一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相及其制备方法和应用

1.本发明属于液相色谱固定相材料技术领域，具体涉及一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在当代色谱分析领域，高效液相色谱法是一种应用最广泛的常规分析方法，现已广泛用于食品、农产品、水产品和医药化工等领域。随着样品种类的增多和样品基质的日趋复杂，对色谱分离的条件要求越来越高，而色谱固定相的选择对样品的分离选择性和分离效率起着关键作用。
3.目前，市售的色谱柱主要是单一分离模式，分离的专一性较强，但在特定的条件下存在着各自的不足，普适性较差，尤其在遇到复杂基质样品时，容易产生假阳性。c18柱对强极性和带电荷的化合物保留较弱；正相柱对强极性和带电荷的化合物保留较强，但是流动相(正己烷、乙酸乙酯等)对其溶解性较差；离子交换色谱可实现离子型化合物的分离，但对带有相同电荷的离子化合物的分离效果差。
4.混合模式色谱是取代离子对色谱，对中性和离子型化合物进行同时分析的优选方法。与传统的单一模式色谱不同，混合模式色谱使用多功能团色谱固定相，其保留机理涉及两种或两种以上不同类型的分子间相互作用，因此具有更强的分离能力。最为常用的混合模式色谱是反相/离子交换色谱，所使用的固定相表面含有疏水和可解离功能基团，因此能够通过范德华尔力和静电力的协同作用，对中性和离子型化合物实现保留和同时分离。由于流动相中不需要添加表面活性剂，因此不存在离子对色谱中所存在的问题，不仅可以使用梯度洗脱分析，还可以与质谱联用，因此，在药物分析中展现了广阔的应用前景。但是，到目前为止，混合模式色谱固定相的品种不多，结构单一，不能适应分析领域中日益增长的复杂成分。
5.因此如何提供一种混合模式色谱柱固定相，使其可以实现对多组分的同时分离，成为目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相及其制备方法和应用。本发明提供的氨基烟酸类混合模式色谱固定相具有两性离子特性，内含多种活性基团，可为色谱分离提供π-π、氢键和离子作用等多种作用力，可以实现对多组分的同时分离。
7.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相，所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相具有如下式i所示结构：
[0009][0010]
其中，所述r选自如下式ii-式v所示结构中的任意一种：
[0011][0012]
表示基团的连接位点。
[0013]
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的氨基烟酸类混合模式色谱固定相的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0014]
(1)将硅胶加入酸性溶液中进行酸洗，得到活化硅胶；
[0015]
(2)将步骤(1)得到的活化硅胶和环氧硅烷偶联剂进行偶联反应，得到环氧偶联硅胶；
[0016]
(3)将步骤(2)得到的环氧偶联硅胶和氨基烟酸类化合物进行开环反应，得到所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相。
[0017]
在本发明中，步骤(1)中，所述硅胶包括直径3-10μm(例如可以是3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm等)的球形硅胶。
[0018]
优选地，步骤(1)中，所述酸性溶剂包括体积分数5-30％(例如可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％等)的盐酸水溶液。
[0019]
优选地，步骤(1)中，所述硅胶和酸性溶液的质量比为1:(5-10)，其中，“5-10”可以是5、6、7、8、9、10等。
[0020]
在本发明中，步骤(1)中，所述酸洗的温度为90-120℃(例如可以是90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃等)，所述酸洗的时间为5-18h(例如可以是5h、7h、9h、11h、13h、15h、17h、18h等)。
[0021]
优选地，步骤(1)中，所述酸洗后还需要进行后处理，所述后处理包括以下步骤：将酸洗后得到的物料进行水洗，得到水洗后的物料；将水洗后的物料，进行减压抽滤得到固体产物，将固体产物进行真空干燥，得到活化硅胶。
[0022]
优选地，所述水洗后的物料的ph为6.5-7.5(例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5等)。
