用于治疗病毒感染的组合物和方法1.发明的
技术领域：
：2.本发明总体上涉及治疗病毒感染的领域。3.联邦政府资助的研究的声明4.不适用。5.以光盘提交的材料通过引用并入6.本技术包括已经经由efs-web以ascii格式提交的序列表，并且特此通过引用以其整体并入。所述ascii副本创建于2021年2月2日，命名为aebi1002.txt，并且大小为140265字节。7.发明的背景8.在不限制本发明的范围的情况下，就病毒感染描述其背景。9.目前，治疗呼吸道病毒，包括流感和冠状病毒的有效方法很少，甚至没有。众所周知的sars-cov、mers-cov和sars-cov2的估计死亡率范围在2％至35％之间。唯一的预防方法是隔离和控制。病毒可以在上皮细胞内快速复制，感染呼吸道中更多的细胞，通过免疫破坏和细胞因子释放综合征导致局部甚至全身损伤。抑制病毒复制是降低疾病严重性的方法，并且已知i型干扰素(ifn)可以通过减少病毒复制来预防症状的发生或降低症状的严重性。然而，重组ifn缺乏针对病毒进入点或呼吸道感染部位的靶向性，半衰期短，引起脱靶副作用，并且受制于快速降解。10.重组ifn作为急性抗病毒疗法已经引发了极大兴趣。许多研究引述了ifn缺乏在covid大流行期间对严重性结果的影响。然而，至今由于担心在高剂量下使流感样症状和细胞因子风暴恶化以及在低剂量下治疗和预防的不确定疗效，因此还没有批准将ifn用于呼吸道疾病。此外，使用ifn作为疗法的历史问题源于全身性和神经性副作用，其导致患有丙型肝炎感染的患者减少剂量至无疗效点或完全终止治疗。例如，sleijfer，etal.sideeffectsofinterferon-αtherapy，pharmworldsci(2005)总结了ifn疗法在试图治疗具有丙型肝炎病毒(hcv)的患者时的显著毒副作用，包括：贫血、癫痫、神经病、心肌病、视网膜异常、肺炎，以及很多种肝脏、结缔组织、皮肤病学、血液学、肺部、代谢和神经病学障碍。这导致wu和metcalf最近出版了题为“theroleoftypeiifnsininfluenza：antiviralsuperheroesorimmunopathogenicvillains？”jinnateimmun2020；12：437-447。bennett，etal.，low-doseoralinterferonalphaasprophylaxisagainstviralrespiratoryillness：adouble-blind，parallelcontrolledtrialduringaninfluenzapandemicyear，influenza，volume7，issue5，specialissue：part2pandemich1n1papers，september2013，pages854-862发现不能开发使用ifn抗流感病毒的治疗，其令人失望地发现，“低剂量口服ifnα预防法未降低急性呼吸道疾病(ari)的发生率或影响、或疾病对日常活动的影响”。11.为了降低ifn的毒性，开发了针对hcv的掩蔽的ifn前药，如授予stagliano等人的第10,523,549号美国专利中所教导的。该专利教导了使用掩蔽肽来阻断ifn活性的ifn融合蛋白的用途。掩蔽肽是以合成方法生成的序列长度为8-15个氨基酸的肽，其被hcv蛋白酶hcv-ns3/4切割，hcv-ns3/4是丙型肝炎病毒在细胞内产生的非结构蛋白。该hcv-pro-ifn必须在hcv蛋白酶切割掩蔽肽以激活ifn活性之前进入细胞，并且使用方法限于丙型肝炎感染。12.需要的是可以安全地治疗患有病毒诱导的感染、特别是呼吸障碍的患者或预防其恶化的新药剂。13.发明的概述14.在一个实施方案中，本发明包括治疗患有病毒感染、病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的患者的方法，所述方法包括：向有其需要的患者给予治疗有效量的药剂，其中药剂包含以下中的至少一种：包含(a)抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体-ifn-fc(avab/aeab-ifn-fc)的融合蛋白，其中avab/aeab是抗pd-l1、抗vegf或抗egfr抗体可变结构域；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)前述融合蛋白的fc-二聚化组合，或(e)在靶支气管上皮细胞中表达(a)-(d)中所述的融合蛋白的多核苷酸；并且其中给予导致病毒复制的抑制，导致患者的病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的减少；并且其中给予导致病毒复制的抑制，导致患者的病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的减少。一方面，病毒诱导的恶化是由选自以下的病毒的感染引起的：正粘病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、弹状病毒科、冠状病毒科或黄病毒科。另一方面，病毒是季节性流感。另一方面，病毒是sars、sars-cov、mers-cov、2019-ncov病毒或随后几年的ncov毒株。另一方面，pro-ifn由病毒感染期间上调或分泌的蛋白酶活化。另一方面，蛋白酶选自膜锚定的mmp，包括mmp14(mt1-mmp)、mmp15(mt2-mmp)、mmp16(mt3-mmp)、mmp17(mt4-mmp)、mmp24(mt5-mmp)、mmp25(mt5-mmp或白溶素)，或基质溶素(matrilysin)mmp-7和mmp-26，或溶基质素(stromelysin)mmp3、mmp10、mmp11、mmp19，或明胶酶mmp2、mmp9，或胶原酶mmp1、mmp8、mmp13、mmp18，或半胱天冬酶1至9中的任一种。另一方面，药剂经配制用于通过鼻咽气道、口咽气道或静脉内递送给予。另一方面，采用气溶胶雾化器向肺气道给予药剂。另一方面，药剂与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。另一方面，向鼻咽气道给予药剂。另一方面，向下呼吸道给予药剂。另一方面，药剂与另外的治疗剂同时、分开或依次组合给予。另一方面，另外的治疗剂是吸入的皮质类固醇。另一方面，药剂包含在靶支气管上皮细胞中表达的多核苷酸载体，所述多核苷酸表达抗表皮生长因子受体-干扰素(抗egfr-ifn)融合抗体、抗pd-l1-ifn融合抗体或pro-ifn多肽。另一方面，ifn选自以下中的至少一种：ifn-α1、ifn-α2、ifn-α3、ifn-α4、ifn-α5、ifn-α6、ifn-α7、ifn-α8、ifn-α10、ifn-α13、ifn-α14、ifn-α16、ifn-α17、ifn-α21、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ω。另一方面，pro-ifn是pro-ifn-α、pro-ifn-γ或pro-ifn-λ。另一方面，pro-ifn-α或pro-ifn-γ进一步包含ifnar1或ifnar2的胞外结构域。另一方面，pro-ifn-γ进一步包含ifnlr1的胞外结构域。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的异二聚体：抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9或pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的同型二聚体：pro-ifn-fc、抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗vegf(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-pro-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗pd-l1(scfv)-ifn-fc或pro-抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc，ifn或pro-ifn融合构建体可以融合至fc的n-末端或c-末端-另一方面，pro-ifn进一步包含结合ifn并降低ifn的活性，并且与ifn-fc分离的肽、ifn的受体或ifn受体的一部分。另一方面，pro-ifn进一步包含fc区。另一方面，pro-ifn在支气管中由被病毒感染的细胞分泌的蛋白酶活化。15.在另一个实施方案中，本发明包括在病毒感染、病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化之前向个体给予的方法，所述方法包括：向个体给予预防有效量的药剂，其中药剂包括以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)前述融合蛋白的任何fc-二聚化组合，或(e)在靶支气管上皮细胞中表达(a)-(d)中所述的融合蛋白的多核苷酸；并且其中给予导致病毒复制的抑制，导致患者的病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的减少。另一方面，病毒诱导的恶化是由选自以下的病毒的感染引起的：正粘病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、弹状病毒科、冠状病毒科或黄病毒科。另一方面，病毒是sars、sars-cov、mers-cov或2019-ncov病毒。另一方面，pro-ifn由病毒感染期间上调或分泌的蛋白酶活化。在另一方面，蛋白酶选自膜锚定的mmp，mmp14(mt1-mmp)、mmp15(mt2-mmp)、mmp16(mt3-mmp)、mmp17(mt4-mmp)、mmp24(mt5-mmp)、mmp25(mt5-mmp或白溶素)，或基质溶素(matrilysin)mmp-7和mmp-26，或溶基质素(stromelysin)mmp3、mmp10、mmp11、mmp19，或明胶酶mmp2、mmp9，或胶原酶mmp1、mmp8、mmp13、mmp18，或半胱天冬酶1至9中的任一种。另一方面，药剂经配制用于通过气道或静脉内递送给予。另一方面，采用气溶胶雾化器向肺气道给予药剂。另一方面，药剂与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。另一方面，向下呼吸道给予药剂。另一方面，药剂与另外的治疗剂同时、分开或依次组合给予。另一方面，另外的治疗剂是吸入的皮质类固醇。另一方面，药剂包含在靶支气管上皮细胞中表达的多核苷酸载体，所述多核苷酸表达抗表皮生长因子受体-干扰素(抗egfr-ifn)融合抗体、抗pd-l1-ifn融合抗体或pro-ifn多肽。另一方面，ifn选自以下中的至少一种：ifn-α1、ifn-α2、ifn-α3、ifn-α4、ifn-α5、ifn-α6、ifn-α7、ifn-α8、ifn-α10、ifn-α13、ifn-α14、ifn-α16、ifn-α17、ifn-α21、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ω。另一方面，pro-ifn是pro-ifn-α、pro-ifn-γ或pro-ifn-λ。另一方面，pro-ifn-α或pro-ifn-γ进一步包含ifnar1或ifnar2的胞外结构域。另一方面，pro-ifn-γ进一步包含ifnlr1的胞外结构域。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的异二聚体：抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9或pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的同型二聚体：pro-ifn-fc、抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗vegf(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-pro-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗pd-l1(scfv)-ifn-fc或pro-抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc，ifn或pro-ifn融合构建体可以融合至fc的n-末端或c-末端。另一方面，pro-ifn进一步包含结合ifn并降低ifn的活性，并且与ifn-fc分离的肽、ifn的受体或ifn受体的一部分。另一方面，pro-ifn进一步包含fc区。另一方面，pro-ifn在支气管中由被病毒感染的细胞分泌的蛋白酶活化。16.在另一个实施方案中，本发明包括包含以下中的至少一种的药剂：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚体化组合；或(e)在靶支气管上皮细胞中表达(a)-(d)中所述的融合蛋白的多核苷酸；其中药剂以足以抑制病毒复制或减少病毒负荷的量提供。一方面，药剂是ifn(pro-ifn)、x-pro-ifn或pro-ifn-x，并且以大于每剂1mg/kg的量提供。另一方面，药剂是ifn(pro-ifn)、x-pro-ifn或pro-ifn-x，并且以每剂1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/kg的量提供。另一方面，药剂与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。17.在另一个实施方案中，本发明包括编码至少一种融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。一种包含编码至少一种融合蛋白的多核苷酸的载体，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码至少一种融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。另一方面，多核苷酸编码与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽。一种制备融合蛋白的方法，其包括在翻译融合蛋白的条件下，表达编码至少一种融合蛋白的核糖核酸，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。另一方面，融合蛋白与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。18.附图的简要说明19.为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在连同附图参考本发明的详细描述，其中：20.图1显示了本发明的几种不同的异二聚体构建体，其中，avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体，包括抗pd-l1、抗vegf或抗egfr；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，其是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，其是指阻止或降低ifn活性的任何策略，nc＝不可切割的。21.图2显示了本发明的几种不同的同型二聚体构建体，其中，avab＝抗病毒抗体；aeab＝抗上皮靶点抗体(egfr或pd-l1)；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，其是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，其是指阻止或降低ifn活性的任何策略；nc＝不可切割的。22.图3是显示感染后给予的人pro-ifn(seqidno：19)可以在mmp14切割后抑制vsv感染的图。23.图4是显示用人pro-ifn(seqidno：19)预处理在mmp14切割后减少vsv感染的图。24.图5a和5b是来自被vsv-gfp感染的a549体外培养物的荧光激活细胞分选(facs)数据。25.图6a-6d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理vero细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图6a-ifn-fc(seqidno：38)，图6b-pro-ifn(seqidno：19)，图6c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图6d-消化的pro-ifn。