一种具有检测细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的低毒性荧光探针与应用

一种具有检测细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)的低毒性荧光探针与应用
技术领域
1.本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种具有检测细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)的低毒性荧光探针。


背景技术：

2.还原型谷胱甘肽(gsh)是广泛存在于生物细胞中的硫醇物质，在细胞活动过程中起着重要作用，因此检测gsh对疾病的预防具有重要意义。利用纳米材料来构建荧光探针进行gsh检测探针具有高灵敏性，低成本，操作简便等优点，因而受到广泛关注。然而，由于纳米材料荧光探针生物毒性的问题往往限制了其广泛应用和推广。
3.本发明采用氮氧自由基4-(2-bromoacetamido)-2,2,6,6
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tetramethylpiperidine
–
1-oxyl(bractpo)修饰生物分子牛血清白蛋白(bsa)合成了荧光淬灭剂自由基-白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)。之后，将荧光淬灭剂与荧光cdte量子点相结合，成功构建了一种新型低毒性荧光探针(cdte@bsa-bractpo)并用于还原型谷胱甘肽(gsh)的检测。bsa的引入能提高bractpo稳定性的同时，还降低了材料的生物毒性。该探针具有高灵敏性，低成本，操作简便等优点，可应用于细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)的检测。


技术实现要素：

4.本发明的目的是成功构建了一种新型低毒性荧光探针(cdte@bsa-bractpo)并用于还原型谷胱甘肽(gsh)的检测。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供一种具有检测细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)的荧光探针，所述荧光探针为荧光量子点与荧光淬灭剂的纳米复合材料，所述荧光量子点为cdte，所述荧光淬灭剂为自由基与白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)。
7.优选地，所述荧光量子点与荧光淬灭剂的纳米复合材料，所述荧光量子点与荧光淬灭剂的摩尔比为1：1～80。
8.本发明还提供了上述具有检测细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)的荧光探针的功能性，其与细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)复合后，量子点的荧光可以增强。
9.本发明还提供了上述具有检测细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
10.提供cdte量子点溶液；
11.提供nhs与edc水溶液并连续在37℃条件下温和搅拌反应30min；
12.提供自由基与白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)，溶液后继续反应30min，最终得到cdte@bsa-bractpo纳米复合材料。
13.进一步地，本发明还提供了上述具有检测细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)的荧光探针对细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)检测中的应用。
14.本发明还提供了所述的自由基与白蛋白的聚合物，其特征在于，所述自由基为氮氧自由基4-(2-溴乙酰氨基)-2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧(bractpo)，所述白蛋白为牛血清白蛋白(bsa)。
15.优选地，所述的自由基与白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)，其特征在于，所述自由基与白蛋白的摩尔比为10～60：1。
16.本发明还提供了上述的自由基与白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)，其特征在于，其与荧光量子点复合后可以淬灭量子点的荧光。
17.本发明还提供了上述的自由基与白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)，其特征在于，白蛋白的引入能提高bractpo的稳定性，同时还降低了荧光探针的生物毒性。
18.本发明还提供了上述的自由基与白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)的制备方法，包括以下步骤：
19.将牛血清白蛋白(bsa)与生理盐水混合；
20.提供碳酸氢钠；
21.提供氮氧自由基(bractpo)水溶液；
22.提供naoh调节ph；
23.待溶液澄清无沉淀物后，提供hcl调节ph；
24.将得到的bsa@bractpo复合物溶液用针孔滤膜过滤除菌，并进行多次纯化，低温保存。
附图说明
25.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
26.图1为cdte量子点(左)及荧光探针cdte@bsabractpo的tem图。
