两亲性聚合物及其用于抗原靶向递送的纳米颗粒之改进生产的用途的制作方法

1.本发明提供了用于预防和治疗自身免疫性疾病、过敏或其他慢性炎症状况以及用于产生调节性t细胞的纳米颗粒。特别地，本发明涉及一种纳米颗粒，包括胶束，其包含数均分子量(mn)为20,000g/mol或更小的两亲聚合物，使得纳米颗粒可溶于水，以及至少一种肽，其包含至少一种t细胞表位。本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述纳米颗粒。所述药物组合物可用于在受试者中产生对至少一种t细胞表位具有特异性的调节性t细胞，用于疾病的治疗或预防，其中有利于抑制特异性免疫应答。
2.此外，本发明提供了一种制备纳米颗粒的方法。


背景技术：

3.自身免疫性疾病对患者和医疗保健系统来说是一个沉重的负担。目前的治疗主要依赖于具有相当大副作用的免疫抑制药物。专门针对疾病特异性免疫病理的自身抗原特异性免疫疗法对一般免疫状态没有影响，从而代表一种未能满足的医疗需求。
4.对自身抗原的免疫耐受通过多种控制潜在致病性自身反应性淋巴细胞的机制来维持，包括调节性t细胞的缺失、克隆失能或抑制。因此，自身免疫性疾病可能是由于自身反应性淋巴细胞控制不足所致，而自身免疫性疾病免疫治疗的主要目标是通过恢复调节来诱导对自身抗原的耐受性。一种特别有希望的恢复自我耐受性的方法似乎是对自身抗原特异性cd4 cd25 foxp3 调节性t细胞的操控。这些细胞的过继转移可以预防自身免疫或炎症状况。
5.肝脏在抑制阻止诸如食物抗原的血源性抗原进入循环的不需要的免疫应答方面发挥着核心作用。肝脏的这种基本机制可用于特异性下调针对外部蛋白抗原或自身抗原的有害免疫应答。源自这些蛋白质的抗原肽，当与纳米级载体结合并静脉内给药时，模拟食物抗原触发特定肝细胞、肝窦内皮细胞(lsec)的摄取，然后产生耐受性免疫应答。因此，可以针对特定的免疫致病抗原诱导肽特异性免疫耐受，从而改善甚至消除有害的免疫应答。因此，这种方法可用于治疗已有的疾病，也可用于通过预防的方式防止相应的疾病。
6.例如，肝脏中神经抗原的异位表达可以预防患有实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)的小鼠的自身免疫性神经炎症，其中eae是一种多发性硬化症(ms)的动物模型。这一发现可以用肝脏产生神经抗原特异性调节性t细胞(tregs)的能力来解释，这些细胞具有控制和抑制自身免疫应答的强大能力。lsec在实现这一效果方面发挥着至关重要的作用。lsec在其表面表达mhc/hla i类和ii类分子，因此能够分别将肽呈递给cd8 (通过交叉呈递)和cd4 t细胞。lsec的肽抗原呈递在体外以抗原特异性方式将原初和t效应细胞转化为treg。这显然是lsec建立对血源性抗原耐受性的生理机制。
7.纳米颗粒，颗粒表面与疾病特异性抗原肽结合，就如血源性抗原，在静脉注射后靶向肝脏。在被lsec摄取后，可能是通过胞饮作用，纳米颗粒积聚在内体隔室中，肽抗原从颗粒表面释放出来。这导致由mhc/hla分子介导的那些抗原肽在lsec表面的呈递。有证据表
明，基于其抗原肽表位，下一代treg赋予了对各自自身抗原特异的免疫耐受。
8.wo2009/067349公开了一种药物组合物，其包含与芳烃受体(ahr)转录因子配体连接的生物相容性纳米颗粒，用于通过增加调节性t细胞的数量和/或活性来治疗自身免疫性疾病。
9.wo 2013/072051公开了一种药物组合物，用于在受试者中产生对至少一个t细胞表位具有特异性的调节性t细胞，用于治疗或预防疾病，其中抑制特异性免疫应答是有益的。所述纳米颗粒包含胶束和肽，所述胶束包含赋予所述纳米颗粒水溶性的两亲性聚合物，所述肽包含与所述胶束外部缔合的至少一个t细胞表位。通常建议使用可商购的聚(马来酸酐-alt-1-十八烯)，其具有为30,000至50,000g/mol分子量和约90％纯度的两亲聚合物。
10.然而，在某些医疗应用中，重要的是可以使用有效的纯化方法以非常高的纯度生产纳米颗粒。
11.本领域仍然需要改进的纳米颗粒用于治疗和预防疾病，其中抑制特定免疫应答是有益的，例如在自身免疫疾病、过敏、移植、抑制针对治疗剂或基因载体的抗药物抗体(ada)，或炎症过度、慢性或不利的疾病中，并且其中所述药物组合物适合施用于人类受试者。


技术实现要素：

12.根据本发明，上述问题通过下述纳米颗粒来解决,所述纳米颗粒包括:
13.a)胶束，其包含数均分子量(mn)为20,000g/mol或以下的两亲聚合物，以及
14.b)至少一种肽，其含有至少一种t细胞表位。
15.发明人惊奇地发现，包含具有20,000g/mol或以下数均分子量(mn)的两亲聚合物的纳米颗粒可以更容易地制备并且具有更高的纯度。
16.不受本发明纳米颗粒效果的基础理论的束缚，目前理解的是，与胶束外部缔合的至少一种肽，当lsec摄取纳米颗粒时，通过水解、蛋白水解释放或内体中的其他活动，就像血源性抗原那样处理，并在耐受性环境中呈递给t细胞。低分子量两亲聚合物能够在体内释放时排泄单个聚合物分子。这就提供了肝胆排泄，这似乎代表了纳米颗粒的优选排泄途径。
17.已经令人惊讶地发现具有20,000g/mol或更小的数均分子量(mn)的低分子量两亲聚合物可以容易地被排泄。还预计低分子量两亲聚合物及其代谢物在治疗后会迅速从体内排出。
18.发明人惊奇地发现，低分子量两亲聚合物在制备本发明的纳米颗粒期间具有优越的性能。与高分子量两亲聚合物相比，低分子量两亲聚合物在固体核包覆期间形成的聚集体更少。此外，与高分子量两亲聚合物相比，低分子量两亲聚合物可以更为有效地纯化。特别地，未结合的聚合物，当在本发明的纳米颗粒中使用低分子量两亲聚合物时，可以被更为有效地分离。
19.本发明还提供了一种包含所述纳米颗粒的药物组合物。
20.本发明还提供了包含纳米颗粒的药物组合物，其用于在受试者中产生对至少一个t细胞表位具有特异性的调节性t细胞，用于治疗或预防疾病，其中抑制特异性免疫应答是有益的。
21.最后，本发明提供了一种制备纳米颗粒的方法，包括：
22.i)获得数均分子量(mn)为20,000g/mol或以下的两亲聚合物，
23.ii)任选的纯化的所述两亲聚合物，，
24.iii)形成所述两亲聚合物的胶束，以及
25.iv)添加至少一种肽以形成所述纳米颗粒。
附图说明
26.图1是显示油酸铁络合物合成的流程图。
27.图2是显示超顺磁性氧化铁纳米颗粒(spions)合成的流程图。
28.图3是显示低分子量聚(马来酸酐-alt-1-十八烯)(lm-pmaod)合成的流程图。
29.图4是显示低分子量聚(马来酸-alt-1-十八烯)(lm-pmacod)合成的流程图。
30.图5是显示spion的聚合物涂覆的流程图。
31.图6是显示肽与本发明的纳米颗粒耦合的流程图。
32.图7显示了本发明的纳米颗粒的透射电子显微镜(tem)图像(100倍放大)。
