用于无佐剂诱导免疫应答的IgG变体

用于无佐剂诱导免疫应答的igg变体
1.相关申请
2.本技术要求于2020年2月21日提交的题为“用于无佐剂诱导中和免疫应答的igg变体”的美国临时专利申请62/980,012的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
3.以电子方式提交的材料通过引用并入
4.通过引用将其全部并入本文中的是与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其标识如下：一个名为“seqlist”的416,572字节ascii(文本)文件，创建于2021年2月21日。
技术领域
5.本公开涉及无佐剂诱导有效免疫应答的免疫球蛋白变体和用于在植物中产生此类变体的载体。


背景技术：

6.由重组蛋白抗原组成的亚单位疫苗由于其安全性、易于生产和引发针对期望表位的靶向免疫应答的能力而非常有前景。然而当递送它们自身时，这些抗原通常无法生成强大而持久的免疫应答，使得需要采取增强其免疫原性的策略。因此，重组蛋白抗原已成为治疗用途的候选物。与免疫球蛋白fc结构域的蛋白质融合已显示出作为治疗候选物的巨大潜力。感兴趣的蛋白质与fc融合可以增强融合伴侣的溶解度和稳定性，同时还允许通过蛋白质a/g亲和层析进行简单且经济高效的纯化。此外，通过与体内的新生儿fc受体(fcrn)相互作用，fc融合体可以避免溶酶体降解，从而延长fc融合体的血清半衰期。
7.fc融合体的大部分工作集中在提高其治疗潜力上，而很少有研究探讨fc融合体作为增强抗原免疫原性的策略。含有fcγ受体和补体受体c1q的抗原呈递细胞可以摄取和处理结合igg的抗原。然而，这些相互作用需要高亲和力结合以激活，因此单价fc-抗原融合体不能有效地利用这些途径。另一方面，具有多价fc结构域的较大抗原-抗体免疫复合物可以交联fc受体并有效结合c1q，导致大大改善通过树突状细胞摄取和呈递、以及改善t细胞的活化。通过将抗体与抗原混合而生成的免疫复合物通常产生不一致的结果：免疫应答可能偏向有利的抗原位点，但整体免疫原性可能没有显著提高。
8.相比之下，重组免疫复合物(ric)已用于生产针对破伤风梭菌(clostridium tetani)、埃博拉病毒、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、登革热病毒和人乳头瘤病毒的候选疫苗。ric是一种与其同源抗原基因融合的igg，它允许形成较大的高免疫原性抗原-抗体簇，模拟天然感染期间发现的那些抗原-抗体簇。


