用于表征纳米囊泡及其结合或缔合的靶标的方法和装置

1.本文所述的发明大体涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及用于检测和/或表征纳米囊泡的方法或者检测与所述纳米囊泡结合或缔合的靶标的方法。本发明还涉及用于进行这些方法的试剂盒或微流体芯片。


背景技术：

2.近来，外泌体已成为有前景的循环生物标志物。外泌体以其生物物理和生物分子组成而为人所知，是由多种哺乳动物细胞，并且最尤其是分裂癌细胞主动释放的纳米级膜囊泡(直径为30至150nm)。外泌体包含丰富的分子内容物(包括蛋白、核酸、脂质以及各种修饰物)，其要么作为来自亲代细胞的遗传成分要么作为膜相关分子。作为细胞间通讯的强大信使，外泌体在介导疾病进展中发挥着重要作用。例如，癌细胞主动产生和利用外泌体来促进肿瘤生长。通过快速分裂癌细胞，外泌体被最多地释放。外泌体内容物不仅介导细胞间通讯，而且还调节微环境以促进癌症转移。这种策划性释放和功能活动突出了外泌体作为更具反映性的循环生物标志物的临床潜力。
3.尽管有这样的临床潜力，但对天然生物流体中的外泌体进行直接和特异性分析在技术上仍然具有挑战性，尤其是在临床转化方面。具体地，临床生物流体在组成上是多样化的，并且包含纳米级囊泡以及丰富的非囊泡，游离分子。对这种复杂混合物中外泌体群体的目前检测主要依赖于以独立方式或顺序方式进行的生物物理表征或生物化学表征。在生物物理准备中，可以通过传统的超速离心或先进的分选策略分离出具有特征大小的囊泡；然而，这些方法需要大量处理，面临其它类似大小的蛋白聚集体的污染，并且缺乏识别囊泡的生物分子确认。另一方面，生物化学测定通常基于常见外泌体标志物使用亲和性富集来捕获和测量囊泡。这种方法往往会遗漏囊泡亚群，和/或容易受到生化相同但组织不同的分子靶标(例如，非囊泡、游离蛋白抗原)的干扰。
4.因此，通常希望克服或改善一个或多个上述困难。


技术实现要素：

5.本文公开了一种用于检测和/或表征样品中的纳米囊泡的方法，该方法包括以下步骤：
6.a)使样品与纳米颗粒或纳米颗粒的前体接触，其中，所述纳米颗粒或前体能够结合到纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕所述囊泡的纳米壳；以及
7.b)照射所述样品并且测量所述样品的光学信号以检测和/或表征所述样品中的纳米囊泡。
8.此外，本文公开了一种用于检测与样品中的纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标的方法，所述方法包括以下步骤：
9.a)使样品与纳米颗粒或纳米颗粒的前体以及一种或更多种荧光分子探针依次或同时接触，其中所述纳米颗粒或前体能够结合到所述纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕
所述纳米囊泡的纳米壳，并且其中所述一种或更多种荧光分子探针能够特异性结合至与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标并且为每种所述靶标提供独特发射荧光波长；以及
10.b)照射所述样品并且测量所发射的荧光，以检测与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标，其中所述检测涉及识别每种所述靶标的独特发射荧光波长的增强荧光淬灭。
11.此外，本文公开了用于进行本文限定的方法的微流体芯片。
12.此外，本文公开了用于进行本文限定的方法的试剂盒。
13.此外，本文公开了一种通过同时检测或表征一种或更多种靶标来确定受试者中癌症的预后的方法，所述一种或更多种靶标与来自所述受试者的样品中的纳米囊泡结合或缔合并且指示所述癌症的性质，所述方法包括：
14.a)使样品与纳米颗粒或纳米颗粒的前体以及一种或更多种荧光分子探针依次或同时接触，其中所述纳米颗粒或前体能够结合到所述纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕所述囊泡的纳米壳，并且其中所述一种或更多种荧光分子探针能够特异性结合至与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标并且为每种所述靶标提供独特发射荧光波长；以及
15.b)照射所述样品并且测量吸光度和/或所发射的荧光，以检测与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标，其中所述检测涉及识别每种所述靶标的独特发射荧光波长的增强荧光淬灭。
附图说明
16.下文参考附图仅通过非限制性实施例的方式来描述本发明的实施例，其中：
17.图1：用于对外泌体进行多参数剖析的模板化的纳米等离子体。(a)tpex(模板化的等离子体外泌体，templated plasmonic exosome)平台的示意图。该技术设计用于测量外泌体标志物，并且包括三个功能性步骤。首先用荧光分子探针和aunp来标签化外泌体。虽然aunp在与非囊泡、游离蛋白缔合时保持良好分散，但它们通过静电相互作用组装到外泌体外围。未去除过量的未结合的探针和aunp。在金盐的存在下，aunp作为原位金生长的种子。分散的aunp发生小的生长并在它们的吸收光谱中产生略微的偏移，引起探针的荧光信号中的微小变化。另一方面，外泌体结合的aunp会发展成纳米壳；这种纳米结构以囊泡尺寸为模板，并在其等离子体共振中表现出大的红移，从而有效地淬灭了结合在同一囊泡上的探针的荧光信号。因此，tpex荧光信号是多参数的(multiparametric)，用于外泌体生物物理表征和生物标志物组成。(b)tpex产物的透射电子显微照片。在游离蛋白的存在下，aunp保持良好分散(之前)，并在用金盐处理后表现出小颗粒生长(之后)。当与外泌体一起孵育时，aunp结合至囊泡外围(之前)并在金生长后发展成大的球状颗粒(之后)。比例尺：20nm。(c-d)微流体装置和基于智能手机的光学检测器的照片。通过不同的led光源和滤光片配置在集成平台上可进行吸光度和荧光测量。比例尺：1cm。
18.图2：tpex吸光度分析。(a)不同大小的模板的光学模拟。基于形成的tpex纳米结构的显微镜表征，模拟在不同大小的模板上发展的金纳米壳的等离子体共振峰(左)。对于外泌体大小的模板(30至150nm，红色阴影)，所得等离子体峰主要位于》600nm处。红色虚线表示由该模板直径范围形成的平均峰值波长，并且其位于750nm处。绘制了单个aunp(裸的或
与游离蛋白缔合的颗粒)以及金生长后形成的金纳米壳(外泌体模板化的)在750nm处的电场分布(右)。表示金生长后的粒径。该模拟证实，以外泌体尺寸为模板的纳米壳可在750nm处产生强等离子体共振。(b)相对于模板直径，tpex响应范围的调整。将不同大小的模板与不同直径的aunp一起孵育，以形成金纳米壳。tpex吸光度测量值(a)被定义为在750nm和540nm处的吸光度之比，并且其差值(δa)被定义在金生长前后的差值。使用9-nm aunp，可以优化tpex响应范围以匹配外泌体尺寸，从而最大化外泌体引起的信号。(c)生物样品的实验评估。将来自人类结肠直肠腺癌(dld-1)的外泌体添加到囊泡耗尽的fbs(dfbs)中，并使用9-nm aunp进行tpex分析。在所有反应中，测量所得的吸光度(左)和直径变化(右)。直径变化通过动态光散射分析来进行。只有含有外泌体的样品表现出较大的信号增量，而pbs(即裸aunp)和dfbs(即游离蛋白)中的反应显示出可忽略不计的变化。(d)tpex吸光度分析与外泌体浓度的相关性。通过纳米颗粒示踪分析对来自四种细胞系(dld-1、htc116、mkh45和snu484)的外泌体进行计数，并通过tpex吸光度分析进行评估。所有测量一式三份进行，在b-c中，数据显示为均值
±
s.d.。*p《0.05，***p《0.0005，ns，表示不显著；学生t检验；a.u.表示任意单位。
19.图3：外泌体分子标志物的多重荧光分析。(a)tpex荧光分析。为了评估tpex纳米壳是否可用于淬灭共定位的荧光探针，制备pda纳米颗粒作为大小明确的模板，并使该颗粒与荧光染料(a647)缀合。模板用tpex反应处理，并测量荧光(δf，上)和吸光度(δa，下)中由此引起的变化。两种分析均显示出相似的趋势，并证实了对于外泌体直径优化的模板大小响应范围。(b)外泌体标志物的测定特异性。将包含cd63的整个外泌体(源自dld-1)(上)和游离cd63(下)与荧光适配体(抗cd63和加扰对照(scrambled control))一起孵育以用于tpex测量。只有整个外泌体显示出显著的信号，而游离cd63样品显示出可忽略不计的信号。在测试的不同荧光染料(fitc、rb和a647)中，用a647(发射665nm，与tpex吸光度750nm最接近)修饰的适配体表现出最大的信号差异。(c)外泌体标志物的多重剖析。将外泌体与不同的荧光适配体一起孵育，单独(singleplex，单重)或作为混合物(多重)来用于tpex分析。多重荧光光谱与单重光谱一致(上)，并显示了跨细胞系的准确标志物表达谱(下)。(d)分子检测灵敏度。通过滴定已知量的外泌体并测量它们与cd63相关的tpex信号来确定检测限。基于化学发光独立评估elisa的检测限。所有测量一式三份进行，并且荧光分析针对各自的样品匹配的加扰对照进行标准化。在a、b和d中，数据显示为均值