26.图7a-7d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn。27.图8a和8b是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用sar-cov-2感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告sars-cov-2的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn。28.图9a-9e是显示pro-ifn(seqidno：19)可以抑制小鼠的流感诱导的炎症和感染的图。图9a显示了肺il-6的表达，图9b显示了肺mcp-1的表达，图9c显示了以gapdh归一化的h1n1rna的表达，图9d显示了肺tnf的表达，图9e显示了肺ifn-γ的表达。29.图10-25分别显示了本发明的各种构建体seqidno：19-34的图谱。发明的详细说明30.虽然下面详细讨论了本发明的各个实施方案的形成和使用，但是应当理解，本发明提供了许多可以在很多特定上下文中体现的可应用的发明构思。本文所讨论的具体实施方案仅仅是形成和使用本发明的特定方式的说明，并不界定本发明的范围。31.为了便于理解本发明，下面定义了多种术语。本文所定义的术语具有如本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义。如“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”的术语并不旨在仅指单数实体，而是包括其可以使用具体实施例用于说明的大类。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但它们的使用不限制本发明，除非如权利要求中概述的。32.随着covid-19大流行在全球蔓延，截至2020年12月造成了160万人死亡，发明人认识到，用于批准疗法的更快速的途径将是重新利用现有的能够缓解感染传播、死亡率的药剂，和将现有资产最大限度地用于满足大流行的时间限制的开发管线。本发明人认识到，已经在临床开发管线中的基于ifn的mmp可活化前药已经可以为控制和预防呼吸道病毒感染提供有前景的选项。令人惊讶的是，在提交本说明书后，其他人认识到某些蛋白酶在病毒感染，如流感和sars-cov-2感染期间被上调(uelandt，holterjc，holtenar，etal.distinctandearlyincreaseincirculatingmmp-9incovid-19patientswithrespiratoryfailure.jinfect.2020；81(3)：e41-e43.doi：10.1016/j.jinf.2020.06.061)。talmi-frank等人将mt1-mmp描述为在流感病毒感染中具有活性的突出的肺组织重塑蛋白酶(talmi-frankd，altboumz，solomonovi，etal.extracellularmatrixproteolysisbymt1-mmpcontributestoinfluenza-relatedtissuedamageandmortality.cellhostmicrobe.2016；20(4)：458-470.doi：10.1016/j.chom.2016.09.005)。33.本发明涉及具有抗病毒剂的气溶胶喷雾制剂，其覆盖病毒进入点和感染部位，到达鼻通道和肺，半衰期长，并且在粘膜和下呼吸道中不易被降解。本发明包括各种不同的融合蛋白构建体，其可以被递送至病毒感染的组织，例如上呼吸道和下呼吸道。34.在一个实施例中，用于本发明方法的pro-ifn包括由fu和cao在第2020/0123227a1号美国公开文献中教导的那些，相关部分和序列通过引用并入本文。据称，由fu教导的pro-ifn涉及干扰素前药及其在治疗癌症中的用途。这些申请人发现，这样的构建体的一个特别的优点是它们能够在体内发挥强大的抗肿瘤活性，减少了与干扰素疗法相关的许多显著的毒性。35.由病毒感染引起的病毒诱导的恶化的实例包括选自以下的病毒：正粘病毒科(如流感)、副粘病毒科(如呼吸道合胞病毒)、小核糖核酸病毒科(如鼻病毒)、冠状病毒科或黄病毒科病毒。病毒可以是sars、sars-cov、mers-cov、2019-ncov病毒或随后几年的cov。36.如本文所用的，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，以指至少三个核苷酸的聚合物。核苷包含与糖分子连接的含氮碱基。在多核苷酸中，磷酸基团共价连接相邻的核苷以形成聚合物。聚合物可以包括天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、插入的碱基和/或修饰的糖(例如，修饰的嘌呤或嘧啶)。参见，kornbergandbaker(1992)dnareplication，2nded.，freeman，sanfrancisco，ca；scheit(1980)nucleotideanalogs，johnwiley，newyork，ny和第20040092470号美国专利公开文献及其中的参考文献，其进一步讨论了可以用于本文所述多核苷酸的各种核苷酸、核苷和主链结构。多核苷酸可以具有任何长度和序列，并且可以是单链或双链的。当此文件提供核酸序列时，也提供互补序列。此外，当序列作为dna提供时，也提供相应的rna序列(即，其中u替代t的序列)。37.如本文所用的，术语“核酸构建体”是指已经被重组修饰的核酸或衍生自这样的核酸的核酸。例如，核酸构建体可以相对于天然存在的核酸分子含有突变、缺失或取代。核酸构建体可以包含两个或更多个核酸片段，所述核酸片段衍生自或源自不同来源，如不同生物体(例如，重组多核苷酸)。核酸构建体的一个或多个部分的序列可以完全由人发明。38.如本文所用的，“核酸序列”是指核酸材料本身，并且不限于生物化学上表征特定核酸(例如，dna或rna)分子的序列信息(即，选自5个碱基字母a、g、c、t或u的连续字母)。39.如本文所用的，术语“基因”具有其在本领域中所理解的含义。通常，术语“基因”是指包含编码蛋白质的部分的核酸；除了编码序列(开放阅读框)之外，该术语可以任选地包含调控序列，如启动子、增强子、终止子等。该定义不旨在排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而是为了阐明在大多数情况下，此文件中使用的术语是指编码蛋白质的核酸。应当理解，基因的定义可以包括不编码蛋白质，而是提供用于转录功能性rna分子，例如trna或rrna的模板的核酸。40.如本文所用的，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因转录的rna或由从基因转录的rna编码的多肽。基因或多核苷酸的表达是指(1)从基因或多核苷酸转录rna；(2)从基因或多核苷酸转录的rna的翻译，或(1)和(2)两者。41.如本文所用的，术语“载体”是指核酸或病毒、病毒基因组、质粒，或其作为能够在细胞中复制和/或表达核酸分子的核酸分子的一部分。当载体是核酸时，待转移的核酸分子通常连接至，例如插入载体核酸分子。核酸载体可以包含在合适的宿主细胞内指导自主复制的序列(例如，复制起点)，或可以包含足以使得所有核酸的一部分整合到宿主细胞dna中的序列。有用的核酸载体包括例如dna或rna质粒、粘粒，以及天然存在的或经修饰的病毒基因组或其部分，或可以包装到病毒衣壳中的核酸(dna或rna)。质粒载体通常包含复制起点和一个或多个选择标记。质粒可以包含部分或全部病毒基因组(例如，病毒启动子、增强子、加工或包装信号等)。可以用于将核酸分子引入细胞的病毒或其部分(例如，病毒衣壳)被称为病毒载体。有用的动物病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒和其它痘病毒、单纯疱疹病毒等。有用的植物病毒载体包括基于烟草花叶病毒、等轴不稳定环斑病毒等的那些。病毒载体在被引入宿主细胞时可以含有或可以不含有足够的用于产生感染性病毒的病毒遗传信息，即病毒载体可以是复制缺陷型的，并且这样的复制缺陷型病毒载体对于本发明的某些实施方案可能是优选的。当缺乏足够的信息时，其可以但不必须由宿主细胞或由被引入细胞的另一载体提供。“表达载体”是包含一个或多个表达控制序列的载体，“表达控制序列”是控制和调控另一dna序列的转录和/或翻译的dna序列。42.如本文所用的，术语“可操作地连接的”是指两个核酸序列之间的关系，其中核酸序列中的一个的表达例如由另一个核酸序列控制、调控或调节。例如，核酸序列的转录由可操作地连接的启动子序列指导；核酸的转录后加工由可操作地连接的加工序列指导；核酸序列的翻译由可操作地连接的翻译调控序列指导；核酸或多肽的转运或定位由可操作地连接的转运或定位序列指导；并且多肽的翻译后加工由可操作地连接的加工序列指导。可操作地连接至第二核酸序列的核酸序列通常直接或间接地共价连接至这样的序列，尽管任何有效的三维关联都是可接受的。值得注意的是，单个核酸序列可以可操作地连接至多个其它序列。例如，单个启动子可以指导多个rna种类的转录。当rna聚合酶能够将编码序列转录成mrna，然后可以将其翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码序列在细胞中“可操作地连接”表达控制序列并且“在表达控制序列的控制下”。43.用于涉及dna连接酶、dna聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的克隆，dna分离、扩增和纯化的标准技术和各种分离技术是本领域技术人员已知和常用的技术。sambrooketal.(1989)molecularcloning，secondedition，coldspringharborlaboratory，plainview，n.y.；maniatisetal.(1982)molecularcloning，coldspringharborlaboratory，plainview，n.y.；wu(ed.)(1993)meth.enzymol.218，parti；wu(ed.)(1979)meth.enzymol.68；wuetal.(eds.)(1983)meth.enzymol.100and101；grossmanandmoldave(eds.)meth.enzymol.65；miller(ed.)(1972)experimentsinmoleculargenetics，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.；oldandprimrose(1981)principlesofgenemanipulation，universityofcaliforniapress，berkeley；schleifandwensink(1982)practicalmethodsinmolecularbiology；glover(ed.)(1985)dnacloningvol.iandii，irlpress，oxford，uk；hamesandhiggins(eds.)(1985)nucleicacidhybridization，irlpress，oxford，uk；setlowandhollaender(1979)geneticengineering：principlesandmethods，vols.1-4，plenumpress，newyork；fitchen，etal.(1993)annurev.microbiol.47：739-764；tolstoshev，etal.(1993)ingenomicresearchinmolecularmedicineandvirology，academicpress；以及ausubeletal.(1992)currentprotocolsinmolecularbiology，greene/wiley，newyork，n.y.中描述了多种标准技术。当使用时，缩写和命名被认为是在本领域中标准的并且通常用于专业期刊，例如本文引用的那些。许多可用于实践本发明的方法，无论是否在本文中详细描述，对于分子生物学、生物化学、免疫学和医学领域的技术人员来说都是众所周知的。44.如本文所用的，术语“宿主细胞”是指可以将重组表达载体引入其中的细胞。用于所公开的表达系统和方法的宿主细胞通常是真核细胞，如植物细胞。如本文所用的，“转化的”和“转染的”包括通过多种技术中的一种将核酸分子(例如，载体)引入细胞中。45.如本文所用的，术语“多肽”是指氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)如何。多肽可以包括全长蛋白质或其片段或变体。如本文所述的，“感兴趣的多肽”是指细胞表达的靶序列。在一些实施方案中，如本文所述的，感兴趣的多肽可以是在相关类型的细胞中本质上不表达的多肽，或当通过人工干预实现表达时不以表达多肽的水平表达的多肽。在某些实施方案中，感兴趣的多肽可以包括在相关细胞中天然不存在但在其它细胞类型或生物体中天然存在的序列。46.如本文所用的，术语“融合蛋白”是指杂合蛋白，其包含由编码两种多肽中的每一种的至少一部分的多核苷酸的表达产生的两种或更多种不同多肽的部分或其片段。本发明的融合蛋白的非限制性实例包括：(a)可活化的pro-ifn-fc抗体，(b)avab/aeab-ifn-fc抗体、可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc，其中avab/aeab是抗-vegf、抗-egfr或抗-pd-l1；其中融合抗体前药可以由病毒感染期间上呼吸道和下呼吸道中上调的蛋白酶活化。47.如本文所用的，术语“同一性”是指两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列相同的程度。通过比对序列，确定评估窗口内与相同核苷酸或氨基酸相对的核苷酸或氨基酸的数目，允许引入空位(gap)以使同一性最大化，该数目除以窗口中核苷酸或氨基酸的总数，并乘以100来计算评估窗口内两个序列之间的同一性百分比。48.如下确定任何核酸或氨基酸序列的同一性百分比。首先，使用来自包含blastn2.0.14版本和blastp2.0.14版本或等同程序的blastz的独立版本的blast2sequences(bl2seq)程序，将核酸或氨基酸序列与经鉴定的核酸或氨基酸序列进行比较。blastz的该独立版本可以在美国政府的国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)网站(万维网网址ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables)获取。解释如何使用bl2seq程序的说明可以在blastz附带的自述文件中找到。49.在一些情况下，核酸或多肽序列可以包括与seqidno：20-34所述的一个或多个序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或100％的序列同一性)的序列。在一些实施方案中，融合蛋白可以具有与本文所公开的一个或多个序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或100％的序列同一性)的氨基酸序列，然而，某些特定序列是seqidno：19-34、38或39所述的那些。50.pro-ifn由病毒感染期间上调或分泌的蛋白酶活化。蛋白酶的实例包括膜锚定的mmp，mmp14(mt1-mmp)、mmp15(mt2-mmp)、mmp16(mt3-mmp)、mmp17(mt4-mmp)、mmp24(mt5-mmp)、mmp25(mt5-mmp或白溶素)，或基质溶素(matrilysin)mmp-7和mmp-26，或溶基质素(stromelysin)mmp3、mmp10、mmp11、mmp19，或明胶酶mmp2、mmp9，或胶原酶mmp1、mmp8、mmp13、mmp18，或半胱天冬酶1至9中的任一种。51.通常，药剂经配制用于通过气道递送给予，例如，采用气溶胶雾化器向肺气道给予药剂，使得药剂被递送至上呼吸道和下呼吸道。药剂可以与另外的治疗剂同时、分开或依次组合给予。另外的治疗剂可以是吸入的皮质类固醇。在某些实施例中，药剂是在靶支气管上皮细胞中表达的多核苷酸载体，所述多核苷酸表达抗vegf-ifn融合抗体、抗egfr-ifn融合抗体、抗pd-l1-ifn融合抗体、pro-ifn多肽、抗vegf-pro-ifn融合抗体、抗egfr-pro-ifn融合抗体、抗pd-l1-pro-ifn融合蛋白、pro-抗vegf-ifn融合抗体、pro-抗pd-l1-ifn融合抗体、pro-抗vegf-pro-ifn融合抗体，或pro-抗pd-l1-pro-ifn融合抗体。