[0023]
优选地，所述真空干燥的温度为100-150℃(例如可以是100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃等)，时间为1.5-6h(例如可以是1.5h、2.5h、3.5h、4.5h、5.5h、6h等)。
[0024]
在本发明中，步骤(2)中，所述环氧硅烷偶联剂包括3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷，所述3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷具有如下式vi所示结构：
[0025][0026]
优选地，步骤(2)中，所述偶联反应在溶剂中进行，所述溶剂包括无水甲苯。
[0027]
优选地，所述活化硅胶和环氧硅烷偶联剂的质量比为1:(1-4)，其中，“1-4”可以是1、2、3、4等。
[0028]
优选地，所述活化硅胶和溶剂的质量比为1:(5-15)，其中，“5-15”可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等。
[0029]
在本发明中，步骤(2)中，所述偶联反应的温度为110-140℃(例如可以是110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃等)，时间为12-36h(例如可以是12h、15h、20h、25h、30h、35h、36h等)。
[0030]
优选地，步骤(2)中，所述偶联反应后还需要进行后处理，所述后处理包括以下步骤：将偶联反应后得到的物料用有机溶剂洗涤，然后进行抽滤，得到固体产物；将固体产物进行真空干燥，得到环氧偶联硅胶。
[0031]
优选地，所述有机溶剂包括无水乙醇和甲苯混合溶剂。
[0032]
优选地，所述真空干燥的温度为100-150℃(例如可以是100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃等)，时间为1.5-6h(例如可以是1.5h、2.5h、3.5h、4.5h、5.5h、6h等)。
[0033]
在本发明中，步骤(3)中，所述氨基烟酸类化合物包括2-氨基烟酸、2-氨基异烟酸、5-氨基烟酸或6-氨基烟酸中的任意一种。
[0034]
优选地，步骤(3)中，所述环氧偶联硅胶和氨基烟酸类化合物的质量比为(1.5-3):1，其中，“1.5-3”可以是1.5、2、2.5、3等。
[0035]
优选地，步骤(3)中，所述开环反应在催化剂存在下进行，所述催化剂包括体积分数为0.5-1.5％(例如可以是0.5％、0.7％、0.9％、1.1％、1.3％、1.5％等)的醋酸水溶液。
[0036]
优选地，所述环氧偶联硅胶和催化剂的质量比为(3-10):1，其中，“3-10”可以是3、4、5、6、7、8、9、10等。
[0037]
优选地，步骤(3)中，所述开环反应在溶剂中进行，所述溶剂包括水。
[0038]
优选地，所述环氧偶联硅胶和溶剂的质量比为1:(3-10)，其中，“3-10”可以是3、4、5、6、7、8、9、10等。
[0039]
在本发明中，步骤(3)中，所述开环反应的温度为50-90℃(例如可以是50℃、60℃、70℃、80℃、90℃等)，时间为36-60h(例如可以是36h、42h、48h、54h、60h等)。
[0040]
优选地，步骤(3)中，所述开环反应后还需要进行后处理，所述后处理包括以下步骤：将开环反应后得到的物料进行水洗，得到水洗后的物料；将水洗后的物料，进行减压抽滤得到固体产物，将固体产物进行真空干燥，得到所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相。
[0041]
优选地，所述真空干燥的温度为100-150℃(例如可以是100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃等)，时间为1.5-6h(例如可以是1.5h、2.5h、3.5h、4.5h、5.5h、6h等)。
[0042]
作为本发明优选地技术方案，所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相的制备方法包括以下步骤：
[0043]
(1)将硅胶加入酸性溶液中进行酸洗，得到活化硅胶；
[0044]
其中，所述酸洗的温度为90-120℃，所述酸洗的时间为5-18h；
[0045]
(2)将步骤(1)得到的活化硅胶和环氧硅烷偶联剂进行偶联反应，得到环氧偶联硅胶；反应式如下所示：
[0046][0047]