33.图8是表示使用凝胶渗透色谱法并以聚苯乙烯作为校准标准测定的lm-pmacod的分子量分布图。
34.图9至11显示了hm-pmacod-spion样品纯化的sec色谱图。
35.图12显示了纯化lm-pmacod-spion样品的尺寸排阻色谱结果。
36.图13显示了涂覆后产物的sec色谱图。
具体实施方式
37.根据本发明，提供了纳米颗粒，包含胶束，其包含数均分子量(mn)为20,000g/mol或更低的两亲聚合物，使得纳米颗粒可溶于水，以及至少一种肽，其包含至少一种t细胞表位。所述纳米颗粒还可以包含由胶束包覆的固体疏水核。
38.根据本技术，术语“纳米颗粒(nanoparticle)”与“纳米级粒子(nanoscale particle)”可互换使用。这样的颗粒的直径为1至999nm，优选2至600nm、5至500nm、10至300nm、30至100nm或40至50nm。
39.在本发明的情况下，纳米颗粒是具有由至少胶束和与所述胶束缔合的肽形成的结构。所述肽可以与所述胶束外部结合或包封在胶束内部。
40.在本发明的一种实施方式中，本发明的纳米颗粒包含固体疏水核、包覆所述核的胶束，所述胶束包含数均分子量(mn)为20,000g/mol或更小的两亲聚合物，使得纳米颗粒可溶于水，以及至少一种肽，其包含至少一种t细胞表位。
41.胶束
42.在本发明的情况下，术语“胶束(micelle)”涉及分散在水溶液中的两亲分子的聚集体。两亲分子的亲水部分与周围的溶剂接触，将两亲分子的疏水“尾部”区域隔离在胶束内部，从而使纳米颗粒具有水溶性。这种胶束也称为正常相胶束(或水包油胶束)。
43.所述胶束可由一种，但也可由多于一种，例如两种、三种或四种两亲聚合物分子形成。所述胶束可由相同或不同的两亲聚合物分子形成。通常，在本说明书的语境中，“a”或“the”并非旨在限制为“一(one)”，除非特别说明。
44.在一种优选的实施方式中，所述胶束由单层的两亲聚合物形成。
45.这种胶束在结构上可以不同于由两亲聚合物形成的双层或脂质体。在这种情况下，本发明的纳米颗粒中不包含或者不含显著百分比(例如，不超过10％、不超过5％、或优选地，不超过1％)的所述结构。
46.在本发明的一种实施方式中，两亲聚合物用于制备至少70％，优选至少90％的胶束。在一种优选的实施方式中，所述胶束由两亲聚合物组成。
47.在本发明的一些实施方式中，纳米颗粒不包含固体疏水核。在其他实施方式中，纳米颗粒包含胶束和固体疏水核。
48.制备本发明的纳米颗粒的方法在下文详细描述。
49.两亲聚合物
50.本发明的两亲聚合物通常包含疏水区域，其包含长度为8至23，优选8至21，更优选16至18个碳原子的疏水脂族链。
51.两亲聚合物的亲水区域在水溶液中可以带负电荷。
52.在本发明的一种优选实施方式中，两亲聚合物在溶液中自发形成胶束。当存在固体疏水核时，两亲聚合物在固体核周围形成胶束，从而使纳米颗粒具有水溶性。
53.两亲聚合物的数均分子量(mn)为20,000g/mol或更小，优选10,000g/mol或更小，或6,000g/mol或更小，更优选6,000至1,000g/mol，最优选3,000至6,000g/mol。
54.数均分子量可以使用凝胶渗透色谱法(gpc)测定，优选使用聚苯乙烯作为校准标准。
55.在一种优选的实施方式中，数均分子量使用pl-gel mixed d柱在40℃的温度下测定，流动相由四氢呋喃/乙酸90/10％(v/v)组成，流速为1.0ml/min，结合折射率检测器，温度为35℃，聚苯乙烯作为校准标准。
56.在最优选的实施方式中，数均分子量的测定使用gpc和以下测量条件：
57.参考标准聚苯乙烯标准(mw(标称mp)；1000至130000g/mol柱agilent pl-gel mixed-d,300x7.5mm id,5μm柱温40℃检测器折射率检测器，于35℃流速1.0ml/min进样量20μl自动进样器温度环境运行时间15min流动相四氢呋喃/乙酸[90/10]％(v/v)流动相程序等度
[0058]
两亲聚合物可为交替共聚物。交替共聚物是其中包括两种以交替序列分布的单体单元的共聚物。
[0059]
在本发明的一种实施方式中，两亲性聚合物是马来酸酐和至少一种烯烃的共聚物。
[0060]
用来制备所述两亲性聚合物的烯烃可以选自下述的一种或多种：1-癸烯，1-十一烯，1-十二烯，1-三烯，1-十四烯，1-十五烯、1-十六烯、1-十七烯、1-十八烯、1-十九烯或1-二十烯，所述烯烃最好是1-十八烯。
[0061]
在本发明的优选实施方式中，两亲聚合物是马来酸酐和烯烃的共聚物。
[0062]
在本发明的优选实施方式中，两亲聚合物具有包含疏水烷基侧链的亲水聚马来酸酐主链。通常，所述侧链可以从5到23个碳原子，特别是9至21个原子。在最优选的实施方式中，所述侧链是线性的，具有10到18个碳原子。
[0063]
所述两亲聚合物可以包括以下结构块：
[0064][0065]
其中r是氢碳酸基团或取代的氢碳酸基团。在本发明的优选实施方式中，r是c4至c
22
烷基，例如c7至c
19
烷基。
[0066]
在更为优选的实施方式中，r是线性烷基，优选为线性c7至c
17
烷基，最优选的r是线性十五烷基或线性壬基。
[0067]
所述两亲聚合物可以由上面定义的结构块组成。
[0068]
在本发明的其他实施方式中，所述两亲聚合物包括超过50％，优选超过70％，更优选超过90％的上述定义的结构块。
[0069]
在一种优选实施方式中，所述两亲性聚合物选自聚(马来酸-1-十八烯)、聚(马来酸-1-十四烯)或聚(马来酸-1-十二烯)。优选地所述聚合物为聚(马来酸-1-十八烯)。所述聚合物的平均分子量数为6,000至1,000g/mol。
[0070]
在特定优选的实施方式中，所述两亲性聚合物选自聚(马来酸-alt-1-十八烯)、聚(马来酸-alt-1-十二烯)和聚(马来酸-alt-1-十四烯)。聚(马来酸-alt-1-十八烯)。所述聚合物的平均分子量数为5000至1000g/mol。
[0071]
制备本发明的两亲性聚合物的方法在下面详细描述。
[0072]
肽
[0073]
本发明的纳米颗粒进一步包括至少一个肽，其中包括至少一个t细胞表位。所述肽可能与胶束的外部结合或包覆在胶束内部(在不存在固体疏水核的本发明纳米颗粒的实施方式中)。因此，肽可以处于胶束的外部或胶束内部。
[0074]
所述肽可以共价链接到胶束或无共价结合的，优选为与胶束共价链接。
[0075]
在优选实施方式中，使用一种在本领域已知的共价耦合肽(例如碳二酰亚胺或琥珀酰亚胺耦合)的方法将肽共价链接到胶束。优选地，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(edc)化学方法将肽与胶束共价连接。
[0076]
