”的类型没有特别限定，例如可以是人、猴、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪或山羊，优选是人。
27.特别地，对象可以是待分析过去是否有细菌或病毒感染史的对象。
28.在本发明中，“生物学样品”的类型没有特别限定，只要该生物学样品是从对象获得的样品即可。例如，生物学样品可以选自全血、血浆、血清、外周血单核细胞(pbmc)、尿液、粪便、唾液、痰液、汗液、泪液、组织及其组合，优选全血、血浆、血清、pbmc及其组合，最优选
pbmc。
29.在本发明中，“抗cd3抗体”或“抗cd28抗体”是指针对cd4

t细胞表面表达的cd3或cd28的抗原区域的特异性蛋白质分子。在本发明中，抗体是指特异性结合cd3或cd28以激活cd4

t细胞的抗体，包括所有的多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。
30.本发明的抗体包括抗体分子的功能片段以及具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段，包括fab、f(ab')、f(ab')2、fv等，但不限于此。
31.在本发明中，“配体”是指能够与cd3或cd28结合的各种分子。优选地，配体是指与cd3或cd28结合以激活cd4

t细胞的各种分子。
32.在本发明中，“t细胞”是指本领域定义的t淋巴细胞，且可以包括胸腺细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞或活化t淋巴细胞。
33.在本发明中，术语“cd4

t细胞”是指在其表面表达cd4并与细胞介导的免疫反应相关的t细胞亚群。cd4

t细胞的特征在于刺激后的分泌谱，其可包括细胞因子的分泌，例如ifn-γ、tnf-α、il-2、il-4和il-10。
34.在本发明中，术语“特异性”是指在生物学样品中存在的各种免疫细胞特别是幼稚b细胞和记忆b细胞中，仅诱导记忆b细胞的分化。
35.在本发明中，术语“记忆b细胞”可与记忆b细胞互换使用，是初次感染后在生发中心形成的b细胞亚型之一。当二次感染相同的病原体时，记忆b细胞加速免疫反应并产生强大的抗体介导的免疫反应。
36.在本发明中，“幼稚b细胞”是指从未暴露于抗原的b细胞。当幼稚b细胞暴露于抗原时，幼稚b细胞分化为记忆b细胞和分泌抗体的浆细胞。
37.在本发明中，“特异性诱导记忆b细胞的分化”是指将不分泌抗体的记忆b细胞转化为分泌针对特定抗原的抗体的浆细胞。当记忆b细胞分化为浆细胞，记忆b细胞响应编程到它们各自记忆中的特定抗原而表达igg和igm。
38.同时，根据本发明的示例性实施方案，证实了在用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理生物学样品之前进一步执行从生物学样品中去除cd8

t细胞的步骤时，记忆b细胞的分化显著改善。
39.因此，本发明提供的方法的特征在于还包括在用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品之前从生物学样品中去除cd8

t细胞的步骤。
40.在本发明中，术语“cd8

t细胞”是指在其表面上表达cd8的t细胞亚群，是mhc i类限制性的，并且作为细胞毒性t细胞起作用。“cd8”分子是在胸腺细胞以及细胞毒性和抑制性t淋巴细胞上发现的分化抗原。cd8抗原是免疫球蛋白超基因系统的成员，是主要组织相容性复合物i类限制性相互作用中的关联识别元件。
41.在本发明中，去除cd8

