一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用的制作方法

1.本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(nk细胞)是天然免疫系统中非常重要的一类细胞毒性淋巴细胞，它是免疫系统中的第一道防线。nk细胞是一群特殊的细胞，它不同于获得性免疫在发挥功能的时候是需要抗体和主要组织相容性复合体(mhc)的。在哺乳类动物受到病毒感染或者肿瘤侵袭的时候，nk细胞会非常迅速地产生反应。临床实验表明：获得肿瘤患者的免疫细胞后，进行体外刺激、扩增培养后回输到患者体内，可以直接杀伤肿瘤细胞、恢复或增强患者的免疫机能达到抑制肿瘤生长的作用。因此，nk细胞的杀伤力高低对哺乳类动物抗病毒和肿瘤等异常侵袭能力的强弱影响很大。
3.目前，nk细胞用于肿瘤免疫治疗主要是先获得患者的nk细胞，然后体外培养，再回输到患者体内，以发挥治疗作用。但是，有的患者因为机体自身原因，其nk细胞活性较差，杀伤力较低，导致回输后治疗作用不及预期。
4.为了提高回输后的治疗效果，如何在体外培养环节提高nk细胞的杀伤力就显得尤为重要和必要。目前，通常是在体外培养基中添加各种能刺激nk细胞增强杀伤力的活性成分，这些活性成分包括多糖、单抗、多肽和小分子化合物。
5.拓展刺激nk细胞增强杀伤力的活性成分，为nk细胞免疫治疗提供了更多选择。