ifn可以选自以下中的至少一种：ifn-α1、ifn-α2、ifn-α3、ifn-α4、ifn-α5、ifn-α6、ifn-α7、ifn-α8、ifn-α10、ifn-α13、ifn-α14、ifn-α16、ifn-α17、ifn-α21、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ω。pro-ifn可以是pro-ifn-α、pro-ifn-γ或pro-ifn-λ。如果药剂是pro-ifn-α或pro-ifn-γ，那么它可以进一步包含ifnar1或ifnar2的胞外结构域。如果药剂是pro-ifn-λ，它可以进一步包含ifnlr1的胞外结构域。52.pro-ifn可以被进一步定义为选自以下中的至少一种的异二聚体：抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9，或pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9。pro-ifn可以进一步包含结合ifn并降低ifn的活性，并且与ifn-fc分离的肽、ifn的受体或ifn受体的一部分。同型二聚体构建体可以具有连接至fc的n’‑末端的抗egfr或抗pd-l1，而ifn或pro-ifn可以连接至fc的c’‑末端。pro-ifn在支气管中由被病毒感染的细胞分泌的蛋白酶活化。53.在本发明之前，已经表明全身或肿瘤内递送pro-ifn可以用于减少肿瘤负荷并且增加针对癌症的免疫力(fu和cao，us2020/0123227a1)。抗egfr-ifnβ先前也在yangx，zhangx，fuml，etal.targetingthetumormicroenvironmentwithinterferon-βbridgesinnateandadaptiveimmuneresponses.cancercell.2014；25(1)：37-48.doi：10.1016/j.ccr.2013.12.00中显示具有抗肿瘤活性。desantis等人测试了低剂量抗egfr气溶胶疗法在动物模型中对肺转移的治疗，并且证明了能够减少转移(desantisr，rosia，anastasiam，etal.efficacyofaerosoltherapyoflungcancercorrelateswithegfrparalysisinducedbyavidinox-anchoredbiotinylatedcetuximab.oncotarget.2014；5(19)：9239-9255.doi：10.18632/oncotarget.2409)。54.评估干扰素-α-2对普通感冒、流感和其它呼吸道感染的治疗和预防能力的临床试验已经有混合结果。hayden等人(jinfectdis.1984)在两项随机双盲研究中评估了在鼻病毒接种后28小时用鼻内喷雾或滴剂治疗志愿者的治疗功效，但在任一项研究中都没有发现对感染或感冒的统计学上显著的预防(haydenfg，gwaltneyjmjr.intranasalinterferon-alpha2treatmentofexperimentalrhinoviralcolds.jinfectdis.1984aug；150(2)：174-80.doi：10.1093/infdis/150.2.174.pmid：6381610)。gao等人对入伍新兵(militaryrecruits)的研究表明，低剂量rifnα-2b可以用于预防由甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1-3引起的感染，但不能用于预防由rsv引起的感染(gaol，yus，chenq，etal.arandomizedcontrolledtrialoflow-doserecombinanthumaninterferonsalpha-2bnasalspraytopreventacuteviralrespiratoryinfectionsinmilitaryrecruits.vaccine.2010；28(28)：4445-4451.doi：10.1016/j.vaccine.2010.03.062)。在预防医务人员的冠状病毒疾病的非随机前瞻性研究中，对rhifn-α滴鼻剂进行了测试，虽然不确定，但表明潜力，并且有必要进一步研究(meng，zhongji&wang，tongyu&li，chen&chen，xinhe&li，longti&qin，xueqin&li，hai&luo，jie.2020.anexperimentaltrialofrecombinanthumaninterferonalphanasaldropstopreventcoronavirusdisease2019inmedicalstaffinanepidemicarea.10.1101/2020.04.11.20061473)。bennett等人令人失望地发现，“低剂量口服ifnα预防法未降低急性呼吸道疾病(ari)的发生率或影响，或疾病对日常活动的影响”。然而，本发明人认为采用锭剂递送方法的研究不足以在病毒进入和感染的合适部位，如鼻通道和下呼吸道靶向流感。55.本发明使用高剂量的pro-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、pro-抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc融合抗体来治疗呼吸道感染。如本文所用的，低剂量是指小于0.1mg/kg受试者体重的剂量。相比之下，本发明的高剂量方案可以包括每剂1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/kg。由于本文的构建体显著更长的半衰期，这些剂量可以每日三次、每日两次或甚至每日一次给予。例如，重组ifn(rifn)的半衰期为约3小时，而pro-ifn-fc的半衰期为90-95小时。因此，本文中的剂量是rifn正常剂量的至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍，无副作用。pro-ifn-fc的剂量特异性可以是rifn的1000倍，这是由于其优越的安全性。56.因此，本发明的融合蛋白包括基于抗体的生物制品或前细胞因子的气溶胶用于病毒感染的用途。为了改善对肺的靶向和保留，还将抗病毒相关或抗上皮相关抗体，如抗vegf、抗pd-l1和抗egfr融合至ifn和pro-ifn。肺是肺中vegf的主要来源。还设计基于胞外域的前药抗体融合体以防止毒性。在icu和非icucovid-19患者中观察到促进血管生成但也诱导血管渗漏和通透性的vegf高于健康对照。因此，设计抗vegf与ifn的融合体以赋予控制导致ards的血管透化的第二作用。此外，抗egfr-ifn-fc的气溶胶可以增加其对上皮细胞的靶向，以预防和减少感染，因为egfr在那些细胞上高度表达，并且抗体可以使ifn在肺上皮细胞上保留更久。病毒感染的细胞表达ifn，其可以快速诱导上皮细胞的pd-l1表达。因此，抗pd-l1-ifn可以更有效地靶向那些感染的细胞。57.最后，病毒感染的组织具有较高水平的mmp，其有助于进行病毒侵入。由于mt1-mmp已经涉及与流感病毒感染相关的组织损伤，本发明的pro-ifn和其它mmp-可活化蛋白可以竞争与mmp的相互作用，变得活化，并且减少感染的细胞中的病毒载量，以及减少炎症。mmp是增加病毒和免疫细胞侵入肺而导致临床特征和病理学的关键蛋白酶。58.由于基于抗体的生物制品的稳定性质，本发明的融合蛋白可以比重组ifn储存更长时间。除了igg球状蛋白由于其最佳折叠结构和二硫键而具有的稳定性之外，还通过用内源性胞外域对ifn和/或抗体结合位点加帽来赋予稳定性。除了脱靶毒性的衰减之外，改善的稳定性实现ifn在不同情况下的实际且有意义的用途。例如，使用者可以将本发明的pro-ifn-fc或其它融合蛋白携带到无冷藏的地方数周，并且在疾病早期期间使用它来预防或治疗感染。采用rifn这将是不可能的，rifn需要冷藏并且只能稳定不到2周。此外，以高浓度储存rifn对于保护细胞因子不损失生物活性是必需的，这需要使用者在给予前稀释和制备样品，因为人不能在无副作用风险的情况下接受高剂量的rifn。由于人的上皮、内皮和髓系表达的新生儿fc受体(fcrn)，因此与rifn相比，基于igg抗体的ifn融合蛋白的体内半衰期增加并且在粘膜中的降解减少，允许更不频繁的给药，赋予使用者更久的保护。59.稳定性还可以实现药物和/或预防剂在发展中国家或农村地区的使用，在发展中国家或农村地区获得常规冷藏是不太可能的。生活在拥挤环境中和正在服役的军人以及在大流行病期间进入公共场所，如飞机或会议的平民可以受益。医院可以维持这样的药物的库存，以针对爆发提供保护，并且在进入高风险场景，例如在呼吸道病毒爆发期间在icu中对患者进行插管之前保护医务人员。本发明可以配制成气溶胶。60.为了递送至鼻或支气管膜，通常将采用气溶胶制剂。术语“气溶胶”包括能够被吸入细支气管或鼻通道的药理学药剂的任何气载悬浮相。具体地，气溶胶包括本发明化合物的液滴的气载悬浮液，如可以在定量吸入器或雾化器、或在喷雾器中产生的。气溶胶还包括悬浮在空气或其它载气中的药理学药剂的化合物的干粉组合物，例如，其可以通过从吸入器设备吹入来递送。61.对于用于制备气溶胶的溶液，本文融合蛋白的优选浓度范围为例如0.1-100毫克(mg)/毫升(ml)，更优选0.1-30mg/ml，最优选1-10mg/ml。通常，溶液用生理相容的缓冲剂，如磷酸盐或碳酸氢盐缓冲。通常的ph值范围为5-9，优选6.5-7.8，更优选7.0-7.6。通常，加入氯化钠以将渗透压调节至生理范围，优选在等渗压的10％内。在remington′spharmaceuticalsciences中讨论了这样的用于产生气溶胶吸入剂的溶液的制剂，也参见gandertonandjones，drugdeliverytotherespiratorytract，ellishorwood(1987)；gonda(1990)criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems6：273-313；和raeburnetal.(1992)j.pharmacol.toxicol.methods27：143-159。62.本文的融合蛋白的溶液可以通过常规用于制备气溶胶吸入药物的任何已知手段转换为气溶胶。通常，这样的方法包括加压或提供对溶液的容器加压的手段，通常用惰性载气，以及使经加压的气体通过小孔口，从而将溶液液滴拉至待给予药物的动物的嘴和气管中。通常，将接嘴装配至孔口的出口，以便于递送至嘴和气管中。63.因为患者依从性，用于调节粘膜中板层小体(或膜被颗粒)突出速率的方法通常将经由药理学干预来完成。经粘膜(即，舌下、直肠、结肠、肺、颊和阴道)的药物递送使活性物质有效进入体循环，并且减少了肝脏和肠壁菌群的即时代谢(参见chieny.w.，noveldrugdeliverysystems，chapter4“mucosaldrugdelivery”，marceldekker，inc.(1992))。经粘膜的药物剂型(例如，片剂、栓剂、软膏、凝胶、阴道栓剂、膜剂和粉剂)通常与粘膜保持接触并且迅速崩解和/或溶解，以实现即时局部和全身吸收。64.本发明的融合蛋白还可以开发为口服制剂，用于其中已经观察到消化道病毒递送的情况。口服递送可以作为液体或固体，例如，锭剂、片剂或胶囊包括在内。这些制剂的制造方法是本领域已知的，包括但不限于将药理学药剂添加至预制片剂；冷压惰性填料、粘合剂以及药理学药剂或含有药剂的物质(如第4,806,356号美国专利中描述的)；以及封装。65.本发明实现高剂量的基于ifn的疗法，其避免了局部和全身毒性，并且克服了目前低剂量癌症疗法的问题。66.图1显示了本发明的几种不同的构建体，其中，avab＝抗病毒抗体；aeab＝抗上皮靶向抗体(egfr或pd-l1)；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断ifn的任何策略；nc＝不可切割的。67.图2显示了本发明的几种不同的同型二聚体构建体，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体，包括抗pd-l1、抗vegf或抗egfr；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断ifn的任何策略；nc＝不可切割的。68.此外，可以通过选择对病毒侵入开放的组织中的基质金属蛋白酶(mmp)敏感的活化肽来提高本发明的特异性。发炎或感染的细胞表达更高水平的mmp。因此，本发明包括mmp-敏感的抗egfr-ifn的前制剂(pro-formulation)，以靶向mmp富集的组织，从而帮助减少副作用和脱靶毒性。前抗体(pro-antibody)也可以与病毒竞争mmp作用，其在病毒感染，如流感期间造成组织损伤。低剂量的重组ifn可能无效(由于毒性和半衰期短)，而本发明的前药实现更大的治疗指数和更高剂量的治疗的使用。69.分别通过在感染前预处理或在感染后处理，在几种细胞系、病毒和小鼠模型中进行病毒抑制试验，以证明预防能力和感染后治疗的影响。70.a549/293/vero h1n1/vsv/sars-cov2的抑制。mmp-14活化和消化。mmp-14(mt1-mmp)和重组人弗林蛋白酶蛋白从r&dsystems获得。在rhfurin和活化缓冲液的混合物中活化mmp-14，所述活化缓冲液是ph9.0的缓冲液，其由50mmtris、1mmcacl2、0.5％brij-35组成，并且通过0.2μm过滤器。mmp-14和rhfurin的最终浓度分别为50ng/μl和0.86ng/μl。将mmp-14和pro-ifn在37℃下以1∶5的摩尔比在试验缓冲液中共孵育过夜，所述试验缓冲液由aldrich)存在下接种在vero单层上，然后在37℃进一步孵育48小时。在cytoflexs流式细胞仪(beckmancoulter)上测量irfp报告子活性。相关感染计算为感染后的irfp 细胞。81.图6a-6d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理vero细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图6a-ifn-fc(seqidno：38)，图6b-pro-ifn(seqidno：19)，图6c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图6d-消化的pro-ifn(seqidno：19)。82.图7a-7d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn(seqidno：19)。83.图8a和8b是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用sar-cov-2感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告sars-cov-2的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn(seqidno：19)。84.体内-小鼠构建体数据。以50000eid50/小鼠用流感a/pr/8/34(h1n1)病毒鼻内感染c57bl/6小鼠。感染后5小时时，以25ug/小鼠的剂量鼻内递送pro-ifn(seqidno：39)。单独将初始(模拟物)和h1na感染用作阴性和阳性对照(每组n＝4)。通过bdtmcba小鼠炎症试剂盒(bdbiosciences)和rt-pcr定量肺组织炎性细胞因子和h1n1病毒rna。数据表示为平均值±sem。85.图9a-9e是显示pro-ifn(seqidno：39)可以抑制小鼠的流感诱导的炎症和感染的图。图9a显示了肺il-6的表达，图9b显示了肺mcp-1的表达，图9c显示了以gapdh归一化的h1n1rna的表达，图9d显示了肺tnf的表达，图9e显示了肺ifn-γ的表达。86.对于涉及抗病毒相关或抗上皮相关抗体融合构建体的构建体，描述了以下预示性实验：87.在感染和炎症期间，生物标志物，如pd-l1将上调，因此抗pd-l1-ifn将引导ifn融合蛋白进入感染部位。ifn进一步上调感染部位处的所有细胞上的pd-l1，使得融合蛋白保留在那些组织中，以获得更大的疗效和保护性用途。88.体外假型病毒抑制试验。将2.5×104个细胞/孔的293-ace2或1.0×104个细胞/孔的vero细胞接种在96孔板中。