±
s.d.。*p《0.05，**p《0.005，***p《0.0005，ns，表示不显著；学生t检验；a.u.表示任意单位。
20.图4：复杂背景下的外泌体分析。(a)mock临床样品的tpex分析。通过将来自六种人类细胞系的外泌体添加(spiking)到囊泡耗尽的人血清中来制备样品。在这些经添加的样品中，测量外泌体标志物cd63和推定的癌症标志物(包括cd24、epcam和muc1)。经添加的样品的所有蛋白测量通过传统的单重夹心elisa法以及在微流体平台上通过多重tpex分析来进行。将该分析与纯外泌体的标志物特征(在添加前从外泌体获得)进行比较。对于所分析的每个标志物，tpex分析显示出反映跨细胞系的表达趋势的更好一致性。(b)tpex测量值与纯外泌体特征的相关性。tpex检测显示出与纯外泌体分析良好的相关性(左)，而相同经添加的样品上进行的常规elisa测量显示出显著的较差相关性(右)。针对各自的样品匹配的加扰对照，所有测量均一式三份进行。数据经过测定标准化，并在a中显示为均值，在b中显示为均值
±
s.d.。
21.图5：患者预后的tpex分析。(a)使用多重tpex测量囊泡缔合的靶标标志物(上)和常规单重elisa测量总靶标标志物(下)分析临床癌症腹水(n＝20；12例结肠直肠癌和8例胃癌)中的蛋白标志物。与elisa分析相比，tpex分析显示出不同的蛋白表达谱。(b，c)tpex(b)和elisa(c)回归模型对结肠直肠癌(左)、胃癌(中)和两种癌症类型(右)的腹水样品的接受者操作特征(roc)曲线。使用单个标志物或靶标标志物的组合(混合)构建roc曲线。与elisa测定相比，tpex分析显示出两种癌症的预后分类准确性更高。针对各自的样品匹配的加扰对照，所有测量均一式三份进行。数据经过测定标准化并在(a)中显示为均值。
22.图6：细胞外囊泡的大小和分子表征。(a)耗尽的胎牛血清(dfbs)中的游离蛋白的大小分布的动态光散射分析和(b)源自人结肠直肠腺癌细胞系(dld-1)的细胞外囊泡的大小分布的动态光散射分析。(c)dld-1囊泡的透射电子显微照片。比例尺：20nm。(d)囊泡裂解物的蛋白质印迹分析。针对外泌体标志物(cd63、alix、hsp70、tsg101、flotillin1)对裂解物进行免疫印迹。
23.图7：tpex产物的显微镜和光谱表征。当与(a)游离蛋白和(b)外泌体一起孵育时，金纳米材料在tpex金生长之前(上)和之后(下)的大小分布。所有测量值均通过透射电子显微镜(tem)分析来确定。(c-d)相应金纳米材料的吸光度分析。a.u.表示任意单位。
24.图8：微流体平台的示意图。装置的分解图。该平台由两个聚二甲基硅氧烷(pdms)层组装，并由阀门层和微通道层组成，它们分别构建用于顺序流量控制的扭矩激活阀和用于有效标签化的蛇形混合器。
25.图9：tpex装置的运行。
26.图10：tpex金纳米结构的光学模拟。(a)由裸aunp(仅9-nmaunp)产生且由不同大小的外泌体模板化的所形成的金纳米结构的电场模拟。在540nm(上)和750nm(下)的波长下模拟电场分布。(b)形成的金纳米结构的吸光度模拟随模板直径的变化。裸aunp为模板的纳米颗粒和以外泌体为模板的纳米壳分别在540nm和750nm处表现出强烈的共振。a.u.表示任意单位。
27.图11：不同模板直径下的实验验证。(a)根据动态光散射分析确定的多种聚多巴胺模板的大小分布。(b)模板直径随氢氧化钠体积的变化。(c)模板化的纳米材料生长后的实验吸收光谱。实验验证与模拟吸光度一致。具体地，在不存在靶标模板(即裸aunp)的情况下，在540nm附近观察到单个共振峰；当与直径增加的模板反应时，在750nm处出现了额外的共振峰。所有测量一式三份进行，在a-b中，数据显示为均值
±
s.d.。a.u.表示任意单位。
28.图12：不同大小的aunp的表征。(a)用聚乙烯亚胺(pei)官能化前后不同大小的aunp的吸光度测量。(b)pei官能化后不同大小的aunp的透射电子显微照片。比例尺：50nm。(c)通过tem分析确定的所制备的aunp的大小分布，证实了制备品的单分散性。a.u.表示任意单位。
29.图13：外泌体和游离蛋白的tpex测定。在不同的实验条件下( ，存在；-，不存在)测量的外泌体和游离蛋白(dfbs)的(a)ζ电位和(b)流体动力学直径。所有测量一式三份进行，数据显示为均值
±
s.d.。
30.图14：由不同细胞来源分离的细胞外囊泡。从结肠直肠癌细胞(a)dld-1，(b)hct116和胃癌细胞(c)mkn45，(d)snu484获得的细胞外囊泡。所有囊泡均用纳米颗粒示踪分析进行表征。
31.图15：外泌体的tpex吸光度分析。(a)tpex反应后不同外泌体计数的吸收光谱。源自dld-1细胞系的外泌体通过纳米颗粒示踪分析进行量化，并经受tpex反应。(b)tpex吸光度灵敏度。检测限通过滴定已知量的外泌体并测量其相关的tpex吸光度变化来确定。所有测量一式三份进行，在b中，数据显示为均值
±
s.d.。a.u.表示任意单位。
32.图16：具有支化荧光的适配体的合成。步骤1：用双丙烯酸酯分子通过氮杂-迈克(aza-michael)加成对适配体进行丙烯酸修饰。步骤2：通过伯胺与丙烯酰基反应，将4臂-peg加成到经修饰的适配体中。步骤3：通过酯共轭用荧光团对聚乙二醇化的适配体进行标签化。在每个步骤之后，通过大小选择性过滤(分子截留，3000)从过量试剂纯化经修饰的适配体。
33.图17：荧光适配体的性能评估。(a)用支化荧光(3种染料)或单种荧光分子(1种染料)制备抗cd63适配体。用于tpex反应的适配体与外泌体一起使用，并测量吸光度(上)和荧光(下)变化。虽然两种适配体制备品显示出相当的吸光度变化，但3种染料制备品显示出更好的荧光信号。所有测量均针对各自的加扰对照适配体进行。(b)1-染料适配体的检测限。用1种染料抗cd63适配体稀释和测量外泌体。所有测量均一式三份进行，并且数据显示为均值
±
s.d。*p《0.05，***p《0.0005，ns表示不显著；学生t检验；a.u.表示任意单位。
34.图18：使用抗体和mirna探针进行tpex分析。(a)与elisa分析(下)相比，使用不同荧光抗体的tpex分析(上)显示了跨细胞系的准确蛋白标志物表达谱。(b)与pcr分析(下)相比，使用不同荧光dna探针针对mirna靶标的tpex分析(上)显示了跨细胞系的准确mirna标志物表达谱。所有测量一式三份进行。在a和b中分别针对相应样品匹配的igg同种型对照抗体或加扰对照对分析进行标准化。
35.图19：基于智能手机的检测器。(a)不同led光源的光谱。(b)分别用于吸光度和荧光检测的基于智能手机的检测器的配置。(c)基于智能手机的检测器和市售酶标仪(plate reader)的tpex测量值的相关性。基于智能手机的检测器与商业酶标仪表现出良好的性能相关性(r2＝0.9945)。所有测量一式三份进行，在c中，数据显示为均值
±
s.d.。a.u.表示任意单位。
36.图20：临床样品中cd63表达水平的比较。(a)临床腹水样品的囊泡计数通过纳米颗粒示踪分析确定。(b)临床样品中cd63的tpex分析。(c)临床样品中总cd63蛋白的elisa分析。cd63的tpex分析可以更好地反映囊泡计数，这是通过金标准纳米颗粒示踪分析确定的，而总cd63蛋白的elisa分析显示与计数的一致性较差。
具体实施方式
37.本文公开了一种用于检测和/或表征样品中的纳米囊泡的方法，该方法包括以下步骤：
38.a)使样品与纳米颗粒或纳米颗粒的前体接触，其中，所述纳米颗粒或前体能够结合到纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕所述囊泡的纳米壳；以及
39.b)照射所述样品并且测量所述样品的光学信号以检测和/或表征所述样品中的纳米囊泡。
40.在一个实施方式中，纳米壳的形成引起红外区中局部等离子体共振和/或增加的光学吸光度。
41.在一个实施方式中，调整所述纳米壳的光谱性质(吸光度)以区分细胞外纳米囊泡的尺寸和相应的囊泡计数。