在本发明的情况下，术语“肽(peptide)”不限制大小，尤其是肽可能包含全蛋白或8至2,000个氨基酸，优选是8至200个氨基酸，8至100个氨基酸，9至60个氨基酸或10至20个氨基酸。所述术语还包括不同肽的组合，它们可以彼此链接为融合多肽。
[0077]
在本发明的优选实施方式中，肽包括10至20，例如13至17个氨基酸。
[0078]
在一种特别优选的实施方式中，所述肽包含15个氨基酸。
[0079]
所述肽包括至少一个t细胞表位。鉴定t细胞表位和选择t细胞表位的方法在本领域中是众所周知的，例如描述于文献rammensee et al.,1999(immunogenetics 50 213
–
219)和sanchez-trincado et al.2017(j immunol res.2017:2680160.doi:10.1155/
2017/2680160.epub 2017 dec 28)。在本发明的情况下，t细胞表位是诱导调节t细胞的肽序列。至少需要一个表位能够由要施用纳米颗粒的受试者的细胞表现出来。优选地，所述肽包括几个表位，使其能够以多个主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex)类型表示。
[0080]
由于调节性t细胞主要是cd4 ，因此mhc ii类的表现为主要兴趣所在。受试者(例如人类受试者)的hla类型，可以轻松地作为选择表位的一部分进行测试。可以在特定的mhc分子上呈现的特定肽的表位是已知和/或常规选择的，例如，通过适当的软件选择。
[0081]
所述肽是根据已发表的数据设计的，以确保它们(与特定的hla限制元素结合)以高亲和力结合mhc/hla并显著刺激和激活t细胞。理想情况下，选择的肽是从天然形成的肽中推断出来的，并具有免疫显性。
[0082]
所述肽可以从天然来源进行合成、重组表达或分离或修饰。肽或者至少是调节性t细胞产生的抗原表位最好是从抑制炎症免疫反应的肽/蛋白质中提取的，例如，在治疗或预防自身免疫性疾病或过敏的情况下。所述肽可以是例如过敏原、已知的自身免疫抗原或其片段或衍生物。所述肽可以结合来自各种抗原的各种表位。
[0083]
在本发明的一种优选实施方式中，所述肽是衍生自桥粒芯核蛋白3(dsg3)的抗原肽。例如，所述肽可以是一种或多于一种以seq id nos:1-3为特征的桥粒芯核3肽。
[0084]
根据本发明的一种实施方式，所述纳米颗粒仅包含一种类型的肽，其含至少一个t细胞表位。
[0085]
根据另一种实施方式，本发明提供了一种包含不同纳米颗粒的组合物，其中每个纳米颗粒包含许多具有相同氨基酸序列的肽，但所述组合物包含肽序列彼此不同的纳米颗粒的混合物。所述组合物可以例如包含不同的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含2至6种不同的肽。一方面，不同纳米颗粒的组合物可以包含三种不同类型的纳米颗粒，每种的特征在于seq id nos:1-3之一。
[0086]
固体疏水核
[0087]
在本发明的一种实施方式中，所述纳米颗粒包含至少部分地被胶束包覆的固体疏水核。
[0088]
所述核可以是无机核，优选包含氧化铁、cdse、银或金。
[0089]
所述核的直径可以是2至500nm，优选3至25nm，更优选5至15nm。所述核的直径可以使用透射电子显微镜(tem)或小角x射线散射(saxs)来确定。
[0090]
示例性无机核是由油酸或另一种羧酸(c
14-c
22
，优选c
16-c
18
)稳定的氧化铁纳米颗粒、量子粒(cdse/cds/zns，通过例如三辛基膦氧化物稳定的)、金纳米颗粒，例如通过磺酸化合物稳定的。
[0091]
所述无机核本身通常在水性溶剂如水中不稳定，但将它们包埋在聚合物胶束中使其具有水溶性。两亲聚合物的疏水部分与纳米颗粒的疏水核相互作用，导致形成围绕核的单一聚合物涂层。在包覆过程中，两亲聚合物可以通过配体交换取代核的疏水部分，从而在核周围形成双层胶束。在本发明的一种实施方式中，聚合物至少部分取代核颗粒表面上的油酸并且聚合物的亲水部分与氧化铁核的表面相互作用并且聚合物的疏水部分彼此相互作用在氧化铁核周围形成双层胶束，从而产生涂覆有聚合物的氧化铁。
[0092]
根据本发明的一种优选实施方式，所述核是超顺磁性的。
[0093]
在本发明的一个特别优选的实施方式中，所述核是超顺磁性氧化铁纳米颗粒(spion)，其可以通过油酸来稳定。
[0094]
所述核优选地使的本发明的纳米颗粒可追踪，例如，通过它们在荧光、电子显微镜或其他检测方法中的特性。
[0095]
纳米颗粒
[0096]
发明人已发现用于本发明的纳米颗粒适合于将肽在体内转移至受试者的肝窦内皮细胞。
[0097]
所述纳米颗粒可另外包含结构部分，例如靶向它们或增强对特定细胞如肝窦内皮细胞和/或枯否细胞的靶向的碳水化合物或蛋白质。这样的部分可以，例如，通过受体介导的内吞作用增强或加速从循环中的摄取。合适的修饰的例子是诸如甘露糖的碳水化合物。
[0098]
由于形成胶束的聚合物，纳米颗粒可以带负电或不带电；优选地，纳米颗粒在6至7的ph下带负电。聚合物涂覆可包含诸如羧酸的酸基团，导致纳米颗粒带负电荷。
[0099]
本发明的纳米颗粒可具有在ph 6至7(测量期间的ph)下的-20至-50mv、优选-25至-45mv、更优选-28至-42mv的zeta电位。所述zeta电位可以使用malvern zetasizer nano zs仪器测量。
[0100]
本发明的纳米颗粒的流体动力学直径(z-均值)可为10至100nm或10至70nm，优选10至50nm，更优选20至40nm，最优选22至32nm，通过动态光散射(dls)测量。
[0101]
本发明的纳米颗粒的多分散指数可低于0.50，优选0.05至0.45，更优选0.10至0.40，通过动态光散射(dls)测量。
[0102]
流体动力学直径和多分散性指数的测定使用电泳光散射分析方法进行，优选使用malvern zetasizer。在一种实施方式中，测定流体动力学直径和多分散性指数的方法使用电泳光散射、一次性聚苯乙烯比色皿、zetasizer software 7.12、milli-q水。20nm和100nm的纳米球尺寸标准(nist认证或等效)在0.9％氯化钠水溶液中稀释，测试样品在水中稀释。所有水性试剂在使用前都经过0.22μm膜过滤。在本发明的最优选实施方式中，确定流体动力学直径和多分散指数的方法是利用电泳光散射结合以下分析条件进行的：
[0103]
分析条件概览：
[0104]
参数设置分散剂名称水分散剂ri1.33粘度(cp，25.0℃时)0.8872材料ri(样品)2.42材料ri(标准)1.333材料吸收0.05温度(℃)25测量位置(mm)4.65细胞描述一次性尺寸比色皿衰减器自动测量持续时间自动