其中，所述环氧硅烷偶联剂包括3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷，所述偶联反应的温度为110-140℃，时间为12-36h；
[0048]
(3)将步骤(2)得到的环氧偶联硅胶和氨基烟酸类化合物进行开环反应，得到所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相；反应式如下所示：
[0049][0050]
其中，所述氨基烟酸类化合物包括2-氨基烟酸、2-氨基异烟酸、5-氨基烟酸或6-氨基烟酸中的任意一种；所述开环反应在催化剂存在下进行，所述催化剂包括体积分数为0.5-1.5％的醋酸水溶液；所述开环反应的温度为50-90℃，时间为36-60h。
[0051]
在本发明中，2-氨基烟酸、2-氨基异烟酸、5-氨基烟酸、6-氨基烟酸具有如下所示结构：
[0052][0053]
在本发明中，所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相选自如下所示结构中的任意一种：
[0054][0055]
在本发明中，先将硅胶活化，得到活化硅胶；再将活化硅胶与硅烷偶联剂键合制备得到环氧偶联硅胶，最后以氨基烟酸类物质为功能配体，通过氨基-环氧基开环反应将氨基烟酸接枝到硅胶表面，进而得到氨基烟酸类混合模式色谱固定相，所述氨基烟酸类物质包括2-氨基烟酸、2-氨基易烟酸、5-氨基烟酸或6-氨基烟酸中的任意一种。
[0056]
第三方面，本发明提供一种第一方面所述的氨基烟酸类混合模式色谱固定相在液相色谱分析中的应用。
[0057]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0058]
本发明选取的功能配体价格低廉易获取，且制备得到的氨基烟酸类混合模式色谱固定相具有两性离子特性，内含多种活性基团，可为色谱分离提供π-π、氢键和离子作用等多种作用力。本发明提供的氨基烟酸类混合模式色谱固定相的制备方法具有反应条件温和，合成步骤简单，制备填料完整均一，稳定性良好等优点。
附图说明
[0059]
图1为2-氨基烟酸接枝固定相红外光谱图；
[0060]
其中，(a)为2-氨基烟酸接枝硅胶，(b)为环氧偶联硅胶，(c)为裸硅胶。
[0061]
图2为流动相中水含量随保留时间的变化图。
[0062]
图3为流动相中ph随保留时间的变化图。
[0063]
图4为壳寡糖标品在2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱中的分离图；
[0064]
其中，1为壳一糖，2为壳二糖，3为壳三糖，4为壳四糖，5为壳五糖。
[0065]
图5为壳寡糖标品在氨基亲水色谱柱中的分离图；
[0066]
其中，1为壳一糖，2为壳二糖，3为壳三糖，4为壳四糖，5为壳五糖。
[0067]
图6为壳寡糖粗品在2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱中的分离图；
[0068]
其中，1为壳一糖，2为壳二糖，3为壳三糖，4为壳四糖，5为壳五糖。
[0069]
图7为壳寡糖粗品在氨基亲水色谱柱中的分离图；
[0070]
其中，1为壳一糖，2为壳二糖，3为壳三糖，4为壳四糖，5为壳五糖。
具体实施方式
[0071]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0072]
以下实施例中所述反应温度均为反应介质的温度，以下实施例中5μm氨基亲水柱的厂家为shodex，牌号为f763001。
[0073]
实施例1
[0074]
本实施例提供一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相，所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相具有如下所示结构：
[0075][0076]
所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相的制备方法包括以下步骤：
[0077]
(1)称取15g 10μm硅胶置于250ml单口平底烧瓶中，加入100ml体积分数10％的盐酸溶液，110℃下回流6h。待回流结束后抽滤，并用大量水洗涤至中性，通过抽滤获得固体产物，将固体产物置于110℃真空干燥箱干燥2h，得到活化硅胶。
[0078]
(2)将10g活化硅胶、100ml无水甲苯和20ml 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷置于250ml单口平底烧瓶中，125℃下回流反应24h，反应结束后抽滤。用乙醇/甲苯溶液洗涤产物，静置过夜后，经120℃干燥2h，得到3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶；反应式如下所示：