1天后，将细胞与ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、抗vegf-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、pd-l1-pro-ifn-fc、抗vegf-pro-ifn-fc和抗egfr-pro-ifn-fc在有和没有mmp消化的情况下一起孵育。89.sars-cov-2或vsv假型慢病毒颗粒以moi为0.01或0.5、在10μg/ml聚凝胺(sigma-aldrich)存在下分别接种在293-ace2单层上，在37℃下进一步孵育48小时。vsv假型慢病毒颗粒以moi为0.75、在10μg/ml聚凝胺(sigma-aldrich)存在下接种在vero单层上，在37℃下进一步孵育48小时。在cytoflexs流式细胞仪(beckmancoulter)上测量irfp报告子活性。相关感染计算为感染后的irfp 细胞。90.用ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、抗vegf-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、pd-l1-pro-ifn-fc、抗vegf-pro-ifn-fc和抗egfr-pro-ifn-fc在有和没有mmp消化的情况下预处理vero和ace2293细胞系。2小时后，用vsv-g感染细胞。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。91.体内一在病毒感染后4、24或48小时，鼻内给予50ul的50ug/ml、150ug/ml、450ug/ml不同剂量的ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、抗vegf-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、pd-l1-pro-ifn-fc、抗vegf-pro-ifn-fc和抗egfr-pro-ifn-fc。收集肺组织，用于确定病毒滴度和细胞因子水平以及病理学。细胞因子水平由细胞因子珠阵列(beadarray)确定。收集和测量组织rna，并且以gapdh对h1n1rna的表达归一化。在病毒感染后4、24和48小时时，吸入50μl的50ug/ml、150ug/ml和450ug/ml不同剂量的融合蛋白。在感染后第1天、第3天和第7天收集气道、鼻和肺组织。消化组织，用于确定病毒滴度和细胞因子水平以及病理学。细胞因子将由细胞因子珠阵列确定。收集组织rna，并且将以gapdh对h1n1rna的表达归一化。92.受试者：人或非人哺乳动物。93.优选的方法：雾化或气溶胶化的药物进入鼻和呼吸道以控制或预防呼吸道病毒感染的吸入使用。94.其次的方法：静脉内95.成熟蛋白质的示例性组分序列。96.示例性信号肽为：llsqnafifrslnlvlmvyislvfg-seqidno：17。97.pro-ifn组合物改编自us2020/0123227a1：98.组分：ifn前药含有：一个或两个拷贝的1型ifn结构域；或多于两个拷贝的1型ifn结构域。第一接头可以由至少一种基质金属蛋白酶切割，所述基质金属蛋白酶包括基质金属蛋白酶mmp9或mmp14。igg1fc与1型ifn融合，但也可以使用其它fc结构域。ifnar是ifnar1或ifnar2。ifn可以是以下中的任一种：ifn-α、ifn-β、ifn-κ、ifn-δ、ifn-ε、ifn-τ、ifn-ω或ifn-ξ。也可以使用其它稳定化蛋白，包括人血清白蛋白和转铁蛋白。含有与fc融合的不同的1型干扰素的异二聚体构建体也是可能的。99.[0100][0101]上述结构域通过短肽接头连接在一起。当前药到达或接近被病毒感染的宿主细胞时，干扰素分子和ifnar结构域之间的接头经受切割，从而释放干扰素分子以在病毒感染的部位起作用，以激活免疫途径并刺激抗原呈递。以下是在病毒感染、特别是呼吸道感染，如sars和流感中过表达的酶的实例。[0102]在公共结构域中存在许多mmp可切割序列，其中一些可以通过多种特异性来切割。示例性底物序列包括：[0103][0104]1型干扰素。ifn可以是以下中的任一种：ifn-α、ifn-β、ifn-κ、ifn-δ、ifn-ε、ifn-τ、ifn-ω或ifn-ξ。[0105]人ifn-α1，sp|p01562|24-189-seqidno：7[0106][0107]人ifn-α2-seqidno：8[0108][0109]还要求保护的是同型二聚体和异二聚体与靶向抗体部分，如抗egfr、抗pd-l1和抗vegf的组合。轻链和重链以scfv形式连接，其可以通过任何类型的不可切割接头，如(ggggs)n连接，其长度足以容许scfv构象。[0110]人抗pd-l1scfv[0111]实例：阿特珠单抗[0112]抗pd-l1重链可变区-seqidno：9[0113][0114][0115]抗pd-l1轻链可变区-seqidno：10[0116][0117]人抗egfrscfv[0118]实例：西妥昔单抗[0119]抗egfr重链可变区-seqidno：11[0120][0121]＞抗egfr轻链可变区-seqidno：12[0122][0123]人抗vegfscfv[0124]实例：贝伐单抗[0125]抗vegf重链可变区一seqidno：13[0126][0127]抗vegf轻链可变区一seqidno：14[0128][0129]scfv抗体经由可切割或不可切割的接头与pro-ifn连接。靶向抗体也可以经由与上述相同的可切割接头与封闭部分(blockingmoiety)连接。[0130]对于抗pd-l1，封闭部分是pd-1的胞外结构域。[0131]sp|q15116|24-170-seqidno：15[0132][0133]对于抗vegf，封闭部分是同种型vegf165b或其能够与scfv结合的亚序列。同种型vegf165b不激活下游信号传导途径，并且不激活血管生成。[0134]sp|p15692-8|vegfa_人血管内皮生长因子a的同种型vegf165bos＝智人(homosapiens)ox＝9606gn＝vegfa-seqidno：16[0135][0136]pro-ifn和ifn融合构建体序列和图谱。[0137]图10是seqidno：19的pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0138][0139][0140]示例性异二聚体构建体-所有fc6和fc9组合[0141]图11是seqidno：20的抗vegf-fc6融合蛋白的图谱。[0142][0143]图12是seqidno：21的pro-抗vegf-fc6融合蛋白的图谱。[0144][0145][0146]图13是seqidno：22的抗pd-l1-fc6融合蛋白的图谱。[0147][0148]图14是seqidno：23的pro-抗pd-l1-fc6融合蛋白的图谱。[0149][0150]图15是seqidno：24的抗egfr-fc6融合蛋白的图谱。[0151][0152][0153]图16是seqidno：25的ifn-fc9融合蛋白的图谱。[0154][0155]图17是seqidno：26的pro-ifn-fc9融合蛋白的图谱。[0156][0157][0158]示例性同型二聚体构建体。[0159]图18是seqidno：27的抗vegf-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0160][0161]图19是seqidno：28的pro-抗vegf-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0162][0163][0164]图20是seqidno：29的抗vegf-pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0165][0166][0167]图21是seqidno：30的抗pd-l1-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0168][0169]图22是seqidno：31的pro-抗pd-l1-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0170][0171][0172]图23是seqidno：32的抗pd-l1-pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0173][0174]图24是seqidno：33的抗egfr-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0175][0176][0177]图25是seqidno：34的抗egfr-pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0178][0179][0180]如us20200123227a1中所述，可切割接头的示例性形式是ggggs-底物-ggggs(seqidno：35)或(ggggs)n-底物-(ggggs)n(seqidno：36)，其中n可以是任意数字。不可切割接头是(ggggs)n(seqidno：37)。[0181]seqidno：38的ifn-fc序列。[0182][0183]seqidno：39的小鼠pro-ifn序列[0184][0185]预期就本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物而言，本说明书中所讨论的任何实施方案都可以实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。[0186]应当理解，本文所述的特定实施方案是通过说明而不是作为对本发明的限制来显示的。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用在各个实施方案中。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述具体过程的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本发明的范围内，并且被权利要求所涵盖。[0187]本说明书中提及的所有出版物和专利申请显示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以相同程度通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被特意地且单独地表明通过引用并入。[0188]当与权利要求和/或说明书中的术语“包含(comprising)”结合使用时，词语“一(a)”或“一(an)”的使用可以表示“一(one)”，但它也符合“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的含义。权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是互相排斥的，尽管公开内容支持仅指备选方案和“和/或”的定义。在整个本技术中，术语“约”用于表示值包括设备的误差、用于确定所述值的方法的固有变化，或在研究对象中存在的变化。[0189]如在本说明书和(多项)权利要求中所用的，词语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式，如“have”和“has”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，如“includes”和“include”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式，如“contains”和“contain”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，但不排除其它未列明的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤的存在。在本文所提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含(comprising)”可以用“基本上由…组成”或“由……组成”代替。如本文所用的，术语“组成(consisting)”用于表明仅所列举的整体(例如，特征、要素、特性、性质、方法/工艺步骤或限定)或整体的组(例如，(多个)特征、(多个)要素、(多个)特性、(多个)性质、方法/工艺步骤或(多个)限定)的存在。如本文所用的，短语“基本上由……组成”要求所指定的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，但不排除其它未列明的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，以及不会在实质上影响要求保护的发明的基本的和新颖的(多种)特性和/或功能的那些的存在。[0190]本文所用的术语“或其组合”是指在术语前所列出的项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下中的至少一种：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果在特定上下文中顺序是重要的，则还包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复，如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等的组合。技术人员将理解，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非另外从上下文中显而易见。[0191]如本文所用的，诸如但不限于“约”、“基本的(substantial)”或“基本上(substantially)”的近似词语是指当如此修饰时被理解为不一定是绝对的或完美的，但将被认为对于本领域普通技术人员而言足够接近以保证将情况指定为存在。描述可以改变的程度将取决于可以进行多大的改变，并且使本领域普通技术人员仍将修改的特征识别为仍具有未修改的特征所需的特性和能力。通常，但受制于前述讨论，本文中由诸如“约”的近似词语修饰的数值可以由所述值变化至少±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％或15％。[0192]根据本公开内容，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在没有过度实验的情况下制备和实施。虽然本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及在方法的步骤中或在方法的步骤的顺序中施加变化。对于本领域技术人员显而易见的所有这样的类似替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的发明的精神、范围和构思内。[0193]为了帮助专利局和基于本技术授予的任何专利的任何读者解释本文所附的权利要求，申请人希望注意到，除非在特定权利要求中明确地使用词语“用于……的手段”或“用于……的步骤”，否则他们不打算因为在本文件提交之日335u.s.c.§112的第6段、u.s.c.§112的第(f)段或等同规定存在，所附权利要求中的任一项就对其援引。[0194]对于权利要求中的每一项，每个从属权利要求可以从属于独立权利要求和从属于每一权利要求的在先从属权利中的每一项，只要在先权利要求为权利要求的术语或要素提供了适当的在先基础。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：2.本发明总体上涉及治疗病毒感染的领域。3.联邦政府资助的研究的声明4.不适用。5.以光盘提交的材料通过引用并入6.本技术包括已经经由efs-web以ascii格式提交的序列表，并且特此通过引用以其整体并入。所述ascii副本创建于2021年2月2日，命名为aebi1002.txt，并且大小为140265字节。7.发明的背景8.在不限制本发明的范围的情况下，就病毒感染描述其背景。9.目前，治疗呼吸道病毒，包括流感和冠状病毒的有效方法很少，甚至没有。众所周知的sars-cov、mers-cov和sars-cov2的估计死亡率范围在2％至35％之间。唯一的预防方法是隔离和控制。病毒可以在上皮细胞内快速复制，感染呼吸道中更多的细胞，通过免疫破坏和细胞因子释放综合征导致局部甚至全身损伤。