[0105]
数据的评估是基于平均直径(z-average，强度nm)，这是在dls中也称为累积量平
均值和多分散指数(pdi)的参数，被用作尺寸分布的量度。
[0106]
此外，本发明的纳米颗粒可具有0.1至5mg/ml，优选0.5至4mg/ml，更优选1至3mg/ml的总聚合物含量。总聚合物含量由gpc测定。为了测量总聚合物含量，肽被水解，颗粒被破坏(例如使用6m hcl溶液)。在添加edta后萃取聚合物。蒸发溶剂后，将残余物重新溶解并通过gpc测定聚合物含量。
[0107]
总聚合物含量的测定优选使用以下试剂和参考标准水(hplc级)，乙腈(hplc级)、带bht的四氢呋喃(thf-hplc级)、100％乙酸(分析级)、盐酸37％(分析级)、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(分析级)、乙酸乙酯(分析级)、氢氧化钠(分析级)和聚(马来酸-alt-1-十八烯)作为参考物质。
[0108]
测定总聚合物含量的色谱条件为：
[0109]
色谱柱agilent pl-gel mixed-d,300 75mm id,5μm柱温40℃流速1.0ml/min检测器折射率检测器，于35℃采样率2.31hz或等效进样量20μl自动进样器温度环境运行时间15min流动相thf/乙酸[90/10]％(v/v)流动相程序等度
[0110]
在本发明的一种特别优选的实施方式中，纳米颗粒包含由数均分子量为6,000至1,000g/mol或更低的聚(马来酸-alt-1-十八烯)涂覆包封的氧化铁核和肽，其包含至少一种优选与胶束共价连接的t细胞表位。
[0111]
在一个方面，本发明因此提供了纳米颗粒，包含：
[0112]
a)胶束，包括两亲聚合物，其含有以下结构块
[0113][0114]
其中r为烃基或取代的烃基，优选地r为直链烷基，优选直链c
11
至c
17
烷基，并且其中聚合物的数均分子量(mn)为6,000至1,000g/mol，和
[0115]
b)至少一种肽，其包含至少一种t细胞表位；和
[0116]
c)至少部分地被所述胶束包覆的固体疏水核，其中所述核包含可追踪的无机材料,其选自氧化铁、cdse/cds/zns、银和金。
[0117]
所述聚合物的数均分子量优选为6,000至1,000g/mol。
[0118]
所述纳米颗粒优选具有50至10nm的流体动力学直径，如通过动态光散射测量的。
[0119]
药物组合物
[0120]
本发明进一步提供一种药物组合物，其包含本发明的纳米颗粒。
[0121]
所使用的肽在药物组合物中的浓度可为0.01至2mm、优选0.1至1mm、更优选0.45至
1mm。
[0122]
在一种优选实施方式中，组合物中游离(未结合)聚合物的量为聚合物总量的小于10％，优选小于5％，最优选小于2％。
[0123]
本发明的药物组合物可以进一步包含至少一种合适的辅料和/或稀释剂。稀释剂优选是水或水基的，例如缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(pbs)、林格溶液、tris缓冲液或氯化钠溶液。可以包含或不包含合适的防腐剂。
[0124]
显然，特别是对于人类受试者的给药，所述组合物优选是无菌的和生物相容的。
[0125]
在本发明的一种优选实施方式中，所述药物组合物包含分散在d-甘露醇、tris和/或l-乳酸中的本发明纳米颗粒。
[0126]
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物包括不含固体疏水核的本发明纳米颗粒，所述纳米颗粒分散在d-甘露醇、tris和/或l-乳酸中。使用这种缓冲液的优点是颗粒在这种缓冲液中非常稳定，后续可以冻干。
[0127]
此外，所述药物组合物可包含多于一种类型的本发明纳米颗粒，其中不同类型的纳米颗粒具有与胶束外部缔合的不同肽。通过使用纳米颗粒的混合物，多种自身抗原肽可以同时诱导更广泛的免疫耐受。这些肽可能来自单一的免疫原性蛋白质，或来自不同的蛋白质。
[0128]
在本发明的一种优选实施方式中，所述药物组合物包含2至6种不同类型的纳米颗粒，其中优选地，不同类型纳米颗粒的所有相关肽均包含至少一个t细胞表位。
[0129]
在本发明的一个特别优选的实施方式中，所述药物组合物包含3至4种不同类型的纳米颗粒，其中不同类型纳米颗粒的所有相关肽包含至少一个t细胞表位。特别地，每个纳米颗粒可以与衍生自dsg3的不同抗原肽结合。
[0130]
所述药物组合物包含纳米颗粒，其浓度可为低于100μm、优选0.5至80μm、更优选1至50μm。如果药物组合物中存在多于一种纳米颗粒，则每种纳米颗粒的浓度可为低于100μm、优选0.5至80μm、更优选1至50μm。
[0131]
本发明的药物组合物可以包含等摩尔浓度的不同类型的纳米颗粒。
[0132]
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，包含纳米颗粒，其包括：
[0133]
a)胶束，其包含两亲聚合物，所述聚合物包含以下结构块
[0134][0135]
其中r为烃基或取代的烃基，优选地r为直链烷基，优选直链c
11
至c
17
烷基，并且其中聚合物的数均分子量(mn)为6,000至1,000g/mol，和
[0136]
b)至少一种肽，其包含至少一种t细胞表位；和
[0137]
c)固体疏水核,至少部分地被所述胶束包覆，其中所述核包含可追踪的无机材料,其选自氧化铁、cdse/cds/zns、银和金。
[0138]
所述药物组合物中聚合物的数均分子量优选为6,000至1,000g/mol。
[0139]
本发明药物组合物中纳米颗粒的流体动力学直径优选为通过动态光散射测量的50-10nm。
[0140]
在一种优选方面，本发明提供一种药物组合物，含有至少三种不同类型的纳米颗粒，其各自包含：
[0141]
a)胶束，包含两亲聚合物，其包含以下结构块：
[0142][0143]
其中r为烃基或取代的烃基，优选地r为直链烷基，优选直链c
11
至c
17
烷基，并且其中聚合物的数均分子量(mn)为6,000至1,000g/mol，和
[0144]
b)一种肽，其包含一个t细胞表位；和
[0145]
c)固体疏水核，至少部分地被胶束包覆，其中所述核包含可追踪无机材料，其选自氧化铁、cdse/cds/zns、银和金；以及
[0146]
其中三种不同类型的纳米颗粒在肽序列上彼此不同，其中第一类纳米颗粒包括具有seq id no:1的肽，第二类纳米颗粒包括具有seq id no:2的肽和第三类纳米颗粒包含具有seq id no：3的肽。
[0147]
医疗用途
[0148]
本发明的药物组合物旨在用于并配制用来向患有其中抑制特定免疫应答是有益的疾病的受试者施用。
[0149]