技术实现要素：

6.本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用。
7.本发明目的通过以下技术方案实现：
8.amara peptide作为增强人自然杀伤细胞杀伤力的活性成分在人自然杀伤细胞体外培养以提高其杀伤力中的应用。活性研究发现，用amara peptide体外刺激人自然杀伤细胞可以有效提高人自然杀伤细胞的杀伤力，具体地：从分子层面，amara peptide促进人自然杀伤细胞中杀伤力核心蛋白cd107a、perforin、granzyme b的表达；从细胞层面，amara peptide增强了人自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
9.amara peptide作为增强人自然杀伤细胞杀伤力的活性成分在制备人自然杀伤细胞培养基中的应用。在人自然杀伤细胞培养基中添加活性成分amara peptide用于人自然杀伤细胞的培养可以提高人自然杀伤细胞的杀伤力。
10.有益技术效果：
11.从分子层面，amara peptide促进人自然杀伤细胞中杀伤力核心蛋白cd107a、perforin、granzyme b的表达；从细胞层面，amara peptide增强了人自然杀伤细胞对肿瘤
细胞的杀伤力。该研究结果证实amara peptide为一种有效的可以增强人自然杀伤细胞杀伤力的活性成分，在制备提高人自然杀伤细胞杀伤力的培养基中具有良好的开发应用前景。
附图说明
12.图1为流式细胞仪测定的nk细胞免疫磁珠分选前后的细胞表型。
13.图2为western blotting结果。
14.图3为各组nk细胞对肿瘤sgc-7901细胞的杀伤力。
具体实施方式
15.一、实验材料
16.人淋巴细胞分离液购自杭州联科生物技术股份有限公司。nk细胞免疫磁珠分选系统购自碧云天生物。nk细胞培养基购自上海雅吉生物科技有限公司。amara peptide购自mce，纯度≥98％。cck-8试剂购自碧云天生物。异硫氰酸荧光素标记的穿孔素单抗、颗粒酶b单抗、cd107a单抗购自北京百奥莱博科技有限公司。sgc-7901细胞购自atcc。
17.二、实验方法
18.1、外周血单个核细胞分离
19.无菌条件下采集适量健康志愿者外周血用于nk细胞制备。在离心管中加入适量人淋巴细胞分离液，再贴着管壁缓慢加入适量外周血，以避免破坏淋巴细胞分离液的液面。在室温条件下894
×
g离心20min。将淡黄色的单个核细胞层吸出置于离心管中，在室温条件下572
×
g离心6min，弃上清后，沉淀即为外周血单个核细胞。
20.2、nk细胞分离纯化
21.将上述外周血单个核细胞用pbs洗涤，按照nk细胞免疫磁珠分选系统操作说明，pbs重悬，计数，取20μl(约1
×
107个)细胞悬液，加入抗cd3免疫磁珠，4℃孵育15min，加入2ml pbs离心洗涤细胞，定容至500μl，缓慢过macs层析柱，冲洗柱子，收集未结合细胞(即cd3-细胞)，pbs洗涤，重复上述步骤，加入抗cd56免疫磁珠，过柱，收集结合于层析柱的细胞，即为cd3-cd56 nk细胞(流式细胞仪测定表型)，pbs重悬，离心洗涤，用nk细胞培养基在37℃、5％co2条件下培养。
22.3、nk细胞分组和干预培养
23.将nk细胞按如下分组干预培养，每2～3d更换一次培养基：
24.对照组：用nk细胞培养基在37℃、5％co2条件下培养；
25.low组：用含5μg/ml amara peptide的nk细胞培养基在37℃、5％co2条件下培养；
26.high组：用含10μg/ml amara peptide的nk细胞培养基在37℃、5％co2条件下培养。
27.4、杀伤力测定(分子层面)
28.取分组干预培养9d的nk细胞，收集细胞，提取总蛋白，bca法进行蛋白定量。各组取40μg总蛋白上样于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加质量分数5％脱脂奶粉，室温低速摇床封闭1h。加稀释的cd107a、perforin、granzyme b、β-actin一抗，4℃摇床孵育过夜。tbst洗膜4次，每次10min。加稀释的igg二抗，室温下孵育2h。加ecl发光液显影，胶片
曝光，洗片，拍照。
29.5、杀伤力测定(细胞层面)
30.靶细胞：将sgc-7901细胞用含10％fbs的rpmi-1640培养基在37℃、5％co2条件下培养，取对数生长期细胞用于试验。
31.效应细胞：上述分组干预培养9d的nk细胞。
32.将靶细胞、效应细胞分别用含10％fbs的rpmi-1640培养基制成5
×
104个/ml和2.5
×
105个/ml的细胞悬液，分别取100μl接种于96孔板中(效靶比5:1)，同时设单效应细胞组、单靶细胞组和空白组，每组设5个复孔，在37℃、5％co2条件下培养48h后，每孔加入10μlcck-8试剂，继续在培养箱中孵育4h，检测450nm处的od值，按如下公式计算对肿瘤细胞的杀伤活性：杀伤力(％)＝[1-(效靶组od值-单效应细胞组od值)/(单靶细胞组od值-空白组od值)]
×
100％。
[0033]
6、统计学分析
[0034]
采用spss 19.0软件进行统计学分析，计量资料以平均值
±
标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验。p《0.05为差异具有统计学意义。
[0035]
三、实验结果
[0036]
1、nk细胞分离纯化
[0037]
图1为流式细胞仪测定的nk细胞免疫磁珠分选前后的细胞表型，分选后cd3-cd56 代表的nk细胞的纯度显著提高(分选前8.7％，分选后99.8％)，nk细胞分离纯化成功。
[0038]
2、杀伤力测定(分子层面)
[0039]
nk细胞分泌的perforin、granzyme b在促使靶细胞死亡的过程中发挥重要作用。cd107a是nk发挥杀伤作用时候脱颗粒的标志物。因此，本领域技术人员通常在分子层面检测这三种蛋白的表达水平评价nk细胞的杀伤力。图2为western blotting结果，该结果清楚显示，与对照组比，low组、high组nk细胞中cd107a、perforin、granzyme b表达均明显提高。
[0040]
3、杀伤力测定(细胞层面)
[0041]
各组nk细胞对肿瘤sgc-7901细胞的杀伤力如表1和图3所示。该结果清楚显示，与对照组比，low组、high组nk细胞对sgc-7901细胞的杀伤力明显提高(*，p《0.05)。
[0042]
表1各组nk细胞对肿瘤sgc-7901细胞的杀伤力
[0043]
组别对照组low组high组杀伤力(％)40.73
±
3.2955.18
±
2.77*79.25
±
3.41*
[0044]
上述试验证明amara peptide具有增强人自然杀伤细胞中杀伤力的作用。具体而言：分子层面，amara peptide促进人自然杀伤细胞中杀伤力核心蛋白cd107a、perforin、granzyme b的表达；细胞层面，amara peptide增强了人自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤力。该试验结果证实amarapeptide为一种有效的可以增强人自然杀伤细胞杀伤力的活性成分。
[0045]
以上实施例是为了具体介绍本发明的实质性内容。本领域技术人员应当知道，不应将本发明保护范围局限于以上具体实施例。