抑制病毒复制是降低疾病严重性的方法，并且已知i型干扰素(ifn)可以通过减少病毒复制来预防症状的发生或降低症状的严重性。然而，重组ifn缺乏针对病毒进入点或呼吸道感染部位的靶向性，半衰期短，引起脱靶副作用，并且受制于快速降解。10.重组ifn作为急性抗病毒疗法已经引发了极大兴趣。许多研究引述了ifn缺乏在covid大流行期间对严重性结果的影响。然而，至今由于担心在高剂量下使流感样症状和细胞因子风暴恶化以及在低剂量下治疗和预防的不确定疗效，因此还没有批准将ifn用于呼吸道疾病。此外，使用ifn作为疗法的历史问题源于全身性和神经性副作用，其导致患有丙型肝炎感染的患者减少剂量至无疗效点或完全终止治疗。例如，sleijfer，etal.sideeffectsofinterferon-αtherapy，pharmworldsci(2005)总结了ifn疗法在试图治疗具有丙型肝炎病毒(hcv)的患者时的显著毒副作用，包括：贫血、癫痫、神经病、心肌病、视网膜异常、肺炎，以及很多种肝脏、结缔组织、皮肤病学、血液学、肺部、代谢和神经病学障碍。这导致wu和metcalf最近出版了题为“theroleoftypeiifnsininfluenza：antiviralsuperheroesorimmunopathogenicvillains？”jinnateimmun2020；12：437-447。bennett，etal.，low-doseoralinterferonalphaasprophylaxisagainstviralrespiratoryillness：adouble-blind，parallelcontrolledtrialduringaninfluenzapandemicyear，influenza，volume7，issue5，specialissue：part2pandemich1n1papers，september2013，pages854-862发现不能开发使用ifn抗流感病毒的治疗，其令人失望地发现，“低剂量口服ifnα预防法未降低急性呼吸道疾病(ari)的发生率或影响、或疾病对日常活动的影响”。11.为了降低ifn的毒性，开发了针对hcv的掩蔽的ifn前药，如授予stagliano等人的第10,523,549号美国专利中所教导的。该专利教导了使用掩蔽肽来阻断ifn活性的ifn融合蛋白的用途。掩蔽肽是以合成方法生成的序列长度为8-15个氨基酸的肽，其被hcv蛋白酶hcv-ns3/4切割，hcv-ns3/4是丙型肝炎病毒在细胞内产生的非结构蛋白。该hcv-pro-ifn必须在hcv蛋白酶切割掩蔽肽以激活ifn活性之前进入细胞，并且使用方法限于丙型肝炎感染。12.需要的是可以安全地治疗患有病毒诱导的感染、特别是呼吸障碍的患者或预防其恶化的新药剂。13.发明的概述14.在一个实施方案中，本发明包括治疗患有病毒感染、病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的患者的方法，所述方法包括：向有其需要的患者给予治疗有效量的药剂，其中药剂包含以下中的至少一种：包含(a)抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体-ifn-fc(avab/aeab-ifn-fc)的融合蛋白，其中avab/aeab是抗pd-l1、抗vegf或抗egfr抗体可变结构域；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)前述融合蛋白的fc-二聚化组合，或(e)在靶支气管上皮细胞中表达(a)-(d)中所述的融合蛋白的多核苷酸；并且其中给予导致病毒复制的抑制，导致患者的病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的减少；并且其中给予导致病毒复制的抑制，导致患者的病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的减少。一方面，病毒诱导的恶化是由选自以下的病毒的感染引起的：正粘病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、弹状病毒科、冠状病毒科或黄病毒科。另一方面，病毒是季节性流感。另一方面，病毒是sars、sars-cov、mers-cov、2019-ncov病毒或随后几年的ncov毒株。另一方面，pro-ifn由病毒感染期间上调或分泌的蛋白酶活化。另一方面，蛋白酶选自膜锚定的mmp，包括mmp14(mt1-mmp)、mmp15(mt2-mmp)、mmp16(mt3-mmp)、mmp17(mt4-mmp)、mmp24(mt5-mmp)、mmp25(mt5-mmp或白溶素)，或基质溶素(matrilysin)mmp-7和mmp-26，或溶基质素(stromelysin)mmp3、mmp10、mmp11、mmp19，或明胶酶mmp2、mmp9，或胶原酶mmp1、mmp8、mmp13、mmp18，或半胱天冬酶1至9中的任一种。另一方面，药剂经配制用于通过鼻咽气道、口咽气道或静脉内递送给予。另一方面，采用气溶胶雾化器向肺气道给予药剂。另一方面，药剂与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。另一方面，向鼻咽气道给予药剂。另一方面，向下呼吸道给予药剂。另一方面，药剂与另外的治疗剂同时、分开或依次组合给予。另一方面，另外的治疗剂是吸入的皮质类固醇。另一方面，药剂包含在靶支气管上皮细胞中表达的多核苷酸载体，所述多核苷酸表达抗表皮生长因子受体-干扰素(抗egfr-ifn)融合抗体、抗pd-l1-ifn融合抗体或pro-ifn多肽。另一方面，ifn选自以下中的至少一种：ifn-α1、ifn-α2、ifn-α3、ifn-α4、ifn-α5、ifn-α6、ifn-α7、ifn-α8、ifn-α10、ifn-α13、ifn-α14、ifn-α16、ifn-α17、ifn-α21、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ω。另一方面，pro-ifn是pro-ifn-α、pro-ifn-γ或pro-ifn-λ。另一方面，pro-ifn-α或pro-ifn-γ进一步包含ifnar1或ifnar2的胞外结构域。另一方面，pro-ifn-γ进一步包含ifnlr1的胞外结构域。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的异二聚体：抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9或pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的同型二聚体：pro-ifn-fc、抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗vegf(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-pro-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗pd-l1(scfv)-ifn-fc或pro-抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc，ifn或pro-ifn融合构建体可以融合至fc的n-末端或c-末端-另一方面，pro-ifn进一步包含结合ifn并降低ifn的活性，并且与ifn-fc分离的肽、ifn的受体或ifn受体的一部分。另一方面，pro-ifn进一步包含fc区。另一方面，pro-ifn在支气管中由被病毒感染的细胞分泌的蛋白酶活化。15.在另一个实施方案中，本发明包括在病毒感染、病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化之前向个体给予的方法，所述方法包括：向个体给予预防有效量的药剂，其中药剂包括以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)前述融合蛋白的任何fc-二聚化组合，或(e)在靶支气管上皮细胞中表达(a)-(d)中所述的融合蛋白的多核苷酸；并且其中给予导致病毒复制的抑制，导致患者的病毒诱导的感染、呼吸障碍或其恶化的减少。另一方面，病毒诱导的恶化是由选自以下的病毒的感染引起的：正粘病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、弹状病毒科、冠状病毒科或黄病毒科。另一方面，病毒是sars、sars-cov、mers-cov或2019-ncov病毒。另一方面，pro-ifn由病毒感染期间上调或分泌的蛋白酶活化。在另一方面，蛋白酶选自膜锚定的mmp，mmp14(mt1-mmp)、mmp15(mt2-mmp)、mmp16(mt3-mmp)、mmp17(mt4-mmp)、mmp24(mt5-mmp)、mmp25(mt5-mmp或白溶素)，或基质溶素(matrilysin)mmp-7和mmp-26，或溶基质素(stromelysin)mmp3、mmp10、mmp11、mmp19，或明胶酶mmp2、mmp9，或胶原酶mmp1、mmp8、mmp13、mmp18，或半胱天冬酶1至9中的任一种。另一方面，药剂经配制用于通过气道或静脉内递送给予。另一方面，采用气溶胶雾化器向肺气道给予药剂。另一方面，药剂与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。另一方面，向下呼吸道给予药剂。另一方面，药剂与另外的治疗剂同时、分开或依次组合给予。另一方面，另外的治疗剂是吸入的皮质类固醇。另一方面，药剂包含在靶支气管上皮细胞中表达的多核苷酸载体，所述多核苷酸表达抗表皮生长因子受体-干扰素(抗egfr-ifn)融合抗体、抗pd-l1-ifn融合抗体或pro-ifn多肽。另一方面，ifn选自以下中的至少一种：ifn-α1、ifn-α2、ifn-α3、ifn-α4、ifn-α5、ifn-α6、ifn-α7、ifn-α8、ifn-α10、ifn-α13、ifn-α14、ifn-α16、ifn-α17、ifn-α21、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ω。另一方面，pro-ifn是pro-ifn-α、pro-ifn-γ或pro-ifn-λ。另一方面，pro-ifn-α或pro-ifn-γ进一步包含ifnar1或ifnar2的胞外结构域。另一方面，pro-ifn-γ进一步包含ifnlr1的胞外结构域。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的异二聚体：抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9或pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9。另一方面，pro-ifn被进一步定义为选自以下中的至少一种的同型二聚体：pro-ifn-fc、抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗vegf(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗vegf(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-ifn-fc、抗egfr(scfv)-pro-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-ifn-fc、抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc、pro-抗pd-l1(scfv)-ifn-fc或pro-抗pd-l1(scfv)-pro-ifn-fc，ifn或pro-ifn融合构建体可以融合至fc的n-末端或c-末端。另一方面，pro-ifn进一步包含结合ifn并降低ifn的活性，并且与ifn-fc分离的肽、ifn的受体或ifn受体的一部分。另一方面，pro-ifn进一步包含fc区。另一方面，pro-ifn在支气管中由被病毒感染的细胞分泌的蛋白酶活化。16.在另一个实施方案中，本发明包括包含以下中的至少一种的药剂：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚体化组合；或(e)在靶支气管上皮细胞中表达(a)-(d)中所述的融合蛋白的多核苷酸；其中药剂以足以抑制病毒复制或减少病毒负荷的量提供。一方面，药剂是ifn(pro-ifn)、x-pro-ifn或pro-ifn-x，并且以大于每剂1mg/kg的量提供。另一方面，药剂是ifn(pro-ifn)、x-pro-ifn或pro-ifn-x，并且以每剂1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/kg的量提供。另一方面，药剂与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。17.在另一个实施方案中，本发明包括编码至少一种融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。一种包含编码至少一种融合蛋白的多核苷酸的载体，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码至少一种融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。另一方面，多核苷酸编码与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽。一种制备融合蛋白的方法，其包括在翻译融合蛋白的条件下，表达编码至少一种融合蛋白的核糖核酸，所述融合蛋白选自以下中的至少一种：(a)avab/aeab-ifn-fc，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体(抗pd-l1、抗vegf或抗egfr)；(b)可活化的pro-ifn-fc融合蛋白(pro-ifn-fc)；(c)包含可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc的融合蛋白；(d)(a)-(c)的融合蛋白的任何fc-二聚化组合。另一方面，融合蛋白与seqidno：19-34、38或39所述的融合蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。18.附图的简要说明19.为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在连同附图参考本发明的详细描述，其中：20.图1显示了本发明的几种不同的异二聚体构建体，其中，avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体，包括抗pd-l1、抗vegf或抗egfr；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，其是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，其是指阻止或降低ifn活性的任何策略，nc＝不可切割的。21.图2显示了本发明的几种不同的同型二聚体构建体，其中，avab＝抗病毒抗体；aeab＝抗上皮靶点抗体(egfr或pd-l1)；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，其是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，其是指阻止或降低ifn活性的任何策略；nc＝不可切割的。22.图3是显示感染后给予的人pro-ifn(seqidno：19)可以在mmp14切割后抑制vsv感染的图。23.图4是显示用人pro-ifn(seqidno：19)预处理在mmp14切割后减少vsv感染的图。24.图5a和5b是来自被vsv-gfp感染的a549体外培养物的荧光激活细胞分选(facs)数据。25.图6a-6d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理vero细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图6a-ifn-fc(seqidno：38)，图6b-pro-ifn(seqidno：19)，图6c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图6d-消化的pro-ifn。