所述药物组合物可以施用于有需要的受试者。
[0150]
对受试者给药所需的剂量和浓度，可由负责的医务人员根据病例的事实和情况确定。示例性剂量可包括0.03μmol至0.90μmol每患者体重，例如对于人类受试者。
[0151]
给药可以重复，例如两次、三次或四次，例如给药之间相隔1、2、3、4、5、6、7、10或14天。
[0152]
优选地，所述药物组合物用于抑制特定免疫应答，例如治疗或预防其中抑制特定免疫应答是有益的疾病。更优选地，所述药物组合物用于在受试者中产生对至少一种t细胞表位具有特异性的调节性t细胞，用于治疗或预防其中抑制特异性免疫应答是有益的疾病。
[0153]
所述疾病可以是与确定的自身抗原相关的自身免疫性疾病。在本发明的情况中，术语“自身免疫性疾病(autoimmune disease)”理解为定义于hayter et.al.(autoimmunity reviews 11(2012)754
–
765)。在一种优选的实施方式中，自身免疫性疾病选自：寻常型天疱疮、叶型天疱疮、大疱性表皮松解症、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、古德帕斯丘综合征、显微镜下多血管炎、肉芽肿性多血管炎(granulom.wegener)、血栓性血小板减少性紫癜、免疫性血小板减少性紫癜、葡萄膜炎、hla-b27相关急性前葡萄膜炎、多发性硬化症、视神经脊髓炎、i型糖尿病、伴有或不伴有猝倒的发作性睡病、乳糜泻、疱疹样皮炎、过敏性气道疾病/哮喘、重症肌无力、桥本甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性甲状旁腺功能减退症、自身免疫性甲状腺疾病、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、慢性炎症性脱髓鞘、多发性神经病、格林-巴利综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、线性硬斑病、巴顿病、获得性血友病a、复发性多软骨炎、艾萨克综合征(获得性神经肌强直)、拉斯穆森脑炎、莫凡综合征、僵人综合征、恶性贫血、伏格特-小柳-原田综合征、原发性胆汁性肝硬化、i型自身免疫性肝
炎、ii型自身免疫性肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性肌炎/皮肌炎、干燥综合征、硬皮病、白癜风和斑秃。
[0154]
更优选地，所述自身免疫性疾病选自寻常天疱疮、古德帕斯丘综合征、显微镜下多血管炎、血栓性血小板减少性紫癜、多发性硬化、视神经脊髓炎、i型糖尿病、伴有或不伴有猝倒的发作性睡病、乳糜泻、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血和获得性血友病a。
[0155]
根据本发明，术语“治疗(treating)”用于指减轻受试者中特定疾病的症状和/或改善与特定病症相关的可确定测量。
[0156]
制备两亲聚合物和纳米颗粒的方法
[0157]
制备两亲聚合物和包含其的纳米颗粒的方法描述于实施例1-4。
[0158]
获得数均分子量(mn)为20,000g/mol或更小的两亲聚合物的一种方法在于使用两步法合成所述两亲聚合物，包括制备酸酐的聚合物的步骤和水解酸酐而得到酸的步骤。将聚合物的酸酐形式水解得到酸性形式的步骤可以说明如下：
[0159][0160]
本发明还提供了一种制备纳米颗粒的方法，包括：
[0161]
i)获得数均分子量(mn)为20,000g/mol或以下的两亲聚合物，
[0162]
ii)任选地纯化所述两亲聚合物，
[0163]
iii)形成所述两亲聚合物的胶束，以及
[0164]
iv)添加至少一种肽以形成所述纳米颗粒。
[0165]
在本发明的一种实施方式中，所述肽被胶束包裹，步骤iv)在步骤iii)之前进行。在这些实施方式中，在胶束形成之前将肽添加到两亲聚合物中。
[0166]
本发明的纳米颗粒中使用的两亲聚合物可以通过使用自由基引发剂的自由基共聚来制备(步骤i)。
[0167]
聚合物的分子量可以通过改变反应物的浓度或自由基引发剂的量来控制。聚合物的分子量可以通过凝胶渗透色谱法来分析。
[0168]
共聚过程可以在1，4-二恶烷、二甲苯或氯苯等有机溶剂中进行。
[0169]
许多自由基引发剂是本领域已知的；它们包括各种过氧化物和偶氮类化合物。合适的过氧化物的实例为过氧化苯甲酰、过氧化月桂基、过氧化二叔丁基、过氧化2,4-二氯苄基、氢过氧化叔丁基、氢过氧化枯烯、过氧化二乙酰、过氧碳酸二乙酯、过苯甲酸叔丁酯和过硼酸盐。合适的偶氮类化合物包括2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)、对溴苯重氮氟硼酸盐、对甲苯基重氮氨基苯、对溴苯重氮氢氧化物、偶氮甲烷和苯基重氮卤化物。优选地，所述自由基引发剂是2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)。
[0170]
所述共聚可以在升高的温度如70至120℃，优选90至110℃下进行。
[0171]
优选地，所述共聚的引发是通过将混合物加热至70至120℃，优选90至110℃。
[0172]
在本发明方法的一种优选实施方式中，步骤i)包括混合反应物、使混合物脱氧、加热混合物然后冷却混合物的步骤。之后，可以将聚合物溶解并搅拌过夜。形成的固体可被重
新获得，优选地通过离心的方式。
[0173]
在本发明方法的一种优选实施方式中，步骤ii)包括向聚合物中添加碱(例如naoh)。优选地，碱与聚合物在升高的温度下反应，优选在50℃和70℃之间，例如60℃，直到几乎所有固体溶解。可以酸化所得悬浮液(例如ph《2)。之后，反应混合物可以用有机溶剂如乙酸乙酯萃取。有机层可以用氢氧化钠溶液萃取。水溶液可以再次用有机溶剂如乙酸乙酯萃取，然后干燥以获得纯化的两亲聚合物。
[0174]
所述聚合物可被进一步纯化(步骤iii)。优选地，所述聚合物通过用正己烷或正庚烷萃取聚合物来进一步纯化。萃取可以在大于10g/l，优选100g/l的浓度下进行。
[0175]
此外，可以在步骤i)和ii)之间添加额外的两亲聚合物纯化步骤。在这个额外的纯化步骤中，聚合的粗反应产物被溶解和沉淀。在一种优选的实施方式中，溶剂是二氯甲烷并且使用甲醇/庚烷或乙腈/异丙醇的混合物沉淀聚合物。使用的混合物可以包含例如95/5％(v/v％)甲醇/庚烷、10/90(v/v％)乙腈/异丙醇或5/95(v/v％)乙腈/异丙醇。在一种优选的实施方式中，沉淀混合物在-10至10℃，优选-5至5℃的温度下添加。
[0176]
所述两亲聚合物的纯度在水解和后处理过程之后可以通过1h nmr测量。
[0177]