[0079][0080]
(3)称取2g 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶，置于50ml圆底烧瓶中，向其中加入10ml含1g 2-氨基烟酸固体的水溶液，滴加0.5ml醋酸(体积分数为1％的醋酸水溶液)，保持密闭反应，在65℃下磁力搅拌反应48h，反应结束后抽滤，使用大量去离子水洗涤，置于烘箱中110℃干燥2h，得到2-氨基烟酸接枝固定相反应式如下所示：
[0081][0082]
实施例2
[0083]
本实施例提供一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相，所述氨基烟酸类混合模式色
谱固定相具有如下所示结构：
[0084][0085]
所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相的制备方法包括以下步骤：
[0086]
(1)称取14g 10μm硅胶置于250ml单口平底烧瓶中，加入90ml体积分数10％的盐酸溶液，105℃下回流6.5h。待回流结束后抽滤，并用大量水洗涤至中性，通过抽滤获得固体产物，将固体产物置于120℃真空干燥箱干燥1.8h，得到活化硅胶。
[0087]
(2)将10g活化硅胶、100ml无水甲苯和22ml 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷置于250ml单口平底烧瓶中，120℃下回流反应26h，反应结束后抽滤。用乙醇/甲苯溶液洗涤产物，静置过夜后，经125℃干燥2.1h，得到3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶；反应式如下所示：
[0088][0089]
(3)称取2g 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶，置于50ml圆底烧瓶中，向其中加入10ml含1.1g 5-氨基烟酸固体的水溶液，滴加0.55ml醋酸(体积分数为1％的醋酸水溶液)，保持密闭反应，在70℃下磁力搅拌反应46h，反应结束后抽滤，使用大量去离子水洗涤，置于烘箱中115℃干燥1.8h，得到5-氨基烟酸接枝固定相反应式如下所示：
[0090][0091]
实施例3
[0092]
本实施例提供一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相，所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相具有如下所示结构：
[0093][0094]
所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相的制备方法包括以下步骤：
[0095]
(1)称取16g 10μm硅胶置于250ml单口平底烧瓶中，加入105ml体积分数10％的盐酸溶液，115℃下回流6h。待回流结束后抽滤，并用大量水洗涤至中性，通过抽滤获得固体产物，将固体产物置于115℃真空干燥箱干燥2.1h，得到活化硅胶。
[0096]
(2)将10g活化硅胶、100ml无水甲苯和23ml 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷置于250ml单口平底烧瓶中，130℃下回流反应22h，反应结束后抽滤。用乙醇/甲苯溶液洗涤产物，静置过夜后，经115℃干燥2.3h，得到3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶；反应
式如下所示：
[0097][0098]
(3)称取2g 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶，置于50ml圆底烧瓶中，向其中加入10ml含1g 6-氨基烟酸固体的水溶液，滴加0.45ml醋酸(体积分数为1％的醋酸水溶液)，保持密闭反应，在68℃下磁力搅拌反应50h，反应结束后抽滤，使用大量去离子水洗涤，置于烘箱中113℃干燥1.9h，得到6-氨基烟酸接枝固定相反应式如下所示：
[0099][0100]
实施例4
[0101]
本实施例提供一种氨基烟酸类混合模式色谱固定相，所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相具有如下所示结构：
[0102][0103]
所述氨基烟酸类混合模式色谱固定相的制备方法包括以下步骤：
[0104]