t细胞的方法没有特别限定，例如可以通过流式细胞术、荧光激活细胞分选(facs)、磁珠、色谱柱等去除。用对细胞表面上的cd8分子有反应的抗体或珠子处理分离的pbmc以使用facs或色谱柱选择性地去除相应的细胞。
42.本发明提供检测抗原特异性记忆b细胞的方法，包括(a)用抗cd3抗体或配体；以及抗cd28抗体或配体处理从对象获得的生物学样品；(b)用抗原处理生物学样品；(c)检测与所述抗原特异性结合的抗体。
43.本发明的方法涉及检测使用上述特异性诱导记忆b细胞分化的方法分化的记忆b细胞分泌的抗体中是否存在特异性识别特定抗原的抗体的方法。
44.由于从对象获得的生物学样品中存在的记忆b细胞是在受试者过去暴露于特定抗原之后形成的，因此在步骤(a)中，生物学样品中存在的记忆b细胞分化为分泌该抗体的浆细胞并响应与所述特定抗原，从而可以确认生物学样品中是否存在针对所述特定抗原的记忆b细胞。即，可以通过确认对象过去是否感染过含有所述抗原的细菌或病毒来建立快速治疗策略。
45.步骤(a)可以参考说明书以相同的方式理解。
46.在本发明中，步骤(b)是诱导由在步骤(a)中分化为分泌抗体的浆细胞的记忆b细胞所分泌的抗体和目标抗原之间的抗原-抗体反应的步骤。
47.在本发明的步骤(b)中，“抗原”的类型没有特别限定，只要该抗原由致病物质，更具体地，细菌或病毒表达即可。
48.抗原可包括肽、蛋白质、核酸、糖、病原体、减毒病原体、灭活病原体、病毒、病毒样颗粒(vlp)、细胞或细胞片段。
[0049]“抗原”的非限制性实例可包括结核分枝杆菌抗原、炭疽抗原、甲型肝炎病毒(hav)抗原、乙型肝炎病毒(hbv)抗原、丙型肝炎病毒(hcv)抗原、人类免疫缺陷病毒(hiv)抗原、流感病毒抗原、单纯疱疹病毒(hsv)抗原、b型流感嗜血杆菌(hib)抗原、脑膜炎奈瑟菌抗原、白喉棒杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风梭菌抗原、人乳头瘤病毒(hpv)抗原、水痘病毒抗原、肠球菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯菌抗原、鲍曼不动杆菌抗原、铜绿假单胞菌抗原、肠杆菌抗原、幽门螺杆菌抗原、疟疾抗原、登革热病毒抗原、mers病毒抗原、寨卡病毒抗原、恙虫病东方体抗原、严重发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(sfts布尼亚病毒)抗原、日本脑炎病毒抗原、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)抗原、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)抗原、埃博拉病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、急性呼吸综合征病毒抗原、西尼罗河病毒抗原、水疱性口炎病毒抗原、新城疫病毒抗原或肺炎球菌抗原。
[0050]
步骤(c)是确认步骤(b)中处理的抗原和由从生物学样品诱导分化的记忆b细胞分泌的抗体是否引起抗原-抗体反应的步骤。
[0051]
步骤(c)中检测抗原-抗体反应的方法可以不受限制地使用，只要该方法是本领域已知的方法，其非限制性实例可以包括elispot、elisa、竞争性elisa、磁珠或免疫层析。优选地，检测抗原-抗体反应的方法可以是elispot。
[0052]
当在步骤(c)中检测到与抗原特异性结合的抗体时，可以确定对象具有表达所述抗原的致病物质，更具体地，细菌或病毒的感染病史。
[0053]
本发明提供了用于特异性诱导记忆b细胞分化的组合物，其包含抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体。
[0054]
本发明的组合物除了抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体外，还可以包括记忆b细胞存活所需的因子。例如，该组合物包括合适的培养基(即，基础、必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo 5，(lonza))，其可含有血清(即胎牛或人血清)、细胞因子或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括表面活性剂、血浆蛋白粉和还原剂如n-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇，但不限于此。除了rpmi 1640、
a1m-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo 1，和添加的氨基酸之外，培养基可以包括优化剂、x-vivo 20、丙酮酸钠和维生素，无血清，或适量补充血清(或血浆)，或激素限定组，和/或足量细胞因子用于t细胞的生长和扩增，但不限于此。
[0055]
本发明提供抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体在制备用于特异性诱导记忆b细胞分化的试剂中的用途。
[0056]
本发明的术语“包含”以与“包含”或“表征”相同的方式使用，并且不排除在组合物或方法中未提及的附加成分或方法步骤。术语“由
……
组成”是指不包括未单独描述的附加要素、步骤或成分等。术语“基本上由
……
组成”是指在组合物或方法的范围内，除了所描述的成分或步骤之外，还包括基本上不影响其基本性质的成分或步骤。
[0057]
有益效果
[0058]
根据本发明的方法，由于仅存在于生物学样品中的记忆b细胞可以被特异性分化，因此可以非常准确和快速地分析提供生物学样品的对象是否有感染含有特定抗原的致病物质的历史。
附图说明
[0059]
图1显示了在用抗cd3和抗cd8抗体处理分离的pbmc后使用elispot检测分泌的igm和igg的结果(免疫受体活性处理组：抗cd3抗体和抗cd8抗体处理组)。
[0060]
图2显示了通过从分离的pbmc中去除cd4