在本发明的方法中，所述胶束是通过形成含有两亲聚合物的溶液而形成的。优选地，所述胶束在水溶液中形成。可将助稳定剂添加到两亲聚合物中以改善胶束形成。
[0178]
在步骤iv)中使用的肽可以使用现有技术的固相化学合成。
[0179]
所述肽可以与胶束共价链接或非共价结合。
[0180]
在本发明方法的一种优选实施方式中，使用本领域已知的肽耦联技术，例如碳二亚胺或琥珀酰亚胺耦联，将肽耦联至纳米颗粒的表面。
[0181]
在本发明方法的一个特别优选的实施方式中，所述肽通过edc化学(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)在水相中与纳米颗粒的表面接合。
[0182]
所得到的纳米颗粒可以使用强烈的洗涤和过滤步骤来纯化以除去耦联剂和任何低分子量组分。
[0183]
在一种优选的实施方式中，制备纳米颗粒的方法包括：
[0184]
a)获得疏水核纳米颗粒，
[0185]
b)获得数均分子量(mn)为20,000g/mol或更低的两亲聚合物，其中优选地使用自由基共聚，
[0186]
c)任选地纯化所述两亲聚合物，
[0187]
d)混合所述疏水核纳米颗粒和两亲聚合物以形成胶束，
[0188]
e)添加至少一种肽以形成所述纳米颗粒。
[0189]
以上步骤i)至iii)和iv)的讨论也分别适用于步骤b)至d)和e)。
[0190]
步骤a)的疏水核可以通过在溶液中使用合适的反应物合成。在本发明方法的一种优选实施方式中，所述疏水核可以在有机溶剂的存在下使用金属盐和羧酸盐作为反应物来合成。优选地，所述反应在氧限制下在升高的温度下进行。
[0191]
所述胶束可以通过在步骤e)中将两亲共聚物排列在核周围来形成。优选地，步骤d)包括以下子步骤：溶解两亲聚合物和核颗粒，除去溶剂直至形成薄膜，在升高的温度和环境压力下添加碱性水溶液以形成水性胶体分散体，稀释所述溶液并选择性地过滤它。之后，可以实施几个洗涤步骤。
[0192]
实施例
[0193]
本发明通过以下实施例进行说明，这些实施例详细描述了根据本发明的纳米颗粒的合成。
[0194]
这些实施例不应被视为对本发明的范围进行限制，而是进行说明。
[0195]
实施例1：超顺磁性氧化铁晶核(spion)的制备
[0196]
油酸铁络合物的合成示意地如图1所示。
[0197]
在第一步中，通过在70℃回流下混合油酸、氢氧化钠和氯化铁来合成油酸铁络合物。产物在分液漏斗中通过几个洗涤步骤进行纯化，然后用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器中浓缩。这就形成了氧化铁晶体核(图1)。
[0198]
在第二步(图2)中，油酸铁络合物在室温下溶解在1-十八烯中并搅拌直至完全溶解。然后，加入油酸，脱氧并在300℃加热3小时以形成氧化铁纳米晶体。
[0199]
冷却后，通过使用磁分离和丙酮/四氢呋喃(thf)的几个洗涤步骤纯化产物。纯化的spions在氯仿中稀释并在旋转蒸发仪中浓缩，得到具有窄尺寸分布和良好结晶度的spion。
[0200]
实施例2：低分子量聚(马来酸-alt-1-十八烯)(lm-pmacod)的制备
[0201]
低分子量聚(马来酸-alt-1-十八烯)(lm-pmacod)的合成是通过两步过程实现的，如图3和4所示。
[0202]
在第一步中，马来酸酐(48.9mmol)和1-十八烯(48.2mmol)被溶解在10ml的1,4-二恶烷中(1,4-二恶烷的抑制剂预先通过在3g氧化铝上过滤而除去)。之后，加入5.79mmol aibn(2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈))。烧瓶配备冷却器，随后用氮气冲洗并保持氮气超压。在搅拌的同时将混合物加热至100℃。加热开始1小时后，将加热板连同塞子一起取下；将反应暴露在空气中。在搅拌的同时将混合物冷却至室温两天。通过与二氯甲烷共蒸发纯化产物并用异丙醇和乙腈沉淀。获得数均分子量(mn)为2,500至4,000g/mol的低分子量聚(马来酸酐-alt-1-十八烯)(lm-pmaod)。
[0203]
在第二步中，lm-pmaod在氢氧化钠溶液中水解为聚(马来酸-alt-1-十八烯)(lm-pmacod)。
[0204]
使用h2so4、乙酸乙酯和naoh进行酸碱萃取以纯化产物并去除杂质，例如残留的1-十八烯。产物用硫酸镁干燥，与氯仿共蒸发，最后在正庚烷中通过固液萃取进行纯化(图4)。
[0205]
所得聚合物的数均摩尔质量(mn)和质均摩尔质量(mw)通过采用凝胶渗透色谱法测定。
[0206]
将1.5mg的lm-pmacod样品溶解于1.0ml的thf(不含稳定剂)并提交给gpc。聚苯乙烯用作校准标准。使用四氢呋喃作为洗脱液，流速为1ml/min。温度设置为30℃。
[0207]
生成的lm-pmacod的数均摩尔质量(mn)为1540g/mol，质均摩尔质量(mw)为2410g/mol。因此，计算出样品的pdi值为1.56，这是通过非受控自由基聚合生产的聚合物的特征(见图8)。
[0208]
实施例3：spions的聚合物涂覆
[0209]
spions的聚合物涂覆示意性地显示于图5。
[0210]
实施例3a：将实施例2中获得的100mg m-pmacod溶于在100ml圆形底瓶中的4ml氯仿中。将混合物加热，直到聚合物完全溶解。在实施例1中获得的3.3ml oleate-spion溶液
被添加到混合物中，然后通过280rpm旋蒸器在40℃以《10mbar蒸发15分钟。然后，将10ml的5mm naoh添加到混合物，并在旋蒸器于50℃搅拌15分钟，直到将所有黑色固体溶解为止。使用70ml的25mm naoh稀释溶液以溶解整个聚合物。将所获得的溶液在旋蒸器搅拌15分钟，从而产生棕色溶液。
[0211]
所述产物在0.45μm和0.2μm pes过滤器上过滤。之后，探针通过切向流过滤(tff)纯化。
[0212]
实施例3b：市售的30-50kda聚合物(#419117merck)，按照实施例2在水解后进行相同的过程。由于从聚合物包覆的spions中由tff不足以去除未结合聚合物，从而使用miltenyi柱进行额外的磁力分离，以纯化pmacod-spion批次mx0194。
[0213]
实施例4：肽以及肽的耦联
[0214]
肽耦联和纳米颗粒合成示意性地显示于图6。
[0215]
肽的合成是利用固相肽合成(spps)通过fmoc化学作用从c到n方向完成的。每种氨基酸的α氨基基团被氟-9-甲氧基羰基(fmoc)保护，而侧链官能团也被各种适当的保护基团封护。
[0216]