技术实现要素：

9.本公开涉及作为免疫球蛋白变体的重组蛋白，例如免疫球蛋白g(igg)变体，及其生产和使用方法。在一些方面，igg变体基于6d8抗体。在重组蛋白中的抗体部分是6d8抗体的某些实施方案中，包含抗体的ch2结构域和ch3结构域的fc融合体包含置换突变e345r、
e430g和s440y。
10.在一些实施方案中，重组蛋白包含抗原单元、包含igg的ch2结构域和ch3结构域的fc融合体单元、igg的可变重链(vh)结构域单元、igg的ch1结构域单元；和igg的轻链可变(vl)结构域单元。抗原单元不是igg的表位，它在n-末端与igg的vh结构域单元连接或在c-末端与igg的ch3结构域连接。igg的ch1结构域单元与igg的ch2结构域连接，而igg的vl结构域单元与igg的vh结构域单元和igg的ch1结构域融合。在一些实施方案方案中，重组蛋白进一步包含表位标签单元，其中表位标签是igg的表位。
11.在一些方面，重组蛋白包含两个抗原单元、两个fc融合体单元、两个igg的ch1结构域单元、两个igg的vh结构域单元和两个igg的vl结构域单元。在igg的ch2结构域和ch1结构域的连接处形成的二硫键连接两个fc融合体单元。在一些方面，每个igg的vl结构域单元与igg的vh结构域单元和igg的ch1结构域连接。在特定实施方案中，重组蛋白不包含igg的任何轻链恒定(cl)结构域。在重组蛋白的一些实施方案中，重组蛋白包含两个抗原单元、两个fc融合体单元、两个igg的ch1结构域单元、两个igg的vh结构域单元和两个igg的轻链可变(vl)结构域单元，重组蛋白进一步包含两个表位标签单元，其中表位标签是igg的表位。在一些实施方案中，两个表位标签单元在igg的ch3结构域的c-末端与两个fc融合体单元连接，而两个抗原单元与两个igg的vh结构域单元连接。在其他实施方案中，两个表位标签单元与两个抗原单元连接，而两个抗原单元与igg的ch3结构域的c-末端处的两个fc融合体单元连接。在具体的实施方案中，抗体是6d8抗体，表位标签包含肽序列ykldis(seq id no.1)。
12.在其他实施方案中，重组蛋白包含抗原单元、包含igg的ch2结构域和ch3结构域的fc融合体单元、igg的vh结构域单元、igg的ch1结构域单元、igg的vl结构域单元；和igg的cl结构域单元。在此类实施方案中，igg是6d8抗体，fc融合体包含置换突变e345r、e430g和s440y。抗原单元不是6d8抗体的表位，它在c-末端与igg的ch3结构域连接。igg的vl结构域单元与igg的cl结构域单元连接，igg的cl结构域单元与igg的ch1结构域单元连接。然后将igg的ch1结构域单元与igg的ch2结构域连接。在一些方面，重组蛋白进一步包含用于6d8抗体的表位标签，例如包含肽序列ykldis(seq id no.1)。
13.在一些方面，重组蛋白中的表位标签包含序列vykldisea(seq id no.2)。在其他方面，表位标签由序列ykldis(seq id no.1)组成。
14.在重组蛋白的另外其它实施方案中，igg变体包含两个抗原单元、两个fc融合体单元、两个igg的vh结构域单元和两个igg的ch1结构域单元。抗原不是igg的表位，两个抗原单元在n-末端与两个igg的vh结构域单元连接。两个igg的ch1结构域单元与两个fc融合体单元在igg的ch2结构域处连接。在一些方面，重组蛋白不包含igg的cl结构域并且不包含igg的vl结构域。
15.在某些实施方案中，重组蛋白的抗原来自寨卡病毒，例如，抗原单元包含登录号amc13911.1的k301-t406。在其他实施方案中，重组蛋白的抗原来自诺如病毒，例如，抗原单元包含来自诺如病毒主要衣壳蛋白的至少一部分和/或来自诺如病毒非结构蛋白1(ns1)的至少一部分。在一些实施方案中，抗原单元包含来自诺如病毒主要衣壳蛋白的突出结构域(protruding domain)、诺如病毒主要衣壳蛋白的壳结构域(shell domain)或来自诺如病毒ns1的至少一个5至500个残基长的部分。在一些方面，重组蛋白的抗原可以包含多种抗原
肽。例如，在一些实施方案中，抗原单元包含来自多个诺如病毒毒株或物种(例如来自人诺如病毒gi.3、人诺如病毒gii.4和鼠诺如病毒(mnv))的主要衣壳蛋白的至少一部分或ns1的至少一部分。在一些实施方案中，抗原单元包含至少一个在seq id no.34-72中列出的序列。
16.本文所述的生产方法包括在植物中表达重组蛋白。换言之，重组蛋白是在转基因植物中产生的。在某些实施方案中，重组蛋白在木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶被沉默的转基因植物中表达。在一些方面，生产本文所述的重组蛋白的方法包括将选自以下的载体引入农杆菌：pbyr11em-h6d8ze3、pbyr11ema-baze3-hgp371、pbyr11ema-baze3-h、pbykemd-hze3、pbykemd-ze3h、pbykemd-ze3hx、pbykemd-hvlze、pbykemd2-hvl-hx、pbykemd2-hvlznt、pbykemd2-zhvlnt、pbykemd2-zhvle、pbykemd2-zhvlhx、pbykeam-n12mhd、pbykeam-nphd、pbykeam-nshd、pbykeam-nthd、pbykehm-cphd、pbykehm-cshd、和pbykehm-cthd，并用含有所述载体的农杆菌渗入植物部分以产生转化的植物部分。然后从转化的植物中提取粗蛋白，然后纯化得到重组蛋白。对于其中引入农杆菌的载体选自pbyr11em-h6d8ze3、pbyr11ema-baze3-hgp371、pbyr11ema-baze3-h、和pbykemd-hze3的生产方法，所述方法进一步包括用含有pbykemd-6d8k的农杆菌与含有所述载体的农杆菌共渗入。