42.不受理论的束缚，发明人开发了直接在天然临床生物流体中通过同时评估囊泡的生物物理和生物分子组成来对这些相同囊泡进行多参数分子剖析的平台/方法。该技术称为“用于外泌体的模板等离子体学”(template plasmonics for exosomes，tpex)，利用在囊泡上原位组装和生长的金纳米壳的形成来实现外泌体生物标志物的特异性分析。对于生物物理选择性，纳米壳的形成以囊泡膜为模板，并经调整以区分外泌体尺寸。对于生物分子选择性，通过匹配和局部的能量转移，纳米壳独特的等离子体特征可以淬灭荧光探针，这只有它们靶向结合在同一囊泡上时发生。由此产生的光学信号(即吸光度和荧光)可以对多种外泌体生物标志物(例如，蛋白和mirna)进行多重选择性分析，但对非囊泡、游离分子靶标仍然无响应。当在基于智能手机的微流体传感器上实施时，tpex技术可以卓越的性能实现对外泌体靶标的快速和多重分析(1μl样品，15分钟内)。发明人进一步应用开发的平台来检验天然临床腹水样品。该技术不仅针对复杂生物学背景揭示外泌体生物分子特征，而且还显示出与总生物标志物相比，生物标志物的外泌体亚群，从而可更准确地区分癌症患者的预后。
43.如本文所指的方法可以包括使样品与纳米颗粒或其前体接触，其中纳米颗粒或前体能够结合到纳米囊泡的表面上并原位形成环绕所述囊泡的纳米壳。例如，在实施方式中，纳米壳的原位形成可以通过将纳米颗粒和纳米颗粒的前体(如金属盐，例如金盐或银盐)这两者添加到所述纳米颗粒中来催化。
44.如本文中所使用的，术语“纳米颗粒”是指具有纳米级粒径，小于1微米粒径的颗粒。例如，纳米颗粒可具有至多约50nm的粒径。在另一示例中，纳米颗粒可具有至多约40nm的粒径。在另一示例中，纳米颗粒可具有至多约30nm的粒径。在另一示例中，纳米颗粒可具有至多约20nm的粒径。在另一示例中，纳米颗粒可具有至多约10nm的粒径。在另一示例中，纳米颗粒可具有至多约6nm的粒径。在一个实施方式中，金纳米颗粒具有在1至4nm之间，2至6nm之间，3至7nm之间，4至8nm之间，5至9nm之间，6至10nm之间，7至11nm之间，8至12nm之间，9至13nm之间，10至14nm之间，11至15nm之间，12至16nm之间，13至17nm之间，14至18nm之间，15至19nm之间，或16至20nm之间的直径范围。
45.纳米颗粒可以是等离子体材料。可替代地，纳米颗粒可以涂覆有等离子体材料。在一个实施方式中，纳米颗粒是金属纳米颗粒。金属纳米颗粒可由金属(诸如金、银或钛)或者可以由不同金属的合金制成。在一个实施方式中，金属纳米颗粒是金纳米颗粒。在一个实施方式中，金纳米颗粒具有在7至11nm之间的直径范围。在替代性的实施方式中，纳米颗粒包含有机聚合物。
46.在一个实施方式中，前体是金属盐，其连同纳米颗粒能够形成环绕纳米囊泡的纳米壳。在一个实施方式中，金属盐是金盐。金属盐在与样品接触之前可处于溶液中。
47.如本文中所使用的，“纳米囊泡”可指在内部包括空腔的天然存在的或合成的囊泡。纳米囊泡可包括封闭内腔内容物的脂质双层膜。纳米囊泡可包括脂质体、外泌体、细胞外囊泡、微囊泡、凋亡囊泡(或凋亡小体)、液泡、溶酶体、转运囊泡、分泌囊泡、气体囊泡、基质囊泡或多泡体。纳米囊泡可具有约1000nm或更小、约900nm或更小、约800nm或更小、约700nm或更小、约600nm或更小、约500nm或更小、约450nm或更小、约400nm或更小、约350nm或
更小、约300nm或更小、约250nm或更小、约240nm或更小、约230nm或更小、约220nm或更小、约210nm或更小、约200nm或更小、约190nm或更小、约180nm或更小、约170nm或更小、约160nm或更小、约150nm或更小、约140nm或更小、约130nm或更小、约120nm或更小，约110nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约70nm或更小、约60nm或更小、约50nm或更小、约40nm或更小、约30nm或更小、约20nm或更小、或约10nm或更小的尺寸。
48.在一个实施方式中，纳米囊泡是外泌体。术语“外泌体”是指由真核细胞脱落或从质膜出芽到细胞外部的囊泡。外泌体的大小可以是参差的，直径范围从约10nm至约5000nm。
49.本文公开了一种用于检测与样品中的纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标的方法，所述方法包括以下步骤：
50.a)使样品与纳米颗粒或纳米颗粒的前体以及一种或更多种荧光分子探针依次或同时接触，其中所述纳米颗粒或前体能够结合到所述纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕所述纳米囊泡的纳米壳，并且其中所述一种或更多种荧光分子探针能够特异性结合至与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标并且为每种所述靶标提供独特发射荧光波长；以及
51.b)照射所述样品并且测量所发射的荧光，以检测与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标，其中所述检测涉及识别每种所述靶标的独特发射荧光波长的增强荧光淬灭。
52.在一个实施方式中，荧光分子探针的光学性质与纳米壳的光谱兼容性相匹配，以增强检测信号。
53.在一个实施方式中，荧光分子探针的光学性质与纳米壳的光谱兼容性相匹配，以区分存在于不同尺寸细胞外囊泡内的生物标志物或者与不同尺寸细胞外囊泡缔合的生物标志物。
54.待检测的靶标可以与样品中的纳米囊泡结合或缔合。该靶标可以称为“生物标志物”。例如，靶标可以是与纳米囊泡结合或缔合的核酸、脂质、蛋白、肽、代谢物或糖肽。在一个实施方式中，靶标是核酸(诸如rna)。在一个实施方式中，靶标是蛋白，诸如膜蛋白或膜相关蛋白。在一个实施方式中，靶标是脂质。在一个实施方式中，靶标是代谢物。如本文所指的靶标还可包括经修饰的蛋白、核酸、脂质和代谢物。在一个实施方式中，本文限定的方法能够区分可与纳米囊泡结合或缔合的不同类型的靶标。
55.在一个实施方式中，靶标是癌症生物标志物。癌症生物标志物例如可以是cd24、epcam或muc1。
56.在一个实施方式中，靶标是外泌体生物标志物。外泌体生物标志物可为cd63。
57.如本文中所描述的，术语“核酸”可以是rna或dna，并且可以是单链或双链的，并且可以是例如编码感兴趣蛋白的核酸、多核苷酸、寡核苷酸、核酸类似物。此类核酸序列包括，例如但不限于，编码蛋白(例如充当转录阻遏物)的核酸序列、反义分子、核酶、小的抑制性核酸序列，例如但不限于rnai、shrnai、sirna、微小rnai(mrnai)、反义寡核苷酸等。
58.术语“蛋白”和“多肽”可互换使用，并且是指通过肽键或修饰的肽键连接的任何氨基酸聚合物(二肽或更高肽)。少于约10至20个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。本发明的多肽可以包含非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可以由产生该多肽的细胞而加成到多肽中，并且会随细胞类型而变化。多肽在本文中根据其氨基酸骨
架结构进行限定；取代基，诸如碳水化合物基团通常没有具体说明，但仍然可以存在。
59.在一个实施方式中，该方法涉及使样品与形成纳米壳所需的过量纳米颗粒接触。
60.一种或更多种荧光分子探针可能够特异性结合与纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标。这可为每个所述靶标提供独特(或特定)发射荧光波长，从而能够将每个所述靶标彼此区分开。
61.荧光分子探针可以是核酸、适配体、抗体或小分子。荧光分子探针可以是与荧光染料连接的分子探针，诸如核酸、适配体、抗体或小分子。用于荧光标签化的荧光染料的示例包括具有荧光素(fluorescein)、罗丹明、香豆素、cy、evoblue、噁嗪、carbopyronin、萘、联苯、蒽、菲、芘、咔唑等作为骨架的荧光染料或这些荧光染料的衍生物。荧光染料的示例包括但不限于荧光素、罗丹明b和alexa fluor 647。
62.术语“适配体”是指可以在三维上符合从而以高亲和力和特异性结合另一分子的寡核苷酸。适配体的识别通常选自大型随机序列库，但天然适体也存在于核糖开关中。适配体可大致分为：核酸(dna或rna)适配体，其由寡核苷酸链(通常较短)组成；或者，肽适配体，由两端附接到蛋白支架的短的可变肽结构域组成。适配体，如由噬菌体展示或单克隆抗体(mab)产生的肽，能够特异性结合选定的靶标，并通过结合阻断或以其它方式改变它们结合的靶标分子的功能。适配体通常通过体外选择过程(诸如，如selex)从随机序列寡核苷酸库中识别。已经为100多种蛋白(包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体)生成了适配体。典型的适体大小为10至15kda(30至45个核苷酸)，以亚纳摩尔亲和力结合其靶标，并区分密切相关的靶标(例如，通常不会结合来自同一基因家族的其它蛋白)。