通常，spps由重复循环的n端的脱保护和之后的耦联反应构成。将第一个fmoc保护的氨基酸耦联到树脂。然后，将胺基利用二甲基甲酰胺(dmf)中哌啶的混合物进行脱保护，接着与第二个fmoc保护的氨基酸的游离酸结合。该循环重复进行直到获得所需的序列。树脂在每个步骤之间被清洗。对每个耦联反应的完成通过定性的宁海准试验进行监测。在合成的最后一步中，将粗制的肽-树脂用dmf和甲醇依次洗涤并干燥。然后，将保护基从肽中去除，并使用三氟乙酸(tfa)将肽从树脂上分离下来。从分离的混合物中通过醚沉淀分离获得粗制的肽。
[0217]
此外，通过制备型hplc对肽进行纯化以达到纯度要求，并使用适当的溶剂缓冲系统将反荷离子tfa用氯化物代替。最后，将纯化的肽冻干。
[0218]
所使用的肽在n端有一个氨基酸，在c端有一个游离酸(hcl盐)，并且长度为15个氨基酸。游离肽(起始材料)的鉴定是通过lc-ms进行的。
[0219]
本技术的实施例中使用的肽序列和计算的单同位素质量如表1所示。
[0220]
表1：肽序列和单同位素质量
[0221]
序列号序列分子式单同位素质量(理论)(da)1lnskiafkivsqepac
75h125n19o22
1643.92tpmfllsrntgevrtc
74h124n22o23
s1720.93regiafrpasktftvc
76h122n22o21
1678.9
[0222]
所述肽的分子量通过多模电喷雾大气压化学电离质谱法测量。
[0223]
所述肽被接合到实施例3a中获得的胶束表面，其中采用了在硼酸/四钠二钠脱氢(sbb)缓冲液中1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)的化学方式。
[0224]
sbb缓冲液中的edc加入到实施例3中获得的胶束中。在rt的15分钟后，肽加入并搅拌在rt的2小时15分钟。
[0225]
所得纳米颗粒溶液通过切向流过滤(tff)纯化过程被过滤和纯化。
[0226]
实施例5：纳米颗粒的鉴定
[0227]
实施例4中获得的纳米颗粒通过使用各种分析方法进行了进一步的鉴定。
[0228]
氧化铁核的鉴定是使用tem和saxs进行的。对分散于5％(w/v)d-甘露醇，5mm tris和6mm l乳酸的纳米颗粒进行tem检测。
[0229]
表2总结了基于实施例4中产生的纳米颗粒的tem分析所计算的颗粒尺寸结果。代表性tem图像示于图7。
[0230]
表2：基于tem分析的平均氧化铁核尺寸结果
[0231][0232]
saxs测量分散于5％(w/v)d-甘露醇，5mm tris和6mm l乳酸的纳米颗粒。
[0233]
基于实施例4中形成的纳米颗粒的saxs分析的计算尺寸结果归总于表3。
[0234]
表3：基于saxs分析的平均氧化铁核尺寸结果
[0235][0236]
尺寸和分布的鉴定是通过动态光散射(dls)进行的。使用malvern zetasizer nno zs或等同仪器在单峰模式下确定流体动力直径(z平均)和多分散性指数。
[0237]
这些测量值是在实施例4中产生的、分散在5％(w/v)d-甘露醇，5mm tris和6mm l二乳酸中的纳米颗粒上进行的。
[0238]
结果归总于表4。从这些结果中，可以观察到该制剂可以稳定颗粒并可以减少大颗粒的百分比。
[0239]
表4：基于dls分析的尺寸分布结果
[0240][0241]
颗粒的表面电荷的分析是通过使用malvern zetasizer nano zs分析仪测量ph 6至7(测量过程中的ph)时zeta电位来进行的。这些测量值是在实施例4中产生的、分散在5％(w/v)d-甘露醇，5mm tris和6mm l二乳酸中的纳米颗粒上进行的。
[0242]
结果归总于表4。
[0243]
表4：zeta点位结果
[0244][0245]
总聚合物含量通过使用gpc确定。肽被水解，并在6m hcl中被破坏。加入edta后，用乙酸乙酯提取pmacod。溶剂蒸发后，在分析前剩余物重新溶解在thf/乙酸混合物中。
[0246]
结果归总于表5。
[0247]
表5：总聚合物含量
[0248][0249]
纳米颗粒的光谱特性是通过傅立叶转换红外光谱(ftir)确定的。
[0250]
主吸收带的指定归总于表6。
[0251]
表6：纳米颗粒的ir振动模式的建议描述
[0252][0253]
实施例6：两亲聚合物的不同尺寸的影响
[0254]
研究了本发明纳米颗粒中两亲性聚合物的不同尺寸的影响。spion涂有pmacod聚合物，其平均分子量为3100、4800和5900g/mol。
[0255]
这些聚合物被合成、纯化和鉴定之后，被用于oleate-spions(油酸酯-spions)的涂覆反应。涂覆后，多余的聚合物通过tff纯化过程去除。
[0256]
a)具有不同分子量的聚(马来酸-alt-1-十八烯)(pmacod)的合成
[0257]
三种不同长度的聚(马来酸-alt-1-十八烯)是经由马来酸酐和1-十八烯的自由基聚合而合成。该反应是使用2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)作为引发剂在1,4-二恶烷中进行。通过将混合物加热到100℃来开始聚合。其次，纯化后，使用氢氧化钠溶液将聚合物水解以获得pmacod。
[0258]
通过在更大浓度的条件和/或较低引发剂量的情况下进行聚合，可以合成具有较高分子量的聚合物。
[0259]
三种聚合物的合成中使用的反应物的量归结于表7。
[0260]
表7：反应物的量
[0261][0262]
马来酸酐的水解和后处理之后的聚合物的纯度通过1h-nmr(400hz，30mg样品，10mg苯甲酸标准，700μl d-氯仿)进行了测量，并且聚合物的长度通过凝胶透光层(agilent pl-gel mixed-d,300x7.5mm id,5μm,2mg/ml in thf/乙酸(90/10),15min运行)进行了分析。
[0263]
b)两亲性聚合物的不同长度的效果
[0264]
具有不同长度的pmacod用于涂上oleate-spions。
[0265]
首先，使用相同的聚合物与spion重量比进行涂覆。为了找到最佳的涂覆条件，聚合物与spion摩尔比保持恒定。比较了聚集体的量。重复最少聚集体的方法并随后使用tff进行纯化。使用尺寸排除色谱法(sec)在tff期间监测聚集物的去除和聚集体的量。
[0266]
将oleate-spions用pmacod3100，pmacod4800和pmacod5900涂覆，以确定最佳聚合物/spion比率。
[0267]
为了涂覆oleate-spions，将聚合物和纳米颗粒溶解在氯仿中。随后，将氯仿蒸发。在涂覆过程的最后一步中，将氢氧化钠水溶液添加到烧瓶中并在50℃下混合。对于pmacod3100，使用100mg聚合物。对于pmacod4800，比较了具有100mg聚合物和145mg聚合物的涂层。对于pmacod5900，比较了具有100mg聚合物和177mg聚合物的涂层。这样，相对于pmacod3100，将等量的单体与等量的聚合物链进行了比较。
[0268]