t细胞或cd8

t细胞然后用抗cd3和抗cd8抗体处理，使用elispot来检测分泌的igm和igg的结果。
[0061]
图3a和3b显示了从去除cd8

t细胞然后抗cd3和抗cd8抗体处理的pbmc中去除igd或igg，使用elispot检测分泌的igm和igg的结果。
[0062]
图4显示了在从pbmc中分离幼稚b细胞并以1μg/ml剂量的多克隆激活剂、tlr7/8激动剂(r848)和tlr9激动剂(cpg)处理之后通过elispot实验测量抗体量的结果。
[0063]
图5显示了从已暴露或未暴露于mers抗原的猴子血液中分离pbmc后用以下处理(i)抗cd3和抗cd8抗体(免疫受体活性处理组)，(ii)tlr7/8激动剂(r848)或(iii)tlr9激动剂(cpg)(免疫受体活性处理组：抗cd3抗体和抗cd8抗体处理组，tlr激动剂1：tlr7/8激动剂(r848)，tlr激动剂2：tlr9激动剂(cpg))，使用elispot确认是否分泌igm和igg的结果。
[0064]
图6a和6b显示了通过从已暴露或未暴露于登革热病毒抗原(图6a)或covid-19病毒抗原(图6b)的猴子血液中分离pbmc并去除cd8

t细胞后用抗cd3和抗cd8抗体处理(免疫受体活性处理组)(免疫受体活性处理组：抗cd3抗体和抗cd8抗体处理组)，使用elispot确认是否分泌igm和igg的结果。
[0065]
发明实施例
[0066]
在下文中，将通过以下实施例详描本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于以下实施例。
[0067]
实施例1：外周血单核细胞(pbmc)的分离
[0068]
血液分离自正常人和非人灵长类动物。将edta管中的血液与1xpbs混合，然后在4ml ficoll-hypaque(lymphoprep；axis-shield,1114545)中缓慢分离各层。以4000rpm缓慢离心20分钟后，当分层后，使用移液器收集pbmc的白色条带。将pbmc再次加入1xpbs并以1500rpm离心5分钟，然后去除上清液。此后，加入1ml培养基以释放细胞。使用olympus r1自
动细胞计数器对细胞数进行计数。
[0069]
实施例2：通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理诱导记忆b细胞的分化
[0070]
(1)根据针对pbmc的抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体的处理测定抗体分泌量
[0071]
抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理实施例1中分离的pbmc。
[0072]
将实施例1中分离的pbmc(1x105个细胞/孔)添加到用1μg/ml抗cd3抗体(clone okt3,biolegend cat.no.317302)包被的96孔板中，用1μg/ml抗cd28抗体(clone cd28.2,bd cat.no.555725)处理，然后在37℃、5％co2培养箱中反应3至4天。
[0073]
由于记忆b细胞分泌的抗体由igg和igm类型组成，然后通过elispot方法测量由pbmc样品分泌的igm和igg的量。
[0074]
具体地，将10μg/ml的抗-igg和igm抗体以50ul加入每个板中，然后在4℃包被24小时。将用抗cd3抗体和抗cd28抗体刺激的pbmc加入经包被的板中，然后在37℃、5％co2的培养箱中反应4小时。之后，抗igg-fitc抗体和igm-生物素抗体(southern biotech)在室温下反应2小时，fitc-hrp和strep-ap(ctl)在室温下反应1小时。最后加入蓝色还原剂，室温反应15分钟，测定igm和igg。
[0075]
其结果示于图1。
[0076]
如图1所示，经证实，与未经抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理的pbmc相比，当用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理pbmc后，igg和igm型抗体的分泌量显著增加。即，通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体的处理诱导记忆b细胞的分化，因此可以预期从分化的b细胞中分泌的igg和igm增加。
[0077]
(2)去除cd4