(1)称取15g 10μm硅胶置于250ml单口平底烧瓶中，加入108ml体积分数10％的盐酸溶液，110℃下回流6h。待回流结束后抽滤，并用大量水洗涤至中性，通过抽滤获得固体产物，将固体产物置于110℃真空干燥箱干燥2.1h，得到活化硅胶。
[0105]
(2)将10g活化硅胶、100ml无水甲苯和20ml 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷置于250ml单口平底烧瓶中，128℃下回流反应23h，反应结束后抽滤。用乙醇/甲苯溶液洗涤产物，静置过夜后，经125℃干燥2.1h，得到3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶；反应式如下所示：
[0106][0107]
(3)称取2g 3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅胶，置于50ml圆底烧瓶中，向其中加入10ml含1.1g 2-氨基异烟酸固体的水溶液，滴加0.5ml醋酸(体积分数为1％的醋酸水溶液)，保持密闭反应，在70℃下磁力搅拌反应49h，反应结束后抽滤，使用大量去离子水洗涤，置于烘箱中115℃干燥2h，得到2-氨基异烟酸接枝固定相反应式如下所示：
[0108][0109]
测试例1
[0110]
结构验证
[0111]
测试样本：实施例1提供的2-氨基烟酸接枝固定相。
[0112]
测试方法：采用红外光谱进行表征。
[0113]
测试结果：如图1所示2-氨基烟酸接枝固定相红外光谱图；其中，(a)为2-氨基烟酸接枝硅胶，(b)为环氧偶联硅胶，(c)为裸硅胶。
[0114]
其中，在(c)裸硅胶的红外曲线中，800cm-1
和1100cm-1
附近吸收峰应为si-o-si的反对称伸缩振动吸收峰，3500-3000cm-1
附近较强宽峰为si-oh的特征吸收峰，1640cm-1
附近微弱单峰为硅胶高温烘干后未除去水的h-o-h弯曲振动峰；对比(b)中环氧偶联硅胶的红外曲线可以发现，3500-3000cm-1
附近的吸收峰强度明显下降，可能是消耗了大量si-oh所导致的，3000-2800cm-1
附近出现了新的吸收峰，可能是硅烷偶联剂中乙基带有的c-h所导致的，因此证明3-(缩水甘油醚氧基丙基)三乙氧基硅烷成功键合到裸硅胶上。
[0115]
对比(a)、(b)两条曲线，2-氨基烟酸接枝硅胶中3500-3000cm-1
处吸收峰得到明显增强，可能是2-氨基烟酸带来-oh、-nh等基团伸缩振动所导致；1640cm-1
附近水峰被1700-1650cm-1
处吸收峰掩盖，并且在1700-1650cm-1
内呈较强单峰，应是2-氨基烟酸带来的羧基或酰胺基中c＝o增加导致，1550-1480cm-1
附近出现双峰，则是2-氨基烟酸中吡啶环上的c＝c键带来的，由此证明2-氨基烟酸被成功的固定在硅胶表面。
[0116]
应用例1
[0117]
采用实施例1提供的2-氨基烟酸接枝硅胶作为固定相，进行分离低聚壳寡糖(壳寡糖1-5糖)。
[0118]
将固定相装填于4.6
×
150mm不锈钢分析色谱柱，连接agilent 1260型高效液相色谱仪，示差检测器检测，以纯乙腈溶液为流动相冲洗4h后，制备得到2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱，制得的色谱柱以低聚壳寡糖为分析样品，测试其在亲水/离子交换模式下的保留行为。
[0119]
(1)测试流动相含水量变化对保留影响
[0120]
以低聚壳寡糖标品(壳寡糖2-5糖)作为分析物。具体包括以下步骤：称取壳2-5糖各50mg混合在10ml试管中，加入5ml去离子水，35℃下超声溶解5min。待完全溶解后用0.22μm水系滤膜过滤，得到50mg/ml浓度的壳寡糖标品混合溶液。
[0121]
采用2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱，流动相为两相，分别为乙腈和氨水水溶液。设置流动相条件分别为乙腈/水(65％/35％)、乙腈/水(70％/30％)、乙腈/水(75％/25％)、乙腈/水(80％/20％)；流动相ph为10.24，流动相流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为254nm。
[0122]
流动相中含水量随保留时间变化如图2所示，由图可知，随着流动相中含水量下
降，壳寡糖分析物的保留时间增加，表明壳寡糖在色谱柱上的保留受亲水作用影响，由此可以说明氨基烟酸接枝固定相具有典型的亲水作用色谱保留行为。
[0123]