27.图2为含有0-4.4mm bractpo氮氧自由基的bsa-bractpo复合物与cdte量子点复合后的荧光光谱。
28.图3为引入不同浓度0-60μm的gsh后，cdte@bsa-bractpo纳米复合材料的荧光光谱(左)，及荧光积分拟合曲线(右)。
29.图4为荧光探针的低毒性测试。cdte与氮氧自由基bractpo混合物(cdte bractpo)及荧光探针cdte@bsa-bractpo，分别与正常乳腺细胞hs578bst共培养24h后的细胞活性。
30.图5为荧光探针分别对癌细胞及正常乳腺细胞裂解液还原型谷胱甘肽(gsh)的检测。荧光探针分别与癌细胞及正常乳腺细胞裂解液反应后的荧光光谱(左)，及荧光峰面积对比图(右)，n-甲基马来酰亚胺(nmm)为gsh清除剂。
具体实施方式：
31.本发明还提供了氮氧自由与牛血清白蛋白结合形成聚合物(bsa-bractpo)，制备方法包括以下步骤：
32.提供20～30μmol的牛血清白蛋白与生理盐水混合；
33.提供100mg～150mg的碳酸氢钠和1.0～1.5mmol的氮氧自由基(bractpo))到溶液中；
34.提供naoh调节ph；
35.待溶液澄清无沉淀物后，提供hcl调节ph；
36.将得到的bsa-bractpo聚合物溶液用针孔滤膜过滤除菌。再超滤离心管过滤3次，每次4500rpm，5分钟。
37.本发明在自由基-白蛋白的聚合物(bsa-bractpo)纳米材料基础之耦联cdte量子点，提供了一种荧光探针cdte@bsa-bractpo，制备方法包括以下步骤：
38.提供cdte量子点溶液；
39.提供nhs与edc水溶液，并搅拌2小时以上；
40.提供40
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50mm自由基与白蛋白的聚合物，最终得到cdte@自由基与白蛋白的聚合物，室温下搅拌2小时以上。
41.本发明在形成荧光探针cdte@bsa-bractpo后，进行gsh检测，检测方法包括以下步骤：
42.提供浓度为5-60μm的gsh水溶液；
43.提供cdte@bsa0bractpo溶液，室温搅拌反应30-50min；
44.使用荧光分光光度计，在365nm激发光下记录各组荧光光谱。
45.本发明在形成荧光探针cdte@bsa-bractpo后，进行细胞内gsh检测，检测方法包括以下步骤：
46.提供10％胎牛血清的dmem培养基培养人乳腺癌(mcf-7)和人正常乳腺(hs578bst)细胞；
47.提供各类细胞，进行3次冷冻-融化循环；
48.离心、收集细胞上清液；
49.提供细胞破碎液；
50.提供cdte@bsa-bractpo纳米复合材料溶液，搅拌反应40min；
51.使用荧光分光光度计，在365nm激发光下记录各组荧光光谱。
52.下面结合实施例对本发明提供的bsa-bractpo、cdte@bsa-bractpo纳米复合材料材的制备与检测gsh方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
53.实施例1
54.制备氮氧自由与牛血清白蛋白结合形成聚合物(bsa-bractpo)步骤如下：
55.(1)将22.5μmol的牛血清白蛋白加入到30ml生理盐水中。
56.(2)剧烈搅拌并调节温度到37℃
57.(3)添加126mg的碳酸氢钠和1.35mmol的氮氧自由基(bractpo))到溶液中。
58.(4)使用0.5μm的naoh调节ph到8.0，保持37℃，持续反应1h以上。
59.(5)使用0.5μm的hcl调节ph到7.4
±
0.2.
60.(6)使用0.2μm针孔滤膜过滤
61.(7)使用30kda的超滤离心管过滤3次，每次4500rpm，5分钟。
62.(8)添加126mg的碳酸氢钠和1.35mmol的氮氧自由基(bractpo))到溶液中。
63.(9)使用0.5μm的naoh调节ph到8.0，保持37℃，持续反应1h以上。
64.(10)使用0.5μm的hcl调节ph到7.4
±
0.2.
65.(11)使用0.2μm针孔滤膜过滤
66.(12)使用30kda的超滤离心管过滤3次，每次4500rpm，5分钟。
67.实施例2
68.制备荧光探针cdte@bsa-bractpo步骤如下：
69.(1)取2mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc),和4mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，加入到10ml浓度约为1μm的cdte量子点溶液中，搅拌2小时以上。
70.(2)将含有约44mm氮氧自由基的bsa-bractpo复合物加入到活化后的量子点溶液中，使用pbs定容至20ml。
71.(3)室温下搅拌2小时以上。
72.实施例3
73.荧光探针cdte@bsa-bractpo进行gsh检测步骤如下：
74.(1)取1ml浓度为5μm的gsh水溶液，分别加入到1ml的cdte@bsa0bractpo溶液中，室温搅拌反应40min。
75.(2)使用荧光分光光度计，在365nm激发光下记录各组荧光光谱。
76.实施例4
77.荧光探针cdte@bsa-bractpo进行细胞内gsh检测步骤如下：
78.(1)使用含有10％胎牛血清的dmem培养基培养人乳腺癌(mcf-7)和人正常乳腺(hs578bst)细胞。
79.(2)收集各细胞10mg，加入pbs稀释至10倍
80.(3)进行3次冷冻-融化循环。
81.(4)离心收集细胞上清液。
82.(5)各取200μl细胞破碎液，分别加入到0.5ml的cdte@bsa-bractpo纳米复合材料溶液中，并加1.3ml的pbs缓冲液。
83.(6)分别搅拌反应40min。
84.(7)使用荧光分光光度计，在365nm激发光下记录各组荧光光谱。
85.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。