t细胞或cd8

t细胞的pbmc中的记忆b细胞的分化诱导
[0078]
为了优化在实验(1)中用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理诱导记忆b细胞分化的条件，将cd4

t细胞或cd8

t细胞从pbmc中去除，然后通过与上述实验相同的方法用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理。
[0079]
分别通过以下方法从pbmc中去除cd4

t细胞或cd8

t细胞。
[0080]
具体而言，使用抗cd4微珠试剂盒和抗cd8微珠试剂盒(miltenyi biotech,auburn,calif.)分离pbmc-cd4 t细胞(去除了cd4

t细胞的pbmc)和pbmc-cd8 t细胞(去除了cd8

t细胞的pbmc)。将pbmc(1x107个细胞)加入80μl缓冲液(pbs中加入0.5％bsa和2mm edta)，加入20μl cd4微珠或cd8微珠充分混合，然后在4℃反应15分钟。停止反应并以1500rpm离心pbmc 5分钟后，使用10ml缓冲液和ls macs柱(miltenyi biotech,auburn,calif)获得未附着在磁体上的pbmc-cd4 t细胞或pbmc-cd8 t细胞。
[0081]
其结果示于图2。
[0082]
如图2所示，确认了去除了cd4

t细胞的pbmc即使用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理，也完全不分泌抗体。但是，确认了与去除cd8

t细胞的pbmc相比，通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体的处理，抗体的分泌量显著增加。
[0083]
因此，使用去除了cd8

t细胞的pbmc进行了以下实验。
[0084]
(3)确认是否诱导了记忆b细胞特异性分化
[0085]
在现有技术中，由于用于处理以诱导记忆b细胞分化的物质是多克隆激活剂，因此
不仅记忆b细胞而且幼稚b细胞也被分化，因此，不可能仅特异性分化实际上具有针对特定抗原的免疫记忆的b细胞。
[0086]
因此，本发明人旨在通过用抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理pbmc的方法来确认是否仅特异性分化记忆b细胞，而不特异性分化幼稚b细胞。
[0087]
具体而言，使用bd facs aria ii从对应于pbmc的细胞表面分离去除表达igd和igg的细胞的剩余细胞。此后，将分离的细胞(1x105个细胞/孔)添加到前一天用1μg/ml抗cd3抗体(clone okt3，biolegend cat.no.317302)包被的96孔板中，用1μg/ml的抗cd28抗体(clone cd28.2,bd cat.no.555725)处理，然后在37℃、5％co2的培养箱中反应3至4天，然后通过elispot实验测量抗体量。
[0088]
其结果示于图3a和3b。
[0089]
如图3a所示，确认了在去除表面表达igd的细胞的pbmc中，通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理后，igm和igg型抗体的分泌量仍然增加。相比之下，如图3b所示，确认了在去除表面表达igg的细胞的pbmc中，即使通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理后，igm和igg型抗体的分泌也完全没有增加。
[0090]
即，可以看出，即使通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体处理后，表面表达igd的幼稚b细胞也未分化成分泌抗体的细胞，但是通过抗cd3抗体或配体以及抗cd28抗体或配体的处理已经诱导了仅在表面上表达igg的记忆b细胞的分化。
[0091]
多克隆激活剂(先前研究中使用的物质)分化未经历过抗原的幼稚b细胞，从而在表面上产生与特定抗原记忆无关的igm抗体。
[0092]
因此，本发明人试图通过用通常称为多克隆激活剂的tlr激动剂处理pbmc的方法来确认是否存在这种非特异性反应。
[0093]
具体而言，使用bd facs aria ii从对应于pbmc的细胞表面分离代表幼稚b细胞的igd