26.图7a-7d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn。27.图8a和8b是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用sar-cov-2感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告sars-cov-2的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn。28.图9a-9e是显示pro-ifn(seqidno：19)可以抑制小鼠的流感诱导的炎症和感染的图。图9a显示了肺il-6的表达，图9b显示了肺mcp-1的表达，图9c显示了以gapdh归一化的h1n1rna的表达，图9d显示了肺tnf的表达，图9e显示了肺ifn-γ的表达。29.图10-25分别显示了本发明的各种构建体seqidno：19-34的图谱。发明的详细说明30.虽然下面详细讨论了本发明的各个实施方案的形成和使用，但是应当理解，本发明提供了许多可以在很多特定上下文中体现的可应用的发明构思。本文所讨论的具体实施方案仅仅是形成和使用本发明的特定方式的说明，并不界定本发明的范围。31.为了便于理解本发明，下面定义了多种术语。本文所定义的术语具有如本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义。如“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”的术语并不旨在仅指单数实体，而是包括其可以使用具体实施例用于说明的大类。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但它们的使用不限制本发明，除非如权利要求中概述的。32.随着covid-19大流行在全球蔓延，截至2020年12月造成了160万人死亡，发明人认识到，用于批准疗法的更快速的途径将是重新利用现有的能够缓解感染传播、死亡率的药剂，和将现有资产最大限度地用于满足大流行的时间限制的开发管线。本发明人认识到，已经在临床开发管线中的基于ifn的mmp可活化前药已经可以为控制和预防呼吸道病毒感染提供有前景的选项。令人惊讶的是，在提交本说明书后，其他人认识到某些蛋白酶在病毒感染，如流感和sars-cov-2感染期间被上调(uelandt，holterjc，holtenar，etal.distinctandearlyincreaseincirculatingmmp-9incovid-19patientswithrespiratoryfailure.jinfect.2020；81(3)：e41-e43.doi：10.1016/j.jinf.2020.06.061)。talmi-frank等人将mt1-mmp描述为在流感病毒感染中具有活性的突出的肺组织重塑蛋白酶(talmi-frankd，altboumz，solomonovi，etal.extracellularmatrixproteolysisbymt1-mmpcontributestoinfluenza-relatedtissuedamageandmortality.cellhostmicrobe.2016；20(4)：458-470.doi：10.1016/j.chom.2016.09.005)。33.本发明涉及具有抗病毒剂的气溶胶喷雾制剂，其覆盖病毒进入点和感染部位，到达鼻通道和肺，半衰期长，并且在粘膜和下呼吸道中不易被降解。本发明包括各种不同的融合蛋白构建体，其可以被递送至病毒感染的组织，例如上呼吸道和下呼吸道。34.在一个实施例中，用于本发明方法的pro-ifn包括由fu和cao在第2020/0123227a1号美国公开文献中教导的那些，相关部分和序列通过引用并入本文。据称，由fu教导的pro-ifn涉及干扰素前药及其在治疗癌症中的用途。这些申请人发现，这样的构建体的一个特别的优点是它们能够在体内发挥强大的抗肿瘤活性，减少了与干扰素疗法相关的许多显著的毒性。35.由病毒感染引起的病毒诱导的恶化的实例包括选自以下的病毒：正粘病毒科(如流感)、副粘病毒科(如呼吸道合胞病毒)、小核糖核酸病毒科(如鼻病毒)、冠状病毒科或黄病毒科病毒。病毒可以是sars、sars-cov、mers-cov、2019-ncov病毒或随后几年的cov。36.如本文所用的，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，以指至少三个核苷酸的聚合物。核苷包含与糖分子连接的含氮碱基。在多核苷酸中，磷酸基团共价连接相邻的核苷以形成聚合物。聚合物可以包括天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、插入的碱基和/或修饰的糖(例如，修饰的嘌呤或嘧啶)。参见，kornbergandbaker(1992)dnareplication，2nded.，freeman，sanfrancisco，ca；scheit(1980)nucleotideanalogs，johnwiley，newyork，ny和第20040092470号美国专利公开文献及其中的参考文献，其进一步讨论了可以用于本文所述多核苷酸的各种核苷酸、核苷和主链结构。多核苷酸可以具有任何长度和序列，并且可以是单链或双链的。当此文件提供核酸序列时，也提供互补序列。此外，当序列作为dna提供时，也提供相应的rna序列(即，其中u替代t的序列)。37.如本文所用的，术语“核酸构建体”是指已经被重组修饰的核酸或衍生自这样的核酸的核酸。例如，核酸构建体可以相对于天然存在的核酸分子含有突变、缺失或取代。核酸构建体可以包含两个或更多个核酸片段，所述核酸片段衍生自或源自不同来源，如不同生物体(例如，重组多核苷酸)。核酸构建体的一个或多个部分的序列可以完全由人发明。38.如本文所用的，“核酸序列”是指核酸材料本身，并且不限于生物化学上表征特定核酸(例如，dna或rna)分子的序列信息(即，选自5个碱基字母a、g、c、t或u的连续字母)。39.如本文所用的，术语“基因”具有其在本领域中所理解的含义。通常，术语“基因”是指包含编码蛋白质的部分的核酸；除了编码序列(开放阅读框)之外，该术语可以任选地包含调控序列，如启动子、增强子、终止子等。该定义不旨在排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而是为了阐明在大多数情况下，此文件中使用的术语是指编码蛋白质的核酸。应当理解，基因的定义可以包括不编码蛋白质，而是提供用于转录功能性rna分子，例如trna或rrna的模板的核酸。40.如本文所用的，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因转录的rna或由从基因转录的rna编码的多肽。基因或多核苷酸的表达是指(1)从基因或多核苷酸转录rna；(2)从基因或多核苷酸转录的rna的翻译，或(1)和(2)两者。41.如本文所用的，术语“载体”是指核酸或病毒、病毒基因组、质粒，或其作为能够在细胞中复制和/或表达核酸分子的核酸分子的一部分。当载体是核酸时，待转移的核酸分子通常连接至，例如插入载体核酸分子。核酸载体可以包含在合适的宿主细胞内指导自主复制的序列(例如，复制起点)，或可以包含足以使得所有核酸的一部分整合到宿主细胞dna中的序列。有用的核酸载体包括例如dna或rna质粒、粘粒，以及天然存在的或经修饰的病毒基因组或其部分，或可以包装到病毒衣壳中的核酸(dna或rna)。质粒载体通常包含复制起点和一个或多个选择标记。质粒可以包含部分或全部病毒基因组(例如，病毒启动子、增强子、加工或包装信号等)。可以用于将核酸分子引入细胞的病毒或其部分(例如，病毒衣壳)被称为病毒载体。有用的动物病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒和其它痘病毒、单纯疱疹病毒等。有用的植物病毒载体包括基于烟草花叶病毒、等轴不稳定环斑病毒等的那些。病毒载体在被引入宿主细胞时可以含有或可以不含有足够的用于产生感染性病毒的病毒遗传信息，即病毒载体可以是复制缺陷型的，并且这样的复制缺陷型病毒载体对于本发明的某些实施方案可能是优选的。当缺乏足够的信息时，其可以但不必须由宿主细胞或由被引入细胞的另一载体提供。“表达载体”是包含一个或多个表达控制序列的载体，“表达控制序列”是控制和调控另一dna序列的转录和/或翻译的dna序列。42.如本文所用的，术语“可操作地连接的”是指两个核酸序列之间的关系，其中核酸序列中的一个的表达例如由另一个核酸序列控制、调控或调节。例如，核酸序列的转录由可操作地连接的启动子序列指导；核酸的转录后加工由可操作地连接的加工序列指导；核酸序列的翻译由可操作地连接的翻译调控序列指导；核酸或多肽的转运或定位由可操作地连接的转运或定位序列指导；并且多肽的翻译后加工由可操作地连接的加工序列指导。可操作地连接至第二核酸序列的核酸序列通常直接或间接地共价连接至这样的序列，尽管任何有效的三维关联都是可接受的。值得注意的是，单个核酸序列可以可操作地连接至多个其它序列。例如，单个启动子可以指导多个rna种类的转录。当rna聚合酶能够将编码序列转录成mrna，然后可以将其翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码序列在细胞中“可操作地连接”表达控制序列并且“在表达控制序列的控制下”。43.用于涉及dna连接酶、dna聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的克隆，dna分离、扩增和纯化的标准技术和各种分离技术是本领域技术人员已知和常用的技术。sambrooketal.(1989)molecularcloning，secondedition，coldspringharborlaboratory，plainview，n.y.；maniatisetal.(1982)molecularcloning，coldspringharborlaboratory，plainview，n.y.；wu(ed.)(1993)meth.enzymol.218，parti；wu(ed.)(1979)meth.enzymol.68；wuetal.(eds.)(1983)meth.enzymol.100and101；grossmanandmoldave(eds.)meth.enzymol.65；miller(ed.)(1972)experimentsinmoleculargenetics，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.；oldandprimrose(1981)principlesofgenemanipulation，universityofcaliforniapress，berkeley；schleifandwensink(1982)practicalmethodsinmolecularbiology；glover(ed.)(1985)dnacloningvol.iandii，irlpress，oxford，uk；hamesandhiggins(eds.)(1985)nucleicacidhybridization，irlpress，oxford，uk；setlowandhollaender(1979)geneticengineering：principlesandmethods，vols.1-4，plenumpress，newyork；fitchen，etal.(1993)annurev.microbiol.47：739-764；tolstoshev，etal.(1993)ingenomicresearchinmolecularmedicineandvirology，academicpress；以及ausubeletal.(1992)currentprotocolsinmolecularbiology，greene/wiley，newyork，n.y.中描述了多种标准技术。当使用时，缩写和命名被认为是在本领域中标准的并且通常用于专业期刊，例如本文引用的那些。许多可用于实践本发明的方法，无论是否在本文中详细描述，对于分子生物学、生物化学、免疫学和医学领域的技术人员来说都是众所周知的。44.如本文所用的，术语“宿主细胞”是指可以将重组表达载体引入其中的细胞。用于所公开的表达系统和方法的宿主细胞通常是真核细胞，如植物细胞。如本文所用的，“转化的”和“转染的”包括通过多种技术中的一种将核酸分子(例如，载体)引入细胞中。45.如本文所用的，术语“多肽”是指氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)如何。多肽可以包括全长蛋白质或其片段或变体。如本文所述的，“感兴趣的多肽”是指细胞表达的靶序列。在一些实施方案中，如本文所述的，感兴趣的多肽可以是在相关类型的细胞中本质上不表达的多肽，或当通过人工干预实现表达时不以表达多肽的水平表达的多肽。在某些实施方案中，感兴趣的多肽可以包括在相关细胞中天然不存在但在其它细胞类型或生物体中天然存在的序列。46.如本文所用的，术语“融合蛋白”是指杂合蛋白，其包含由编码两种多肽中的每一种的至少一部分的多核苷酸的表达产生的两种或更多种不同多肽的部分或其片段。本发明的融合蛋白的非限制性实例包括：(a)可活化的pro-ifn-fc抗体，(b)avab/aeab-ifn-fc抗体、可活化的pro-avab/aeab-ifn-fc、可活化的avab/aeab-pro-ifn-fc或pro-avab/aeab-pro-ifn-fc，其中avab/aeab是抗-vegf、抗-egfr或抗-pd-l1；其中融合抗体前药可以由病毒感染期间上呼吸道和下呼吸道中上调的蛋白酶活化。47.如本文所用的，术语“同一性”是指两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列相同的程度。通过比对序列，确定评估窗口内与相同核苷酸或氨基酸相对的核苷酸或氨基酸的数目，允许引入空位(gap)以使同一性最大化，该数目除以窗口中核苷酸或氨基酸的总数，并乘以100来计算评估窗口内两个序列之间的同一性百分比。48.如下确定任何核酸或氨基酸序列的同一性百分比。首先，使用来自包含blastn2.0.14版本和blastp2.0.14版本或等同程序的blastz的独立版本的blast2sequences(bl2seq)程序，将核酸或氨基酸序列与经鉴定的核酸或氨基酸序列进行比较。blastz的该独立版本可以在美国政府的国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)网站(万维网网址ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables)获取。解释如何使用bl2seq程序的说明可以在blastz附带的自述文件中找到。49.在一些情况下，核酸或多肽序列可以包括与seqidno：20-34所述的一个或多个序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或100％的序列同一性)的序列。在一些实施方案中，融合蛋白可以具有与本文所公开的一个或多个序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或100％的序列同一性)的氨基酸序列，然而，某些特定序列是seqidno：19-34、38或39所述的那些。50.pro-ifn由病毒感染期间上调或分泌的蛋白酶活化。蛋白酶的实例包括膜锚定的mmp，mmp14(mt1-mmp)、mmp15(mt2-mmp)、mmp16(mt3-mmp)、mmp17(mt4-mmp)、mmp24(mt5-mmp)、mmp25(mt5-mmp或白溶素)，或基质溶素(matrilysin)mmp-7和mmp-26，或溶基质素(stromelysin)mmp3、mmp10、mmp11、mmp19，或明胶酶mmp2、mmp9，或胶原酶mmp1、mmp8、mmp13、mmp18，或半胱天冬酶1至9中的任一种。51.通常，药剂经配制用于通过气道递送给予，例如，采用气溶胶雾化器向肺气道给予药剂，使得药剂被递送至上呼吸道和下呼吸道。药剂可以与另外的治疗剂同时、分开或依次组合给予。另外的治疗剂可以是吸入的皮质类固醇。在某些实施例中，药剂是在靶支气管上皮细胞中表达的多核苷酸载体，所述多核苷酸表达抗vegf-ifn融合抗体、抗egfr-ifn融合抗体、抗pd-l1-ifn融合抗体、pro-ifn多肽、抗vegf-pro-ifn融合抗体、抗egfr-pro-ifn融合抗体、抗pd-l1-pro-ifn融合蛋白、pro-抗vegf-ifn融合抗体、pro-抗pd-l1-ifn融合抗体、pro-抗vegf-pro-ifn融合抗体，或pro-抗pd-l1-pro-ifn融合抗体。