63.在一个实施方式中，适配体包括选自由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4组成的组中的核酸序列。适配体可以与荧光染料缀合。
[0064]“抗体”是指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语扩展至表现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白框架。可用于实施本发明的代表性抗原结合分子包括多克隆和单克隆抗体以及它们的片段(诸如fab、fab’、f(ab’)2、fv)，单链(scfv)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼类抗体)，包含抗体的融合蛋白，以及包含抗原结合/识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任何种类的抗体，诸如igg、iga或igm(或其亚类)，并且该抗体不需要是任何具体种类的。
[0065]
在一个实施方式中，抗体选自由抗cd63抗体、抗cd24抗体、抗epcam抗体和抗muc1抗体组成的组。
[0066]
该方法可包括照射样品并且测量所发射的荧光，以检测与纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标。该检测可涉及识别每种所述靶标的独特发射荧光的增强荧光淬灭。
[0067]
术语“增强荧光淬灭(enhanced fluorescence quenching)”可以指与参考相比，荧光淬灭水平的增加。例如，参考可以是在不存在与纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标的情况下，所发射的荧光。
[0068]
在一个实施方式中，样品是已经从受试者获得的样品。在一个实施方式中，受试者是患有癌症的受试者。
[0069]
术语“样品”可以指源自或包含细胞、生物体(细菌、病毒)、裂解的细胞或生物体、细胞提取物、核提取物、细胞或生物体的组分、细胞外液、体外培养细胞或生物体的培养基、血液、血浆、血清、胃肠道分泌物、尿液、腹水、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰涎、囊
液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液、胸膜液、乳头抽吸物(nipple aspirates)、母乳、皮肤的外部部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道，以及前列腺液的任何样品。
[0070]
样品可以是生物样品，指的是它来源于或得自于活生物体的事实。生物体可以在体内(例如整个生物体)或可以在体外(例如在培养基中生长的细胞或器官)。“生物样品”还指来自受试者的细胞或细胞群或一定量的组织或流体。大多数情况下，样品已从受试者中取出，但术语“生物样品”也可以指在体内分析的细胞或组织，即未从受试者中取出。通常，“生物样品”将包含来自受试者的细胞，但该术语也可以指非细胞生物材料，诸如血液、唾液或尿液的非细胞部分。生物样品可以来自原发性、继发性或转移性肿瘤的切除、支气管镜活检或核心针活检，或来自胸膜液的细胞块。此外，细针抽吸的生物样品也是有用的。在一个实施方式中，生物样品是腹水。生物样品还包括源自患者组织的外植体和原代细胞培养物和/或转化的细胞培养物。生物样品可通过从受试者中取出细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞或细胞提取物(例如，由另一个人在另一个时间和/或为了另一个目的而分离的)来完成。也可以使用存档的组织(archival tissues)，诸如具有治疗或结果历史的那些。生物样品包括但不限于组织活检物、刮擦物(例如口腔刮擦物)、全血、血浆、血清、尿液、唾液、细胞培养物或脑脊液。本文所指的样品可能已用于进行纳米囊泡，诸如外泌体的纯化或富集。
[0071]
术语“癌症”和“癌的(cancerous)”是指或描述哺乳动物中通常部分地以不受调节的细胞生长为特征的生理症状。如本文中所使用的，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期癌症和晚期癌症。术语“癌前病变”是指通常先于或发展为癌症的症状或生长。“非转移性”意味着癌症是良性的或保留在原发位点并且尚未渗入淋巴或血管系统或除原发部位以外的组织。通常，非转移性癌症是0、i或ii期癌症的任何癌症，偶尔也可以是iii期癌症。“早期癌症”意味着非侵袭性或转移性或者被分类为0、i或ii期癌症的癌症。术语“晚期癌症”通常是指iii期或iv期癌症，但也可以指ii期癌症或ii期亚期的癌症。本领域技术人员将理解将ii期癌症分类为早期癌症或晚期癌症取决于癌症的具体类型。癌症的示例性示例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、恶性上皮肿瘤(carcinoma)、黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、直肠癌和食道癌。在一个示例中，癌症是结肠直肠癌或胃癌。
[0072]
如本文所使用的，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。在一个实施方式中，受试者是人。术语“非人类动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
[0073]
在一个实施方式中，一种或更多种靶标的表征包括测量与纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标的水平。
[0074]
本文公开了用于进行本文限定方法的微流体芯片。微流体芯片可包括一个或多个微流体通道(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个微流体通道)。在本文所述的方法中使用微流体显著降低检测所需的样品量。
[0075]
微流体通道可以具有多种功能。每个通道可以是流体独立的(例如具有自己的流体入口和出口)。例如，微流体通道可用于促进样品与荧光分子探针的混合，或促进样品与
纳米颗粒的混合。这些步骤可以同时或依次进行。最后，微流体通道还可用于促进纳米壳围绕纳米囊泡的原位生长。微流体通道还可用于将反应混合物转移到收集室，用于芯片上或基于智能手机的荧光测量。在一个实施方式中，微流体芯片是如图9所示的芯片。
[0076]
本文公开了用于进行本文限定方法的试剂盒。该试剂盒可包含试剂，诸如用于结合与纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标的荧光分子探针、能够结合到纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕纳米囊泡的纳米颗粒和前体。该试剂盒可进一步包括缓冲液、使用说明书等。该试剂盒还可以提供如用于进行本文公开的方法的本文限定的微流体芯片。
[0077]
本文公开了通过同时检测或表征一种或更多种靶标来确定受试者中癌症的预后的方法，所述一种或更多种靶标与来自所述受试者的样品中的纳米囊泡结合或缔合并且指示所述癌症的性质，所述方法包括：
[0078]
a)使样品与纳米颗粒、前体以及一种或更多种荧光分子探针依次或同时接触，其中所述纳米颗粒或前体能够结合到所述纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕所述囊泡的纳米壳，并且其中所述一种或更多种荧光分子探针能够特异性结合至与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标并且为每种所述靶标提供独特发射荧光波长；以及
[0079]
b)照射所述样品并且测量吸光度和/或所发射的荧光，以检测与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标，其中所述检测涉及识别每种所述靶标的独特发射荧光波长的增强荧光淬灭。
[0080]