cd27-细胞。之后，将分离的细胞(1x104个细胞/孔)加入96孔板中，用1μg/ml tlr7/8激动剂(r848)和tlr9激动剂(cpg)处理，然后在37℃、5％co2的培养箱中反应3至4天，之后通过elispot实验测定抗体量。
[0094]
其结果示于图4。
[0095]
如图4所示，证实了用tlr7/8激动剂(r848)和tlr9激动剂(cpg)处理的幼稚b细胞中igm的分泌量显著增加。也就是说，发现多克隆激活剂诱导与抗原特异性记忆无关的幼稚b细胞的分化。
[0096]
实施例3：对特定抗原特异的记忆b细胞的检测
[0097]
在通过实施例1和2建立了仅特异性分化pbmc中的记忆b细胞的方法后，使用上述方法，评估以确定从实际对象分离的生物学样品中的记忆b细胞是否已经暴露于特定抗原。
[0098]
具体而言，分离了在大腿肌肉中三次接种了mers病毒抗原蛋白和佐剂的猴子的pbmc。根据本发明的方法，将分离的猴pbmc(5x105个细胞/孔)添加到前一天包被1μg/ml抗cd3抗体(clone sp34，bd cat.no.557052)的96孔板中，用1μg/ml抗cd28抗体(clone cd28.2，bd cat.no.555725)处理，然后在37℃、5％co2培养箱中反应3至4天。或者，用多克隆激活剂tlr7/8激动剂(r848，tlr激动剂1)或tlr9激动剂(cpg，tlr激动剂2)代替抗cd3抗体和抗cd28抗体处理分离的猴pbmc，然后在37℃、5％co2的培养箱中反应3至4天。
[0099]
此后，通过包被mers特异性蛋白质进行elispot。
[0100]
其结果示于图5。
[0101]
如图5所示，可以确认在根据本发明的方法诱导记忆b细胞分化的猴pbmc中(免疫受体活性处理组)，特异性识别mers抗原的igg(红色编号)和igm(蓝色编号)在暴露于mers病毒的两只猴子的pbmc中准确检测到，但在未暴露于mers病毒的两只猴子的pbmc中未检测到。另一方面，可以确认在根据本发明的方法诱导记忆b细胞的分化的猴pbmc中，特异性识别mers抗原的igg型抗体的分泌比用多克隆激活剂tlr7/8激动剂(r848,tlr agonist1)或tlr9激动剂(cpg,tlr agonist 2)处理的组检测到的显著增加。
[0102]
此外，以与该方法相同的方法，使用在大腿肌肉中三次接种登革热病毒抗原蛋白和佐剂的猴子或感染严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov-2)的猴子的pbmc进行实验。结果，可以确认在暴露于每种病毒抗原的猴pbmc中，准确检测到特异性识别登革热病毒抗原(a)或covid-19病毒抗原(b)的igg(红色编号)和igm(蓝色编号)，并且在未暴露于每种病毒抗原的猴pbmc中，未检测到抗体。
[0103]
工业适用性
[0104]
根据本发明的方法，由于仅存在于生物学样品中的记忆b细胞可以被特异性分化，可以非常准确和快速地分析提供生物学样品的对象是否有感染含有特定抗原的致病物质的历史。