通过使用尺寸排除色谱法，确定哪种条件导致聚集量最少。
[0269]
结果汇总于表8。
[0270]
表8：由不同聚合物的spions涂覆形成的聚集体的概要
[0271][0272]
c)纯化后不同聚合物长度的影响
[0273]
oleate-spions用与以前使用的相同流程涂覆。对于所有聚合物，均使用相同量的聚合物链。涂覆后，通过tff纯化pmacod-spion。由于难以除去最终量的聚合物pmacod5900，因此决定还尝试使用0.15g聚合物(与pmacod3100的标准实验相比，相当于0.79等量)。
[0274]
使用sec确定样品中剩下多少聚集体以及多少聚合物。涂覆后，pmacod3100包含5.9％的聚集体，pmacod4800包含6.2％的聚集体，pmacod5900包含10.7％的聚集体。这与上一节中描述的数据匹配。
[0275]
接下来，通过tff纯化pmacod-spions。将颗粒加载到膜上，然后用5mm naoh/45mm nacl冲洗。每10个dvs(对于pmacod3100)或20个dvs(对于pmaco4800和pmacod5900)(dv＝tff纯化中的渗滤量)，由sec(之后)提取样并测量。在tff纯化过程中，还提取了过程中样品，以追踪聚合物的减少和聚集体的增加。
[0276]
结果归总于表9。
[0277]
表9：tff实验概要
[0278][0279]
将第1、2和4次的tff产物在0.2μm过滤器上过滤。第1次的也在0.1μm过滤器上过滤，以减少聚集体的量。
[0280]
样品过滤之前和之后，进行了动态光散射(dls)测量，以确定z平均直径和多分散指数(pdi)。所有批次pmacod涂覆的spion均显示z平均直径为26至28nm，pdi为0.25至0.33(见表11)。
[0281]
使用原子吸收光谱(aas)确定铁的量为38至50mg，这对应于铁回收83至110％。
[0282]
结果归总于表10。
[0283]
表10：dls数据；过滤之前和之后。
[0284][0285]
实施例7：pmacod-spion与具有不同分子量的聚合物的纯化的比较
[0286]
如实施例1-4中所述，制备了涂有商业高分子量pmacod(mn为30,000至50,000g/mol)和低分子量pmacod(mn为3,000至5,000g/mol)的spion。之后，使用切向流过滤(tff)纯化来去除未结合的物料。tff是纯化涂覆的spion的优选方法，因为易于调整规模。对渗余物和渗透样品进行尺寸排除色谱(sec)分析以监测tff纯化过程。对使用涂有高分子量和低分子量聚合物的spion的纯化效率进行了比较。
[0287]
a)高分子量pmacod-spions的纯化
[0288]
在第一步中，在采用tff纯化之前，使用sec分析了粗hm-pmacod-spions的样品(粗样品，见图9)。粗hm-pmacod-spions的批次显示了主hm-pmacod-spion峰(rt：15.541)左侧很小的肩，表明该批次含有少量的大团聚集体，其中在分散体中有21.2％(a/a)游离的未结合的聚合物(rt：16.698)。
[0289]
随后，高分子量pmacod-spion样品通过tff使用300kda tff膜过滤，以便将聚合物涂覆之后的hm-pmacod-spion与未结合的聚合物分子分开。如图9和10所示，并未实现分离，而是过滤后渗透液中均包含hm-pmacod-spion和hm-pmacod聚合物。
[0290]
因此，测试了几个选项，以查看是否可以减少这种情况。但是，没有一个成功。hm-pmacod-spions的保留太低而不能在不损失过多的产物的情况下获得spion和聚合物之间的良好分离。降低孔尺寸100kda的膜允许聚合物涂覆的spion的保留，而同时得到聚合物的保留和浓度(如图11所示)。
[0291]
总之，已经发现，用300kda tff膜的过滤和用100kda tff膜过滤均不会使hm-pmacod-spion从未结合的hm-pmacod物料中纯化出来。
[0292]
b)低分子量pmacod涂覆的spions的纯化
[0293]
在第二种方法中，低分子量pmacod涂覆的spion通过tff(100kda滤膜)进行了纯化。同样，对保留样品和渗透样品进行了尺寸排除色谱分析以检测tff纯化过程。两批(批次mx0373a和mx0374a)的结果如图12所示。
[0294]
使用lm-pmacod(mn为3,000至5,000g/mol)显示未结合聚合物在100kda tff膜上有效扩散，并从lm-pmacod-spion中除去了超过90％的未结合聚合物。
[0295]
涂覆后产物(mx0373a和mx0374a)，tff(100kda膜)纯化(mx0373e和mx0374e)以及最终0.1μm过滤(mx0373f和mx0374f)的sec色谱图显示于图13。
[0296]
此外，tff纯化之后样品的sec数据(100kda滤膜；批次mx0373e和mx0374e)以及tff纯化接着0.1μm过滤之后的样品sec数据(批次mx0373f和mx0374f)显示于下面的表12。
[0297]
表12：
[0298]
产物％spions(a/a)％聚集体(a/a)％去除的未结合聚合物mx0373e89.011.080.4mx0373f89.510.5 mx0374e88.711.378.9mx0374f89.210.8 [0299]
从提供的数据可以看出，可以通过tff有效地纯化lm-pmacod-spions，然而hm-pmacod-spions的纯化效率低，并且不能得到纯产物。
[0300]
实施例8：小鼠静脉注射含氧化铁核的低分子量聚合物胶束与含氧化铁核的高分子量聚合物胶束相比的体内安全性
[0301]
a)在实施例3b中产生的批次mx0194以1mmol fe/kg bw和2mmol fe/kg bw的剂量静脉注射在雌性cd1小鼠中。一只小鼠以2mmol fe/kg死亡，定义为与测试项目有关。注射后14天小鼠安乐死。与匹配的对照相比，绝对器官的重量显著增加(见表13)，这被定义为测试项目注射的不利作用。
[0302]
b)根据实施例3a产生的pmacod-spion批次在雌性cd1小鼠中注射3次，剂量为1mmol fe/kg bw(总共3mmol fe/kg bw)，注射1和2和注射2和3之间14天。在最后的注射之后24小时内对动物安乐死。仅发现肝脏重量略有但非显著增加，肺部重量没有增加(见表13)。
[0303]
基于高分子量聚合物的纳米颗粒对器官重量的影响与高分子量聚合物的长期不利影响有关，由于在实施例8a和8b中产生的批次中铁核是相似的。
[0304]
比较研究的结果归总于表13。
[0305]
表13：
[0306][0307]
因此表明低分子量聚合物的毒性低于高分子量聚合物。