如本文所指的术语“预后”是指对临床病症或疾病的可能病程和结果的预测。通常通过评估指示疾病的有利或不利病程或结果的疾病因素或症状来做出患者的预后。如本文所使用的短语“确定预后”是指本领域技术人员可以预测患者中病症的病程或结果的过程。术语“预后”并不是指以100％的准确度预测病程或结果的能力。相反，本领域技术人员将理解的是，术语“预后”是指某一病程或结果将来要发生的概率增加；也就是说，与没有表现出该病症的那些个体相比，表现出给定病症的患者更有可能发生病程或结果。预后可以表示为预期患者可以存活的时间量。可替代地，预后可以指疾病进入缓解期的可能性或可以预期疾病保持缓解期的时间量。预后可以用多种方式表示；例如，预后可以表示为患者在一年、五年、十年等后存活的机会百分比。可替代地，预后可以表示为预期患者由于某种病症或疾病而可以存活的平均月数。患者的预后可以被认为是一种相对论的表现，影响最终结果的因素很多。例如，对于患有某些疾病的患者，预后可以适当地表示为病症可以被治疗或治愈的可能性，或者疾病将进入缓解期的可能性，而对于病症更严重的患者，预后可以更适当地表示为在特定时间段内存活的可能性。
[0081]
在一个实施方式中，癌症是结肠直肠癌或胃癌。如本文所限定的方法可以指确定受试者中癌症(诸如结肠直肠癌或胃癌)的预后。该方法可以包括从受试者获得样品。例如，样品可以是来自受试者的临床癌症腹水。
[0082]
在一个实施方式中，患有癌症的受试者在具有超过十个月的预期(或预测)总存活期时被确定为具有良好预后。在另一个实施方式中，患有癌症的受试者在具有少于五个月的预期(或预测)总生存期时被认为具有不良预后。
[0083]
在一个实施方式中，一种或更多种靶标包括选自由cd63、cd24、epcam和muc1组成的组的靶标。
[0084]
在一个实施方式中，该方法包括治疗受试者。如本文中所使用的，术语“治疗”可指
(1)预防或延缓一种或更多种疾病症状的出现；(2)抑制疾病或疾病的一种或更多种症状的发展；(3)减轻病症，即引起疾病或疾病的至少一种或更多种症状缓解；和/或(4)引起疾病的一种或更多种症状的严重性降低。
[0085]
本文公开了一种通过同时检测或表征一个或多个靶标来检测受试者中癌症的方法，其中，所述一个或多个靶标与来自受试者的样品中的纳米囊泡结合或缔合并指示癌症的存在，该方法包括：
[0086]
a)使样品与纳米颗粒或纳米颗粒的前体以及一种或更多种荧光分子探针依次或同时接触，其中所述纳米颗粒或前体能够结合到所述纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕所述纳米囊泡的纳米壳，并且其中所述一种或更多种荧光分子探针能够特异性结合至与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标并且为每种所述靶标提供独特发射荧光波长；以及
[0087]
b)照射所述样品并且测量吸光度和/或所发射的荧光，以检测与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标，其中所述检测涉及识别每种所述靶标的独特发射荧光波长的增强荧光淬灭。
[0088]
在一个实施方式中，该方法包括确定受试者中癌症存在(或不存在)的可能性。
[0089]
在一个实施方式中，该方法进一步包括治疗被发现患有癌症的受试者。
[0090]
本文公开了一种通过同时检测或表征一个或多个靶标来治疗受试者中癌症的方法，其中，所述一个或多个靶标与来自受试者的样品中的纳米囊泡结合或缔合并指示癌症的存在，该方法包括：
[0091]
a)使样品与纳米颗粒或纳米颗粒的前体以及一种或更多种荧光分子探针依次或同时接触，其中所述纳米颗粒或前体能够结合到所述纳米囊泡的表面上并且原位形成环绕所述纳米囊泡的纳米壳，并且其中所述一种或更多种荧光分子探针能够特异性结合至与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标并且为每种所述靶标提供独特发射荧光波长；
[0092]
b)照射所述样品并且测量吸光度和/或所发射的荧光，以检测与所述纳米囊泡结合或缔合的一种或更多种靶标，其中所述检测涉及识别每种所述靶标的独特发射荧光波长的增强荧光淬灭；以及
[0093]
c)治疗被发现患有癌症的受试者。
[0094]
如本文所使用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及在解释为替代例(或)时缺少组合。
[0095]
如在本技术中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the(所述/该)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“试剂”包括多种试剂，包括它们的混合物。
[0096]“约”是指数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度变化多达15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％到参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。
[0097]
在整个说明书和随后的陈述中，除非上下文另有要求，否则词语“comprise(包括)”以及诸如“comprises(包括)”和“comprising(包括)”的变型将被理解为暗示包含所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。
[0098]
本说明书中对任何在先出版物(或源自于其的信息)或任何已知事项的引用不是
也不应被视为对该在先出版物(或源自于其的信息)或已知事项构成本说明书所涉及的努力领域中的公知常识的一部分的承认或认可或任何形式的暗示。
[0099]
本领域的技术人员将理解的是，本文描述的本发明容易受到不同于具体描述的变型和修改。应当理解的是，本发明包括落入精神和范围内的所有这些变型和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
[0100]
实施例
[0101]
方法
[0102]
细胞培养
[0103]
所有人类癌细胞系均获自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)。dld-1、hct116、gli36viii在补充有10％胎牛血清(fbs，gibco)和1％青霉素-链霉素(gibco)的dulbecco改良基本培养基(hyclone)中生长。mkn45、snu484和pc9在补充有10％fbs和1％青霉素-链霉素的rpmi-1640培养基(hyclone)中培养。所有细胞系都经过测试，没有支原体污染(mycoalert mycoplasma detection kit，lonza，lt07-418)。
[0104]
外泌体分离和量化
[0105]
在收集囊泡之前，在囊泡耗尽的培养基(含有5％囊泡耗尽的dfbs)中培养处于第1-15代的细胞48小时。所有含有细胞外囊泡的培养基均通过0.2-μm膜过滤器(millipore)过滤，通过差速离心(首先以10000g，随后以100000g)进行分离。使用纳米颗粒示踪分析(nta)系统(ns300，nanosight)进行囊泡浓度的独立量化。将囊泡浓度调整为在视野中获得约50个囊泡，以实现最佳计数。所有nta测量均使用相同的系统设置进行，以保持一致性。
[0106]
aunp的合成和表征
[0107]
除非另有说明，否则用于合成和修饰的所有化学品均购自sigma-aldrich。aunp是通过柠檬酸钠方法制备的。简而言之，通过改变反应中柠檬酸钠的量来合成不同大小的aunp。在典型的合成中，为了制备直径为9nm的aunp，将50ml无水柠檬酸三钠(0.6mg/ml)加热至沸腾。随后，将250μl氯化金(iii)三水合物(haucl4·
3h2o，20mg/ml)快速注入沸腾溶液中并反应30分钟以生成aunp。冷却至室温后，将9ml制备的溶液与1ml聚乙烯亚胺(pei，10％，在水中)混合以取代aunp上的表面配体。然后将pei包裹的aunp在20000g下离心1小时以去除过量的反应物，并使之重新悬浮，保持在4℃以备将来使用。对于aunp表征，使用透射电子显微镜(jeol 2010f)测量颗粒核直径。使用zetasizer nano zs仪器(malvern)确定aunp的流体动力学直径和ζ电位。进行了3
×
14次测量运行。分析z-平均直径和多分散性。对于每次测量，均监测自相关函数和多分散性指数，以确保用于大小确定的样品质量。用光谱法(tecan)测量aunp的光学吸光度。
[0108]
pda颗粒的合成和表征
[0109]