ifn可以选自以下中的至少一种：ifn-α1、ifn-α2、ifn-α3、ifn-α4、ifn-α5、ifn-α6、ifn-α7、ifn-α8、ifn-α10、ifn-α13、ifn-α14、ifn-α16、ifn-α17、ifn-α21、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ω。pro-ifn可以是pro-ifn-α、pro-ifn-γ或pro-ifn-λ。如果药剂是pro-ifn-α或pro-ifn-γ，那么它可以进一步包含ifnar1或ifnar2的胞外结构域。如果药剂是pro-ifn-λ，它可以进一步包含ifnlr1的胞外结构域。52.pro-ifn可以被进一步定义为选自以下中的至少一种的异二聚体：抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、pro-抗vegf(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗egfr(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9、抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9、pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑ifn-fc9，或pro-抗pd-l1(scfv)-fc6‑‑pro-ifn-fc9。pro-ifn可以进一步包含结合ifn并降低ifn的活性，并且与ifn-fc分离的肽、ifn的受体或ifn受体的一部分。同型二聚体构建体可以具有连接至fc的n’‑末端的抗egfr或抗pd-l1，而ifn或pro-ifn可以连接至fc的c’‑末端。pro-ifn在支气管中由被病毒感染的细胞分泌的蛋白酶活化。53.在本发明之前，已经表明全身或肿瘤内递送pro-ifn可以用于减少肿瘤负荷并且增加针对癌症的免疫力(fu和cao，us2020/0123227a1)。抗egfr-ifnβ先前也在yangx，zhangx，fuml，etal.targetingthetumormicroenvironmentwithinterferon-βbridgesinnateandadaptiveimmuneresponses.cancercell.2014；25(1)：37-48.doi：10.1016/j.ccr.2013.12.00中显示具有抗肿瘤活性。desantis等人测试了低剂量抗egfr气溶胶疗法在动物模型中对肺转移的治疗，并且证明了能够减少转移(desantisr，rosia，anastasiam，etal.efficacyofaerosoltherapyoflungcancercorrelateswithegfrparalysisinducedbyavidinox-anchoredbiotinylatedcetuximab.oncotarget.2014；5(19)：9239-9255.doi：10.18632/oncotarget.2409)。54.评估干扰素-α-2对普通感冒、流感和其它呼吸道感染的治疗和预防能力的临床试验已经有混合结果。hayden等人(jinfectdis.1984)在两项随机双盲研究中评估了在鼻病毒接种后28小时用鼻内喷雾或滴剂治疗志愿者的治疗功效，但在任一项研究中都没有发现对感染或感冒的统计学上显著的预防(haydenfg，gwaltneyjmjr.intranasalinterferon-alpha2treatmentofexperimentalrhinoviralcolds.jinfectdis.1984aug；150(2)：174-80.doi：10.1093/infdis/150.2.174.pmid：6381610)。gao等人对入伍新兵(militaryrecruits)的研究表明，低剂量rifnα-2b可以用于预防由甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1-3引起的感染，但不能用于预防由rsv引起的感染(gaol，yus，chenq，etal.arandomizedcontrolledtrialoflow-doserecombinanthumaninterferonsalpha-2bnasalspraytopreventacuteviralrespiratoryinfectionsinmilitaryrecruits.vaccine.2010；28(28)：4445-4451.doi：10.1016/j.vaccine.2010.03.062)。在预防医务人员的冠状病毒疾病的非随机前瞻性研究中，对rhifn-α滴鼻剂进行了测试，虽然不确定，但表明潜力，并且有必要进一步研究(meng，zhongji&wang，tongyu&li，chen&chen，xinhe&li，longti&qin，xueqin&li，hai&luo，jie.2020.anexperimentaltrialofrecombinanthumaninterferonalphanasaldropstopreventcoronavirusdisease2019inmedicalstaffinanepidemicarea.10.1101/2020.04.11.20061473)。bennett等人令人失望地发现，“低剂量口服ifnα预防法未降低急性呼吸道疾病(ari)的发生率或影响，或疾病对日常活动的影响”。然而，本发明人认为采用锭剂递送方法的研究不足以在病毒进入和感染的合适部位，如鼻通道和下呼吸道靶向流感。55.本发明使用高剂量的pro-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、pro-抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc融合抗体来治疗呼吸道感染。如本文所用的，低剂量是指小于0.1mg/kg受试者体重的剂量。相比之下，本发明的高剂量方案可以包括每剂1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/kg。由于本文的构建体显著更长的半衰期，这些剂量可以每日三次、每日两次或甚至每日一次给予。例如，重组ifn(rifn)的半衰期为约3小时，而pro-ifn-fc的半衰期为90-95小时。因此，本文中的剂量是rifn正常剂量的至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍，无副作用。pro-ifn-fc的剂量特异性可以是rifn的1000倍，这是由于其优越的安全性。56.因此，本发明的融合蛋白包括基于抗体的生物制品或前细胞因子的气溶胶用于病毒感染的用途。为了改善对肺的靶向和保留，还将抗病毒相关或抗上皮相关抗体，如抗vegf、抗pd-l1和抗egfr融合至ifn和pro-ifn。肺是肺中vegf的主要来源。还设计基于胞外域的前药抗体融合体以防止毒性。在icu和非icucovid-19患者中观察到促进血管生成但也诱导血管渗漏和通透性的vegf高于健康对照。因此，设计抗vegf与ifn的融合体以赋予控制导致ards的血管透化的第二作用。此外，抗egfr-ifn-fc的气溶胶可以增加其对上皮细胞的靶向，以预防和减少感染，因为egfr在那些细胞上高度表达，并且抗体可以使ifn在肺上皮细胞上保留更久。病毒感染的细胞表达ifn，其可以快速诱导上皮细胞的pd-l1表达。因此，抗pd-l1-ifn可以更有效地靶向那些感染的细胞。57.最后，病毒感染的组织具有较高水平的mmp，其有助于进行病毒侵入。由于mt1-mmp已经涉及与流感病毒感染相关的组织损伤，本发明的pro-ifn和其它mmp-可活化蛋白可以竞争与mmp的相互作用，变得活化，并且减少感染的细胞中的病毒载量，以及减少炎症。mmp是增加病毒和免疫细胞侵入肺而导致临床特征和病理学的关键蛋白酶。58.由于基于抗体的生物制品的稳定性质，本发明的融合蛋白可以比重组ifn储存更长时间。除了igg球状蛋白由于其最佳折叠结构和二硫键而具有的稳定性之外，还通过用内源性胞外域对ifn和/或抗体结合位点加帽来赋予稳定性。除了脱靶毒性的衰减之外，改善的稳定性实现ifn在不同情况下的实际且有意义的用途。例如，使用者可以将本发明的pro-ifn-fc或其它融合蛋白携带到无冷藏的地方数周，并且在疾病早期期间使用它来预防或治疗感染。采用rifn这将是不可能的，rifn需要冷藏并且只能稳定不到2周。此外，以高浓度储存rifn对于保护细胞因子不损失生物活性是必需的，这需要使用者在给予前稀释和制备样品，因为人不能在无副作用风险的情况下接受高剂量的rifn。由于人的上皮、内皮和髓系表达的新生儿fc受体(fcrn)，因此与rifn相比，基于igg抗体的ifn融合蛋白的体内半衰期增加并且在粘膜中的降解减少，允许更不频繁的给药，赋予使用者更久的保护。59.稳定性还可以实现药物和/或预防剂在发展中国家或农村地区的使用，在发展中国家或农村地区获得常规冷藏是不太可能的。生活在拥挤环境中和正在服役的军人以及在大流行病期间进入公共场所，如飞机或会议的平民可以受益。医院可以维持这样的药物的库存，以针对爆发提供保护，并且在进入高风险场景，例如在呼吸道病毒爆发期间在icu中对患者进行插管之前保护医务人员。本发明可以配制成气溶胶。60.为了递送至鼻或支气管膜，通常将采用气溶胶制剂。术语“气溶胶”包括能够被吸入细支气管或鼻通道的药理学药剂的任何气载悬浮相。具体地，气溶胶包括本发明化合物的液滴的气载悬浮液，如可以在定量吸入器或雾化器、或在喷雾器中产生的。气溶胶还包括悬浮在空气或其它载气中的药理学药剂的化合物的干粉组合物，例如，其可以通过从吸入器设备吹入来递送。61.对于用于制备气溶胶的溶液，本文融合蛋白的优选浓度范围为例如0.1-100毫克(mg)/毫升(ml)，更优选0.1-30mg/ml，最优选1-10mg/ml。通常，溶液用生理相容的缓冲剂，如磷酸盐或碳酸氢盐缓冲。通常的ph值范围为5-9，优选6.5-7.8，更优选7.0-7.6。通常，加入氯化钠以将渗透压调节至生理范围，优选在等渗压的10％内。在remington′spharmaceuticalsciences中讨论了这样的用于产生气溶胶吸入剂的溶液的制剂，也参见gandertonandjones，drugdeliverytotherespiratorytract，ellishorwood(1987)；gonda(1990)criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems6：273-313；和raeburnetal.(1992)j.pharmacol.toxicol.methods27：143-159。62.本文的融合蛋白的溶液可以通过常规用于制备气溶胶吸入药物的任何已知手段转换为气溶胶。通常，这样的方法包括加压或提供对溶液的容器加压的手段，通常用惰性载气，以及使经加压的气体通过小孔口，从而将溶液液滴拉至待给予药物的动物的嘴和气管中。通常，将接嘴装配至孔口的出口，以便于递送至嘴和气管中。63.因为患者依从性，用于调节粘膜中板层小体(或膜被颗粒)突出速率的方法通常将经由药理学干预来完成。经粘膜(即，舌下、直肠、结肠、肺、颊和阴道)的药物递送使活性物质有效进入体循环，并且减少了肝脏和肠壁菌群的即时代谢(参见chieny.w.，noveldrugdeliverysystems，chapter4“mucosaldrugdelivery”，marceldekker，inc.(1992))。经粘膜的药物剂型(例如，片剂、栓剂、软膏、凝胶、阴道栓剂、膜剂和粉剂)通常与粘膜保持接触并且迅速崩解和/或溶解，以实现即时局部和全身吸收。64.本发明的融合蛋白还可以开发为口服制剂，用于其中已经观察到消化道病毒递送的情况。口服递送可以作为液体或固体，例如，锭剂、片剂或胶囊包括在内。这些制剂的制造方法是本领域已知的，包括但不限于将药理学药剂添加至预制片剂；冷压惰性填料、粘合剂以及药理学药剂或含有药剂的物质(如第4,806,356号美国专利中描述的)；以及封装。65.本发明实现高剂量的基于ifn的疗法，其避免了局部和全身毒性，并且克服了目前低剂量癌症疗法的问题。66.图1显示了本发明的几种不同的构建体，其中，avab＝抗病毒抗体；aeab＝抗上皮靶向抗体(egfr或pd-l1)；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断ifn的任何策略；nc＝不可切割的。67.图2显示了本发明的几种不同的同型二聚体构建体，其中avab/aeab＝抗病毒相关抗体或抗上皮相关抗体，包括抗pd-l1、抗vegf或抗egfr；psub＝蛋白酶底物(所有mmp和半胱天冬酶)；ifn＝所列出的i型、ii型和iii型干扰素中的任一种；pro-c1＝前药构建体1，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断融合蛋白的靶向抗体部分的任何策略；pro-c2＝前药构建体2，是指阻止或降低活性药物活性，关注于阻断ifn的任何策略；nc＝不可切割的。68.此外，可以通过选择对病毒侵入开放的组织中的基质金属蛋白酶(mmp)敏感的活化肽来提高本发明的特异性。发炎或感染的细胞表达更高水平的mmp。因此，本发明包括mmp-敏感的抗egfr-ifn的前制剂(pro-formulation)，以靶向mmp富集的组织，从而帮助减少副作用和脱靶毒性。前抗体(pro-antibody)也可以与病毒竞争mmp作用，其在病毒感染，如流感期间造成组织损伤。低剂量的重组ifn可能无效(由于毒性和半衰期短)，而本发明的前药实现更大的治疗指数和更高剂量的治疗的使用。69.分别通过在感染前预处理或在感染后处理，在几种细胞系、病毒和小鼠模型中进行病毒抑制试验，以证明预防能力和感染后治疗的影响。70.a549/293/vero h1n1/vsv/sars-cov2的抑制。mmp-14活化和消化。mmp-14(mt1-mmp)和重组人弗林蛋白酶蛋白从r&dsystems获得。在rhfurin和活化缓冲液的混合物中活化mmp-14，所述活化缓冲液是ph9.0的缓冲液，其由50mmtris、1mmcacl2、0.5％brij-35组成，并且通过0.2μm过滤器。mmp-14和rhfurin的最终浓度分别为50ng/μl和0.86ng/μl。将mmp-14和pro-ifn在37℃下以1∶5的摩尔比在试验缓冲液中共孵育过夜，所述试验缓冲液由aldrich)存在下接种在vero单层上，然后在37℃进一步孵育48小时。在cytoflexs流式细胞仪(beckmancoulter)上测量irfp报告子活性。相关感染计算为感染后的irfp 细胞。81.图6a-6d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理vero细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图6a-ifn-fc(seqidno：38)，图6b-pro-ifn(seqidno：19)，图6c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图6d-消化的pro-ifn(seqidno：19)。82.图7a-7d是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用vsv-g感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn(seqidno：19)。83.图8a和8b是显示用ifn-fc(seqidno：38)或pro-ifn(seqidno：19)预处理ace2293细胞系，2小时后，用sar-cov-2感染细胞的图。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告sars-cov-2的相关病毒感染水平。图7a-ifn-fc(seqidno：38)，图7b-pro-ifn(seqidno：19)，图7c-rifn(r&dsystems，cat#11100-1)，以及图7d-消化的pro-ifn(seqidno：19)。84.体内-小鼠构建体数据。以50000eid50/小鼠用流感a/pr/8/34(h1n1)病毒鼻内感染c57bl/6小鼠。感染后5小时时，以25ug/小鼠的剂量鼻内递送pro-ifn(seqidno：39)。单独将初始(模拟物)和h1na感染用作阴性和阳性对照(每组n＝4)。