原因分析：这种变化模式符合亲水作用色谱的保留特征。亲水作用色谱的保留主要是通过在固定相表面建立一个“富水层”，分析物可以从流动相进入到“富水层”中完成在固定相表面的保留。影响保留效果的主要因素是氢键作用，根据氨基烟酸固定相结构分析，固定相中酰胺和羟基基团有较强的形成氢键能力，可以加强分析物在固定相表面的保留。对于壳寡糖，根据不同聚合度壳寡糖在“富水层”和流动相间分配作用力大小不同，可以实现对壳2-5糖的有效分离。
[0124]
(2)测试流动相ph变化对保留影响
[0125]
以低聚壳寡糖标品(壳寡糖2-5糖)作为分析物，具体是称取壳2-5糖各50mg混合在10ml试管中，加入5ml去离子水，35℃下超声溶解5min。待完全溶解后用0.22μm水系滤膜过滤，得到50mg/ml浓度的壳寡糖标品混合溶液。
[0126]
采用2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱，流动相为两相，分别为乙腈和氨水水溶液。调节流动相ph分别为8.85、9.42、9.65、9.85、10.08、10.24、10.58、10.74，流动相流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为254nm。
[0127]
流动相中ph随保留时间变化如图3所示，由图可知，随着流动相中ph升高，壳寡糖分析物的保留时间缩短，表明壳寡糖在色谱柱上的保留受离子作用影响，由此可以说明氨基烟酸接枝固定相具有典型的离子色谱保留行为。
[0128]
原因分析：一方面，可能是ph升高增强了流动相和固定相间作用，导致固定相对壳寡糖的吸附作用下降；另一方面，ph升高使壳寡糖中游离氨基结合h

数量减少，导致表面正电荷减少，削弱了固定相表面带负电的羧基和壳寡糖中带正电的氨基的结合能力，导致随着ph升高，壳寡糖在色谱柱上的保留时间缩短。
[0129]
(3)应用例1提供的10μm 2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱和市售的5μm氨基亲水柱的对比(壳寡糖标品)
[0130]
壳寡糖标品的制备方法包括以下步骤：称取壳1-5糖各50mg混合在10ml试管中，加入5ml去离子水，35℃下超声溶解5min。待完全溶解后用0.22μm水系滤膜过滤，得到50mg/ml浓度的壳寡糖标品混合溶液。
[0131]
使用10μm 2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱和市售的5μm氨基亲水柱同时在色谱条件为乙腈/氨水水溶液(70/30)，流动相ph 10.24，流动相流速1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为254nm下，对壳寡糖标品(壳寡糖1-5糖)进行分离。
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分离结果如图4和图5所示。本发明提供的10μm 2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱在制备成本大大降低的条件下表现出和市售的5μm氨基亲水柱类似的分离能力。图4中10μm 2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱分离色谱图中相邻色谱峰分离度分别为：壳2糖与壳3糖的分离度3.30，壳3糖与壳4糖的分离度2.72，壳4糖与壳5糖的分离度2.62，均大于1.5，即新型氨基烟酸色谱柱可实现对壳寡糖混合物的完全分离。
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(4)应用例1提供的10μm 2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱和市售的5μm氨基亲水柱的对比(壳寡糖粗品)
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使用10μm 2-氨基烟酸接枝硅胶色谱柱和市售的5μm氨基亲水柱同时在色谱条件为乙腈/氨水水溶液(70/30)，流动相ph 10.24，流动相流速1.0ml/min，柱温为35℃，检测波
长为254nm下，对未知详细组分的壳寡糖粗品进行分离。
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分离结果如图6和图7所示，其中10μm 2-氨基烟酸接枝硅胶在实际分离中有更少的杂峰，对碱性糖有更好的分离能力。
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申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。