为了制备作为靶标模板的不同大小的pda纳米颗粒，将1ml盐酸多巴胺(0.5mg/ml，在水中)与不同体积的氢氧化钠溶液(4mg/ml，体积在1至50μl之间变化)混合。将混合物在搅拌条件下于25℃下孵育12小时以生成具有明确直径的pda颗粒。所有颗粒保存在4℃以备后用。通过动态光散射分析确定粒径分布，如上所述。为了用相应的荧光团(例如，荧光素、罗丹明b和alexa fluor 647)来标签化pda颗粒，将溶解在二甲亚砜中的荧光染料添加至pda溶液(0.5mg/ml)中。将混合物在25℃下孵育12小时，然后进行样品纯化。通过酶标仪
(tecan)测量荧光强度。
[0110]
荧光适配体的制备
[0111]
在表1中可找到本研究中使用的所有适配体序列。在3’端用伯胺基团修饰的dna序列购自integrateddnatechnologies，并以最终浓度为10μm溶解在水中。为了增强适配体的荧光性能，单个适配体序列由三个荧光分子标签化。具体地，使100μl的适配体溶液与10μl的n,n-亚甲基双丙烯酰胺(1mm)在37℃下反应12小时以生成丙烯酸化的适配体。在37℃下，将此纯化的反应加入至过量的具有游离胺的4臂聚(乙二醇)(4臂-peg2k-nh2，分子量＝2000，100μm，40μl)中12小时。最后，使荧光染料(例如，alexafluor647)与聚乙二醇适配体上的游离胺缀合。在每个反应步骤之后，通过离心过滤器(amicon，分子截留＝3000)对经修饰的适配体进行纯化以去除过量的反应物。经纯化的荧光适配体保存在-20℃以备将来使用。
[0112]
表1.所用适配体、抗体和序列的列表。
[0113][0114]
光学模拟
[0115]
使用商业软件包(fdtdsolutions，lumerical)进行所有3d有限差分时域(fdtd)模拟。基于所形成的纳米结构的透射电子显微镜分析，将外泌体模板化的金纳米壳建模为核壳结构，其具有被9nm厚的金壳环绕的折射率(ri)为1.4(35)的介电核。金的复合介电常数从参考文献(36)中获得。在模拟与游离蛋白结合的aunp的场分布时，如用dfbs实验表征的那样，将生长后最终直径为14nm的aunp建模为附着至3nm蛋白。在所有方向上应用2nm的均匀网状物。在所有模拟中，形成的金纳米结构用平面波从顶部照射，并在底部记录透射(吸光度)光谱。模拟的电场分布和吸收光谱分别用于识别以外泌体和游离蛋白为模板的纳米结构的相应共振峰。
[0116]
tpex吸光度测定
[0117]
为了实验性地评估和验证光学模拟，首先对不同直径的pda纳米颗粒进行tpex测
定。这些pda纳米颗粒被用作具有明确大小分布的靶标模板。简而言之，将5μl的pda溶液与5μl的aunp溶液在室温下孵育15分钟，以使aunp自组装在pda表面上。未经任何纯化，将含有10μl过氧化氢(3％)、35μl pbs缓冲液和40μl金盐(haucl4·
3h2o，1mg/ml)的混合物加入到该反应中。将反应孵育15分钟以实现模板化的原位金生长。记录在金生长前后的吸收光谱，以将实验结果与模拟的结果进行比较。为了研究aunp直径在调节tpex吸光度响应中的影响，在进行金生长的反应之前，将pda纳米颗粒与不同尺寸的aunp一起孵育。为所有后续的tpex测量选择9-nm aunp，以便将tpex响应范围与公布的外泌体直径相匹配并最大化。将优化的tpex测定进一步应用于生物样品。如上所述，通过差速离心制备细胞外囊泡和囊泡耗尽的fbs(dfbs)。所有样品均通过nta和动态光散射分析进行表征。如上文pda反应中所述，用aunp处理生物样品并进行金生长。用光谱法测量金生长前后的相应吸收光谱图。
[0118]
tpex荧光测定
[0119]
为了检测分子标志物，开发了tpex荧光测定。用荧光的抗cd63适配体对该测定进行优化。使用从细胞系分离的外泌体以及游离cd63蛋白(proteintech)，将这些样品与0.5μl荧光适配体(10μm)一起孵育30分钟。随后，将5μl aunp(9nm)添加到该反应中并孵育15分钟。如上所述，在没有任何纯化的情况下，将10μl过氧化氢(3％)、35μl pbs缓冲液和40μl金盐(haucl4·
3h2o，1mg/ml)添加到该反应中。对于多重荧光检测，将不同的荧光适配体添加到样品中，并在aunp孵育之前同时孵育。对于所有tpex荧光测量，包括与加扰适配体一起孵育的样品匹配对照。测量tpex反应前后的荧光强度。
[0120]
tpex分析
[0121]
基于光学模拟和实验验证，tpex吸光度和荧光测量限定如下：
[0122]
δa＝a之后
–
a之前
[0123]
其中a之后＝aunp孵育和金生长之后的tpex吸光度信号(a)，a之前＝aunp孵育后但金生长之前的tpex吸光度信号(a)，并且a＝a750/a540
[0124]
其中a750和a540分别是波长750nm和540nm处的吸光度强度。
[0125]
δf＝1
–
f样品/f对照
[0126]
其中f样品＝金生长后，与具有不同发射光谱的靶标探针一起孵育的样品的荧光强度，f对照＝金生长后，与加扰的荧光探针一起孵育的样品匹配对照的荧光强度。
[0127]
tpex抗体和mirna检测
[0128]
对于使用抗体的tpex测量，从各种细胞系中分离外泌体，并将样品与荧光抗体(抗cd63、bd biosciences和抗cd24，ebioscience，1μg/ml)一起孵育。如上所述，未经任何纯化，将aunp以及金盐混合物添加到该反应中，并测量所得的荧光变化。将所有测量结果与使用相同抗体进行的金标准elisa分析进行比较(详见下文)。
[0129]
对于tpex mirna检测，对整个外泌体进行额外的固定和透化(bd biosciences)，然后用针对mirna靶标的荧光dna探针(integrated dna technologies，10μm)进行标签化。如上所述，未经任何纯化，将aunp以及金盐混合物添加到该反应中，并测量所得的荧光变化。通过聚合酶链反应(pcr，applied biosystems)将所有测量结果与金标准taqman测定(thermo scientific)进行比较。
[0130]
微流体装置制造
[0131]
通过标准软光刻制造包括三个区域的原型微流体装置(图6)。简而言之，使用洁净
室掩模对准器(suss microtec)通过su-8光刻胶和硅晶片对50μm厚的铸模进行图案化，并在uv曝光后显影。聚二甲基硅氧烷(pdms，dow corning)和交联剂以10:1的比例混合并浇注在su-8模具上。首先，使聚合物在75℃下固化30分钟。然后，将多个尼龙螺钉和六角螺母(rs组件)放置在pdms薄膜上它们各自的通道上，并嵌入到pdms中，然后进行最终固化步骤。
[0132]
微流体tpex测定
[0133]
微流体测定的操作步骤如图9所示。在典型的程序中，将1μl的生物样品和0.3μl的荧光适配体溶液(10μm)分别通过入口1和入口2加载到微通道中。使该溶液在蛇形通道中充分混合，以促进外泌体膜生物标志物的适配体标签化。将在入口3处预加载的含有1μl的aunp、2μl的过氧化氢(3％)和8μl的pbs缓冲液的混合物引入反应中，并在微通道中以2μl/min的流速混合5分钟。最后，将在入口4处预加载的7μl金盐(haucl4·
3h2o，1mg/ml)添加到反应中，并在微通道中混合3分钟。通过基于智能手机的光学传感器记录产生的荧光强度。
[0134]
基于智能手机的传感器
[0135]
为了能够对微流体tpex测定进行智能手机分析，开发包括四个组件(图1中c)的传感器：3d打印光学笼、三色led光源、三个滤光片和放大镜。使用台式3d打印机(envisiontec，aureus)由uv固化树脂(htm 140)制造光学笼。定制的led光源(chaoziran s&t)具有三个led二极管，中心波长分别为365nm、540nm和750nm(图19中a)。中心波长为520nm、590nm和665nm的三个带通滤光片分别用于测量荧光素、罗丹明b和alexa fluor 647。放大镜(thorlabs la4280)放置在智能手机摄像头之前以提高图像质量。经测量，组装后的系统尺寸为45mm(宽)
×
45mm(长)
×
50mm(高)，并配备两个滑动槽，用于快速连接到智能手机(apple)。对于不同的荧光染料和强度，针对商用酶标仪(tecan)评估传感器性能(图19中c)。
[0136]
蛋白印迹
[0137]