通过bdtmcba小鼠炎症试剂盒(bdbiosciences)和rt-pcr定量肺组织炎性细胞因子和h1n1病毒rna。数据表示为平均值±sem。85.图9a-9e是显示pro-ifn(seqidno：39)可以抑制小鼠的流感诱导的炎症和感染的图。图9a显示了肺il-6的表达，图9b显示了肺mcp-1的表达，图9c显示了以gapdh归一化的h1n1rna的表达，图9d显示了肺tnf的表达，图9e显示了肺ifn-γ的表达。86.对于涉及抗病毒相关或抗上皮相关抗体融合构建体的构建体，描述了以下预示性实验：87.在感染和炎症期间，生物标志物，如pd-l1将上调，因此抗pd-l1-ifn将引导ifn融合蛋白进入感染部位。ifn进一步上调感染部位处的所有细胞上的pd-l1，使得融合蛋白保留在那些组织中，以获得更大的疗效和保护性用途。88.体外假型病毒抑制试验。将2.5×104个细胞/孔的293-ace2或1.0×104个细胞/孔的vero细胞接种在96孔板中。1天后，将细胞与ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、抗vegf-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、pd-l1-pro-ifn-fc、抗vegf-pro-ifn-fc和抗egfr-pro-ifn-fc在有和没有mmp消化的情况下一起孵育。89.sars-cov-2或vsv假型慢病毒颗粒以moi为0.01或0.5、在10μg/ml聚凝胺(sigma-aldrich)存在下分别接种在293-ace2单层上，在37℃下进一步孵育48小时。vsv假型慢病毒颗粒以moi为0.75、在10μg/ml聚凝胺(sigma-aldrich)存在下接种在vero单层上，在37℃下进一步孵育48小时。在cytoflexs流式细胞仪(beckmancoulter)上测量irfp报告子活性。相关感染计算为感染后的irfp 细胞。90.用ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、抗vegf-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、pd-l1-pro-ifn-fc、抗vegf-pro-ifn-fc和抗egfr-pro-ifn-fc在有和没有mmp消化的情况下预处理vero和ace2293细胞系。2小时后，用vsv-g感染细胞。2天后测量病毒载量。通过rfp或荧光素酶报告vsv-g的相关病毒感染水平。91.体内一在病毒感染后4、24或48小时，鼻内给予50ul的50ug/ml、150ug/ml、450ug/ml不同剂量的ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、抗vegf-ifn-fc、抗egfr-ifn-fc、抗pd-l1-ifn-fc、pd-l1-pro-ifn-fc、抗vegf-pro-ifn-fc和抗egfr-pro-ifn-fc。收集肺组织，用于确定病毒滴度和细胞因子水平以及病理学。细胞因子水平由细胞因子珠阵列(beadarray)确定。收集和测量组织rna，并且以gapdh对h1n1rna的表达归一化。在病毒感染后4、24和48小时时，吸入50μl的50ug/ml、150ug/ml和450ug/ml不同剂量的融合蛋白。在感染后第1天、第3天和第7天收集气道、鼻和肺组织。消化组织，用于确定病毒滴度和细胞因子水平以及病理学。细胞因子将由细胞因子珠阵列确定。收集组织rna，并且将以gapdh对h1n1rna的表达归一化。92.受试者：人或非人哺乳动物。93.优选的方法：雾化或气溶胶化的药物进入鼻和呼吸道以控制或预防呼吸道病毒感染的吸入使用。94.其次的方法：静脉内95.成熟蛋白质的示例性组分序列。96.示例性信号肽为：llsqnafifrslnlvlmvyislvfg-seqidno：17。97.pro-ifn组合物改编自us2020/0123227a1：98.组分：ifn前药含有：一个或两个拷贝的1型ifn结构域；或多于两个拷贝的1型ifn结构域。第一接头可以由至少一种基质金属蛋白酶切割，所述基质金属蛋白酶包括基质金属蛋白酶mmp9或mmp14。igg1fc与1型ifn融合，但也可以使用其它fc结构域。ifnar是ifnar1或ifnar2。ifn可以是以下中的任一种：ifn-α、ifn-β、ifn-κ、ifn-δ、ifn-ε、ifn-τ、ifn-ω或ifn-ξ。也可以使用其它稳定化蛋白，包括人血清白蛋白和转铁蛋白。含有与fc融合的不同的1型干扰素的异二聚体构建体也是可能的。99.[0100][0101]上述结构域通过短肽接头连接在一起。当前药到达或接近被病毒感染的宿主细胞时，干扰素分子和ifnar结构域之间的接头经受切割，从而释放干扰素分子以在病毒感染的部位起作用，以激活免疫途径并刺激抗原呈递。以下是在病毒感染、特别是呼吸道感染，如sars和流感中过表达的酶的实例。[0102]在公共结构域中存在许多mmp可切割序列，其中一些可以通过多种特异性来切割。示例性底物序列包括：[0103][0104]1型干扰素。ifn可以是以下中的任一种：ifn-α、ifn-β、ifn-κ、ifn-δ、ifn-ε、ifn-τ、ifn-ω或ifn-ξ。[0105]人ifn-α1，sp|p01562|24-189-seqidno：7[0106][0107]人ifn-α2-seqidno：8[0108][0109]还要求保护的是同型二聚体和异二聚体与靶向抗体部分，如抗egfr、抗pd-l1和抗vegf的组合。轻链和重链以scfv形式连接，其可以通过任何类型的不可切割接头，如(ggggs)n连接，其长度足以容许scfv构象。[0110]人抗pd-l1scfv[0111]实例：阿特珠单抗[0112]抗pd-l1重链可变区-seqidno：9[0113][0114][0115]抗pd-l1轻链可变区-seqidno：10[0116][0117]人抗egfrscfv[0118]实例：西妥昔单抗[0119]抗egfr重链可变区-seqidno：11[0120][0121]＞抗egfr轻链可变区-seqidno：12[0122][0123]人抗vegfscfv[0124]实例：贝伐单抗[0125]抗vegf重链可变区一seqidno：13[0126][0127]抗vegf轻链可变区一seqidno：14[0128][0129]scfv抗体经由可切割或不可切割的接头与pro-ifn连接。靶向抗体也可以经由与上述相同的可切割接头与封闭部分(blockingmoiety)连接。[0130]对于抗pd-l1，封闭部分是pd-1的胞外结构域。[0131]sp|q15116|24-170-seqidno：15[0132][0133]对于抗vegf，封闭部分是同种型vegf165b或其能够与scfv结合的亚序列。同种型vegf165b不激活下游信号传导途径，并且不激活血管生成。[0134]sp|p15692-8|vegfa_人血管内皮生长因子a的同种型vegf165bos＝智人(homosapiens)ox＝9606gn＝vegfa-seqidno：16[0135][0136]pro-ifn和ifn融合构建体序列和图谱。[0137]图10是seqidno：19的pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0138][0139][0140]示例性异二聚体构建体-所有fc6和fc9组合[0141]图11是seqidno：20的抗vegf-fc6融合蛋白的图谱。[0142][0143]图12是seqidno：21的pro-抗vegf-fc6融合蛋白的图谱。[0144][0145][0146]图13是seqidno：22的抗pd-l1-fc6融合蛋白的图谱。[0147][0148]图14是seqidno：23的pro-抗pd-l1-fc6融合蛋白的图谱。[0149][0150]图15是seqidno：24的抗egfr-fc6融合蛋白的图谱。[0151][0152][0153]图16是seqidno：25的ifn-fc9融合蛋白的图谱。[0154][0155]图17是seqidno：26的pro-ifn-fc9融合蛋白的图谱。[0156][0157][0158]示例性同型二聚体构建体。[0159]图18是seqidno：27的抗vegf-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0160][0161]图19是seqidno：28的pro-抗vegf-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0162][0163][0164]图20是seqidno：29的抗vegf-pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0165][0166][0167]图21是seqidno：30的抗pd-l1-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0168][0169]图22是seqidno：31的pro-抗pd-l1-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0170][0171][0172]图23是seqidno：32的抗pd-l1-pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0173][0174]图24是seqidno：33的抗egfr-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0175][0176][0177]图25是seqidno：34的抗egfr-pro-ifn-fc融合蛋白的图谱。[0178][0179][0180]如us20200123227a1中所述，可切割接头的示例性形式是ggggs-底物-ggggs(seqidno：35)或(ggggs)n-底物-(ggggs)n(seqidno：36)，其中n可以是任意数字。不可切割接头是(ggggs)n(seqidno：37)。[0181]seqidno：38的ifn-fc序列。[0182][0183]seqidno：39的小鼠pro-ifn序列[0184][0185]预期就本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物而言，本说明书中所讨论的任何实施方案都可以实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。[0186]应当理解，本文所述的特定实施方案是通过说明而不是作为对本发明的限制来显示的。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用在各个实施方案中。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述具体过程的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本发明的范围内，并且被权利要求所涵盖。[0187]本说明书中提及的所有出版物和专利申请显示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以相同程度通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被特意地且单独地表明通过引用并入。[0188]当与权利要求和/或说明书中的术语“包含(comprising)”结合使用时，词语“一(a)”或“一(an)”的使用可以表示“一(one)”，但它也符合“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的含义。权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是互相排斥的，尽管公开内容支持仅指备选方案和“和/或”的定义。在整个本技术中，术语“约”用于表示值包括设备的误差、用于确定所述值的方法的固有变化，或在研究对象中存在的变化。[0189]如在本说明书和(多项)权利要求中所用的，词语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式，如“have”和“has”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，如“includes”和“include”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式，如“contains”和“contain”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，但不排除其它未列明的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤的存在。在本文所提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含(comprising)”可以用“基本上由…组成”或“由……组成”代替。如本文所用的，术语“组成(consisting)”用于表明仅所列举的整体(例如，特征、要素、特性、性质、方法/工艺步骤或限定)或整体的组(例如，(多个)特征、(多个)要素、(多个)特性、(多个)性质、方法/工艺步骤或(多个)限定)的存在。如本文所用的，短语“基本上由……组成”要求所指定的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，但不排除其它未列明的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，以及不会在实质上影响要求保护的发明的基本的和新颖的(多种)特性和/或功能的那些的存在。[0190]本文所用的术语“或其组合”是指在术语前所列出的项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下中的至少一种：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果在特定上下文中顺序是重要的，则还包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复，如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等的组合。技术人员将理解，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非另外从上下文中显而易见。[0191]如本文所用的，诸如但不限于“约”、“基本的(substantial)”或“基本上(substantially)”的近似词语是指当如此修饰时被理解为不一定是绝对的或完美的，但将被认为对于本领域普通技术人员而言足够接近以保证将情况指定为存在。描述可以改变的程度将取决于可以进行多大的改变，并且使本领域普通技术人员仍将修改的特征识别为仍具有未修改的特征所需的特性和能力。通常，但受制于前述讨论，本文中由诸如“约”的近似词语修饰的数值可以由所述值变化至少±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％或15％。[0192]根据本公开内容，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在没有过度实验的情况下制备和实施。虽然本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及在方法的步骤中或在方法的步骤的顺序中施加变化。对于本领域技术人员显而易见的所有这样的类似替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的发明的精神、范围和构思内。[0193]为了帮助专利局和基于本技术授予的任何专利的任何读者解释本文所附的权利要求，申请人希望注意到，除非在特定权利要求中明确地使用词语“用于……的手段”或“用于……的步骤”，否则他们不打算因为在本文件提交之日335u.s.c.§112的第6段、u.s.c.§112的第(f)段或等同规定存在，所附权利要求中的任一项就对其援引。[0194]对于权利要求中的每一项，每个从属权利要求可以从属于独立权利要求和从属于每一权利要求的在先从属权利中的每一项，只要在先权利要求为权利要求的术语或要素提供了适当的在先基础。当前第1页12当前第1页12
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