在含有蛋白酶抑制剂(thermo scientific)的放射免疫沉淀测定(ripa)缓冲液中裂解通过超速离心分离的外泌体，并使用二辛可宁酸测定(bca测定，thermo scientific)进行量化。蛋白质裂解物通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分解，转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf，invitrogen)上，并用针对蛋白标志物：cd63(invitrogen)、alix(cell signaling)、hsp70(biolegend)、lamp-1(bd biosciences)、flotillin 1(bd biosciences)和tsg101(bd biosciences)的抗体进行免疫印迹。在与辣根过氧化物酶缀合的二抗(cell signaling)一起孵育后，使用增强的化学发光进行免疫检测(thermo scientific)。
[0138]
elisa
[0139]
将捕获抗体(5μg/ml)吸附到elisa板(thermo scientific)上，并在含有1％bsa的pbs中封闭，然后与样品一起孵育。用pbst(含0.05％tween 20的pbs)洗涤后，加入检测抗体(1μg/ml)，并在室温下孵育2小时。在与辣根过氧化物酶缀合的二抗(thermo scientific)和化学发光底物(thermo scientific)孵育后，测定化学发光强度(tecan)。
[0140]
透射电子显微镜
[0141]
将样品溶液直接沉积在聚醋酸甲基乙烯脂-碳(formvar-carbon)膜涂覆的铜网格(latech)的表面上。用透射电子显微镜(jeol 2010f)对干燥的样品进行成像。
[0142]
临床测量
[0143]
该研究得到了国立大学医院(2016/01088)和singhealth(2015/2479)机构审查委员会的批准。在获得知情同意后，根据irb批准的协议招募所有受试者。从结肠直肠癌和胃癌患者中收集腹水样本，以500g离心10分钟，并通过0.2-μm膜过滤器(millipore)过滤。所有样品都被去识别化并保存在-80℃，然后进行tpex测量。
[0144]
对于临床tpex分析，直接使用腹水样本。将腹水样品与针对不同生物标志物的荧光适配体一起孵育，并使腹水样品经受tpex反应(即，aunp孵育和原位金生长)。对于所有tpex测量，包括患者样本匹配的加扰对照。相对于该对照进行tpex分析以表明适配体的非特异性结合。患者特征的临床评估是独立确定的。具体地，患者预后由自收集腹水时的总存活期决定。当总存活期超过十个月时，则患者被认为预后良好。相反，如果总存活期少于五个月，则确定患者预后不良。所有tpex测量均在不知情的情况下进行，不受这些临床评估的影响。
[0145]
统计分析
[0146]
所有测量一式三份进行，数据显示为均值
±
标准偏差。通过双尾学生t检验进行显著性检验。对于样品间比较，分别测试了多对样品，并使用bonferroni校正调整所得p值以进行多重假设检定法(multiple hypothesis testing)。调整后的p《0.05被确定为是显著的。使用线性回归进行相关性分析以确定拟合优度(r2)。对于临床分析，使用tpex和elisa测量来开发用于疾病预后分类的多元线性回归评分模型。为了避免过度拟合并评估性能，进行了留一法交叉验证。对于单个标志物，从标志物表达确定接受者操作特征(roc)曲线。对于多标志物分析，基于回归评分绘制roc曲线。使用r(v.3.5.0)和graphpad prism(v.7.0c)进行统计分析。
[0147]
实施例1
[0148]
tpex平台
[0149]
tpex平台设计用于从非囊泡、游离分子中区分并测量外泌体标志物(即，组成和结合标志物)。它由三个功能性步骤组成：双标签化、模板化纳米等离子体的发展，以及信号检测(图1中a)。在第一步中，将复杂的生物混合物(例如，外泌体和游离蛋白)与荧光分子探针(例如，适配体)以及金纳米颗粒(aunp)一起孵育。虽然aunp在与游离蛋白缔合时保持单分散，但由于蛋白冠的熵驱动形成，它们通过与外泌体膜的静电相互作用组装到外泌体外围。未去除过量的未结合探针和aunp。在下一步中，aunp作为原位纳米材料生长的种子。与游离蛋白缔合的aunp(或未结合的aunp)经历较慢的生长，并且在其吸收光谱中显示出最小的红移。相反，与外泌体表面结合的aunp发展成以囊泡尺寸为模板的纳米壳，在红外区引起强烈的局部等离子体共振(23)。tpex平台充分利用由此产生的纳米材料形态和等离子体特性中的明显差异来实现外泌体标志物的同时和多选择性测量。具体地，纳米壳的光谱兼容性以外泌体膜为模板，并经调整以区分外泌体尺寸(即对外泌体的生物物理特性具有选择性)；仅当探针靶向结合并共定位作为形成的纳米壳的同一囊泡上时(即，对分子标志物具有选择性)，才能观察到探针增强的荧光淬灭。由于游离蛋白引起的信号变化最小，tpex平台能够直接量化天然生物流体中的外泌体标志物，避免任何纯化。
[0150]
为了证实tpex引起的纳米材料的形态变化，在金生长前后，进行透射电子显微镜(tem)分析(图1中b)。在游离蛋白的存在下(图6中a)，aunp(平均直径＝9.2nm)保持良好分散，并在tpex反应后表现出小的颗粒生长。当与源自人结肠直肠腺癌细胞系(dld-1)的外泌
体一起孵育时(图6中b-d)，aunp结合至囊泡外围。tem分析进一步证实了纳米材料生长后，存在大的球状颗粒，与以外泌体为模板的金纳米壳的形成一致(图7中a-b)。形成的纳米材料的吸收光谱与tem表征非常吻合(图7中c-d)。为了促进复杂临床生物流体的tpex测量，该技术在小型化微流体系统中实施(图1中c)。该装置并入有用于有效标签化的蛇形混合器和用于流体控制的扭矩激活阀(图8)，并且设计用于简化tpex测定操作(图9)。此外，微流体系统可以装载到定制设计的基于智能手机的光学检测器上(图1中d)，通过不同配置的led光源和滤光片设置实现吸光度和荧光测量。基于图像的数据采集和分析可以通过智能手机界面自动实现。
[0151]
外泌体模板化的纳米等离子体
[0152]
为了评估生物标志物模板大小对tpex等离子体性能的影响，从而对于外泌体尺寸来优化技术，首先对一系列模板直径进行数值模拟(图2中a)。基于形成的纳米结构的tem表征(图1中b和图7)，模拟9nm金纳米层在外泌体大小的模板表面上生长。模拟结果表明，对于外泌体直径(30至150nm)，所得等离子体共振峰主要位于》600nm(平均峰位置在750nm处)，不同于较小模板(例如，裸aunp或与游离蛋白缔合的aunp)(图2中a)。电场分布和标准化的吸收光谱进一步证实，外泌体模板化的纳米壳和裸aunp模板化的纳米颗粒分别在750nm和540nm处表现出强共振(图10)。
[0153]
为了实验性地验证模拟结果，将聚多巴胺(pda)纳米颗粒制备为具有明确直径分布的不同大小的模板(图11中a-b)，并将这些模板与aunp(平均直径＝9.2nm)一起孵育。模板化的纳米材料生长后得到的吸收光谱证实了模拟结果。在不存在靶标模板(即裸aunp)时，在540nm附近形成单个共振峰；当与大小增加的模板反应时，在750nm处出现额外的共振峰(图11中c)。因此，tpex吸光度测量值(a)定义为在750nm和540nm处的吸光度之比，并且其差值(δa)为金生长前后的差值，用以评估大的模板化的纳米壳的形成。有趣的是，据发现，通过使用不同大小的aunp(图12)，可以精细调整tpex吸光度针对不同直径模板的响应范围(图2中b)。因此，选择9-nm aunp来用于所有后续tpex测量，以匹配外泌体直径(30至150nm)的响应范围，从而最大限度地增加外泌体引起的信号并最大限度地减少来自其它较小生物实体的背景干扰。用生物样品进一步验证经优化的tpex吸光度分析(δa)。将来自人结肠直肠腺癌(dld-1)的外泌体掺入到囊泡耗尽的fbs(dfbs)中并进行tpex反应(图6)。相应的吸光度分析反映了对外泌体的良好选择性。具体地，δa仅在外泌体存在时表现出较大的增量，而pbs(即裸aunp)和dfbs(即游离蛋白)中的反应变化可忽略不计(图2中c，左)。通过动态光散射分析确定，在金生长前后，在由此产生的粒径变化中观察到了类似的选择性(图2中c，右)。tpex的这种良好特异性归因于其形成不同的等离子体特性中利用囊泡的多种生物物理特性的测定设计；带负电荷的囊泡膜促进了aunp的静电结合，并且囊泡本身充当了开发大小兼容的金纳米壳的支架，其等离子体特性由囊泡直径模板化(图13)。借助于tpex吸光度分析的特异性，评估用于确定外泌体浓度的系统。将来自不同细胞来源的外泌体(dld-1、hct116、mkn45和snu484，图14)稀释至不同浓度，通过金标准纳米颗粒示踪分析进行量化，然后加入dfbs。在所有测试的加标样品中，tpex吸光度分析可以直接确定外泌体浓度(图15)，并证明与金标准测量值具有良好的相关性(r2＝0.931)(图2中d)。
[0154]
外泌体标志物的多重荧光检测
[0155]
该技术接下来被扩展用于外泌体分子标志物的多重检测。利用tpex纳米壳的等离
子体特性来淬灭共定位的荧光探针。为了评估该技术，制备各种大小的pda纳米颗粒，并将荧光染料(a647)附着在pda表面。使纳米颗粒经受tpex反应(即，aunp孵育和金生长)并监测其荧光强度的变化(δf)和吸光度信号的变化(δa)(图3中a)。两种分析都显示出类似的趋势，并证明了对于外泌体直径进行的优化模板大小响应范围。接下来应用tpex荧光分析来进行外泌体标志物评估。使用cd63(在大多数外泌体中发现且具有特征的四跨膜蛋白)作为阳性对照靶标，制备两个样品以评估技术特异性：包含cd63(源自dld-1细胞系)的完整外泌体以及游离cd63蛋白(图3中b)。将样品与荧光适配体(抗cd63和加扰对照)一起孵育以用于tpex测量。每个适配体用三个相同的荧光分子修饰(图16)以增强其信号性能(图17)。重要的是，对三种不同类型的荧光染料(即荧光素/fitc、罗丹明b/rhb、alexa fluor 647/a647)进行评估，选择它们不同的激发和发射谱，以检查共振光谱匹配对tpex分析的影响。在所有测试的荧光染料中，仅在外泌体存在时，tpex显示出显著信号，而对游离cd63蛋白显示的信号可忽略不计。经a647修饰的适配体，其发射峰(665nm)与tpex吸光度(750nm)最接近，表现出最大的信号差异(图3中b)。与发表的报告一致，这些观察结果表明tpex荧光淬灭受金纳米壳表面电子转移(即距离效应)以及光谱匹配(即等离子体和荧光)的影响。
[0156]
采用不同的荧光适配体，开发了一种用于在单个测试中同时检测多个外泌体标志物的多重tpex分析。将来自人类癌细胞(即dld-1和mkn45)的外泌体与不同的荧光适配体一起孵育，单独(单重)或以混合物(多重)的形式用于tpex测量(图3中c)。多重荧光光谱与单重光谱一致，可以准确地揭示标志物表达谱。此外，这种多重tpex测定可适用于荧光抗体的蛋白测量，并扩展用于所有外泌体中mirna的原位分析(图18)。该技术的分子检测灵敏度通过滴定分析进一步确定(图3中d)。通过纳米颗粒示踪分析测量外泌体计数。通过cd63适配体分析确定的测得的tpex反应与外泌体计数相关，并确定了检测限为约1500个外泌体。这种观察到的灵敏度是elisa分析的灵敏度的》103倍。
[0157]
复杂背景下的原位分析
[0158]
接下来，对tpex平台进行评估，以针对天然生物流体(即人血清)的复杂生物背景测量外泌体标志物特征。通过将来自各种人类细胞系(即dld-1、hct116、mkn45、gli36viii和pc9)的外泌体添加到囊泡耗尽的人血清中来制备模拟临床样品。基于已发表的文献，测量以下蛋白质标志物：外泌体标志物cd63以及推定的癌症标志物(包括cd24、epcam和muc1)的表达。通过微型化微流体系统和智能手机检测平台(图1中c-d)对经添加的样品进行tpex分析，显示出与商业酶标仪的良好性能相关性(图19)。
[0159]
对于所有添加血清的样品，还使用传统的夹心elisa测定进行比较分析(适配体和抗体列表参见表1)。对于所分析的每个标志物，与纯外泌体特征(在添加前从相同的外泌体获得)相比，tpex分析显示出反映跨细胞系的表达趋势的更好一致性(图4中a)。具体地，经添加的样品(spiked sample)的tpex分析显示出与纯外泌体特征的良好相关性(r2＝0.9299，图4中b，左)，而对相同经添加的样品进行的elisa测量显示出显著较差的相关性(r2＝0.03211，图4中b，右)。这种性能差异归因于tpex在直接针对复杂背景测量外泌体标志物时的多选择性(即外泌体生物物理特性和生物标志物组成)。然而，elisa分析仅对标志物敏感，并且可能受靶标蛋白的自由浮动形式(例如人血浆中未结合的蛋白)影响。
[0160]
临床预后的tpex分类
[0161]
为了评估tpex的临床效用，最后使用患者腹水样品进行可行性研究。目的是解决
以下问题：(1)tpex是否可以直接应用于临床样本来用于多重测量，(2)tpex在区分外泌体靶标方面的准确性，以及(3)tpex特征是否可以区分其他临床表征(例如，预后)。获得癌症腹水样品(n＝20；12例结肠直肠癌和8例胃癌)，并使用小型化微流体和检测器平台(图1中c-d)直接对这些样品进行多重tpex分子分析(每个天然样品，1μl)(图5中a，上)。作为比较，还进行常规的单重elisa分析以测量所有临床样品中的总靶蛋白(图5中a，下。有趣的是，tpex分析(外泌体靶标)显示出与elisa分析(总靶标)测量的不同的蛋白质表达谱，与已发表的报告一致。在所有测试的临床样品中，cd63的tpex分析可以反映囊泡计数，这是通过金标准纳米颗粒示踪分析来确定的，而总cd63蛋白的elisa分析显示与计数的一致性较差(图20)。
[0162]
使用根据腹水收集后的存活时间长度确定的个体患者的存活数据，将tpex和elisa测量用于开发用于疾病预后分类的回归评分模型。使用留一法交叉验证对这些模型进行验证，并通过接受者操作特征(roc)曲线分析(图5中b-c)来比较这些模型(混合)以及单个标志物的性能。tpex模型在两种癌症类型的预后分类中显示出更高的准确度(图5中b，曲线下面积(auc)＝0.970)，而对总靶蛋白的elisa分析显示出较低的准确度(图5中c，auc＝0.758)。这种改进的tpex性能归因于以下原因。腹水包含处于不同组织状态(例如，结合和未结合外泌体)的靶蛋白标志物。最近的研究表明，这些蛋白通过不同的机制释放并在疾病进展中发挥不同的作用，突显出外泌体作为疾病侵袭性和预后不良的更具反映性的指标的潜在用途。具体地，虽然自由浮动膜蛋白通常在细胞死亡期间释放，但外泌体在肿瘤活跃生长期间分泌，并携带多种负载物(cargoes)以促进转移。因此，tpex区分和测量这些反映性囊泡指标的能力可以促进更好的疾病分级(stratification)和预后。
[0163]
讨论
[0164]
外泌体在介导疾病进展中起重要作用。在体液中发现的其它异质循环因子中，它们通过主动分裂癌细胞的策划性释放以及在调节肿瘤微环境中的功能活动突显出外泌体作为更具反映性的生物标志物的临床潜力。尽管最近有这些发现，但由于现有分析方法的局限性，对天然临床样本中的外泌体进行直接和特异性分析仍然具有挑战性。具体地，外泌体具有独特的生物物理和生物分子性质。然而，目前对外泌体群体的检测主要依赖于独立方式或以顺序方式进行的生物物理或生化表征。这种分析不仅易于遗漏囊泡亚群，而且无法同时提供囊泡生物物理学和生物分子组成的多参数分析。
[0165]
为了克服这些挑战，开发了tpex平台作为通过同时和原位评估相同囊泡的生物物理和生化组成来直接在临床样品中对外泌体进行多选择性分子分析的专用分析平台。该技术非常适合用于外泌体的快速和多参数分析：(1)测定设计是多选择性的，针对外泌体的生物物理性质(例如，膜包膜和特征尺寸)和相同囊泡的共定位生物分子含量；(2)该技术可适用于测量多种外泌体生物标志物(例如蛋白和mirna)，但对非囊泡、游离分子仍无反应；以及(3)用基于智能手机的传感器进行的实施不仅能够进行多模式分析(例如，吸光度和荧光)，而且还简化了测定过程以排除任何洗涤步骤。整个测定可在短短15分钟内完成，同时需要1μl天然样品。采用开发的技术，证明了tpex平台可以区分生物标志物组织状态(即外泌体缔合的vs.总生物标志物)，并且生物标志物的外泌体亚群可以更准确地区分癌症患者的预后。
[0166]
所开发技术的科学应用潜在地是广泛的。凭借其在天然临床样品中区分生物标志
物组织的强大能力，tpex技术可以很容易地扩展以测量其它分子和修饰，并研究它们与不同囊泡的结合和/或缔合。由于纳米壳的生长以囊泡生物物理学为模板，因此可以调整其等离子体特性以测量其它不同大小的细胞外囊泡(例如，肿瘤体)和分子亚型(例如，源自不同细胞来源)。通过并入其它分子探针和先进的识别机制，进一步的技术改进可以提高该技术的分析性能，以测量甚至罕见和复杂的分子修饰。这些研究不仅有助于全面的囊泡表征，而且还提供有关疾病进展过程中分泌因子的组成变化的更多见解。
[0167]
该技术也可以被开发和调整以适应不同的临床益处。具体地，tpex平台可适用于通过并入生物标志物组织、囊泡生物物理学和分子组成的多参数分析来发现新的生物标志物特征并改进现有的临床生物标志物。这些开发不仅将区分生物标志物亚群，而且还可以阐明相关生物标志物的生物物理和/或生化特性，从而为建立准确的复合特征提供新途径。对于临床翻译，tpex平台快速、灵敏且免洗。凭借其在本地患者样品中的稳健性，该系统可应用于各种疾病(例如癌症、神经退行性疾病)的各种临床样品(例如血清、尿液)。进一步的技术改进，例如多路复用微流体分区和阵列型传感器集成，可以实现高度并行检测并促进大规模临床验证。