17.本文所述的使用方法包括在受试者中诱导针对重组蛋白中的抗原的免疫应答的方法。所述方法包括将所述重组蛋白施用于受试者。在某些实施方案中，所述方法在受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答。在此类实施方案中，重组蛋白包含具有包含登录号amc13911.1的k301-t406的氨基酸序列的抗原。在其他实施方案中，所述方法在受试者中诱导针对诺如病毒(包括人诺如病毒和mnv)的免疫应答。在此类实施方案中，重组蛋白包含来自诺如病毒vp1的抗原，例如来自其突出结构域或壳结构域、或来自诺如病毒ns1的抗原。
18.在一些实施方案中，向受试者施用组合物，所述组合物包含具有来自多种诺如病毒的vp1抗原的重组蛋白和具有来自多种诺如病毒的ns1抗原的重组蛋白。在另外其他实施方案中，重组蛋白在转基因植物中产生。在一些方面，转基因植物的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶被沉默。
附图说明
19.图1a-图1b根据某些实施方案描绘了igg融合构建体和其各自结合clq的能力比较。图1a是本文公开的某些igg融合构建体的示意图。如该图中所用，ze3是指包含氨基酸k301至t406的寨卡病毒包膜结构域iii；e是指具有由vykldisea(seq id no.2)组成的肽序列的表位标签，该序列是重组免疫复合物(ric)形成的6d8结合基序；带有闪电的e是指具有由ykldis(seq id no.1)组成的肽序列的表位标签，以减少ric形成；vh是指可变重结构域；vl是指可变轻结构域；h是指重链恒定ch1结构域；l是指轻链恒定结构域；fc是指重链恒定区的一部分，其由ch2和ch3结构域组成；带有闪电的fc是指与fc相同但具有e345r、e430g和s440y突变以诱导六聚体形成。图1b描绘了纯化的igg融合构建体的c1q结合elisa，其中igg融合构建体构建于mab 6d8人igg1主链上。用10μg/ml人c1q包被elisa板，并用10μg/ml的每种融合体孵育，使用非融合体的6d8抗体用作阴性对照。使用多克隆山羊抗人igg-hrp检测构建体。三个样品的平均od450值显示为
±
标准误差，如通过单因素方差分析(one-way anova)在指示的组之间进行比较所测量的，一个星号(*)表示p《0.05，三个星号(***)表示p
《0.001。
20.图2a-图2b根据某些实施方案描绘了构建于6d8抗体主链上的igg融合体的表达。图2a描绘了igg融合构建体表达的elisa和凝胶定量。通过elisa或sds-page然后通过凝胶定量，分析了来自叶斑的澄清蛋白质提取物，所述叶斑已用农杆菌渗入每种igg融合构建体。对于ze3 elisa，板用多克隆小鼠抗ze3包被，用每个igg融合体提取物的连续稀释液孵育，使用纯化的hlz作为标准品，并用山羊抗人igg-hrp探测。对于igg elisa，用提取物的连续稀释液或人igg标准品包被板，并用山羊抗人igg-hrp探测。对于凝胶定量，imagej软件用于比较在无染色聚丙烯酰胺凝胶上可视化的igg融合体条带强度，纯化的6d8用作标准品。柱代表来自三个独立渗入的叶样品的平均值
±
标准误差。图2b描绘了通过还原sds-page分离的澄清叶提取物的代表性凝胶图像。对应于各个重链/ze3融合体的条带位置表示为“zh/hz”。hlze和hlzd大小的微小变化是由于表位标签的存在。显示了rubisco的大亚基“rbcl”以及zfc和fc条带。
21.图3根据某些实施方案描绘了构建于6d8抗体主链上的igg融合体的纯化。对农杆菌渗入的叶材料进行匀浆、澄清和通过蛋白g亲和层析纯化，每个构建体的所述叶材料来自1-3株植物。合并峰洗脱液并使用无染色聚丙烯酰胺凝胶在非还原和还原sds-page上分离。显示了每个构建体的代表性泳道。
22.图4a-图4b根据某些实施方案描绘了构建于6d8抗体主链上的igg融合体的蔗糖梯度密度离心。通过蔗糖梯度离心，使用5/10/15/20/25％不连续蔗糖层分离纯化的igg融合体。通过sds-page分析梯度级分，并显示了代表性结果。使用imagej软件定量相对条带强度，并任意指定峰条带的值为1。
23.图5a-图5b根据某些实施方案描绘了纯化的构建于6d8抗体主链上的igg融合体的稳定性和c1q结合。纯化的igg融合体样品在纯化后冷冻和解冻一次(初始)，或另外进行5次冷冻/解冻循环、或在4℃孵育2周、或在室温孵育2周。图5a显示了每种处理的完全组装产品的相对比例(使用imagej软件分析)。处理后，在还原和非还原sds-page凝胶上分离样品。图5b显示了每种处理后igg构建体的clq结合elisa结果。柱代表来自三个样品的平均od
450
值
±
标准误差。
24.图6a-图6b根据某些实施方案描绘了用igg融合体免疫小鼠的结果和血清滴度。皮下免疫balb/c小鼠(每组6只)两次，间隔两周，给药剂量为每种igg融合体将递送8μg ze3，或以pbs作为对照。在最终给药后两周收集小鼠血清样品。对于图6a，通过elisa分析连续稀释的小鼠血清的总igg产生。终点取为给出的od450读数至少为背景两倍的最大稀释度的倒数。通过方差分析将指示的列与ze3比较，三个星号(***)表示p《0.01。对于图6b，将小鼠血清样品1:100稀释并通过elisa分析igg2a的产生。通过方差分析将指示的列与hlz比较，(**)表示p《0.05，(***)表示p《0.01。
25.图7根据某些实施方案描绘了单链抗体(hvl)和hvl相关构建体。所示单链抗体含有与可变轻链区连接的6d8抗体重链可变区，所述可变轻链区直接融合到6d8抗体重链上。如该图中所用，ze3是指含有氨基酸k301至t406的寨卡病毒包膜结构域iii；e是指具有由vykldisea(seq id no.2)组成的肽序列的表位标签，该序列是用于ric形成的6d8结合基序；vh是指来自6d8抗体的可变重结构域；vl是指来自6d8抗体的可变轻结构域；h是指来自6d8抗体的重链恒定区ch1结构域；fc是指由来自6d8抗体的ch2和ch3结构域组成的重链恒
定区；带有闪电的fc是指与fc相同但具有e345r、e430g和s440y突变以诱导六聚体形成。
26.图8根据某些实施方案描绘了hvl和hvl-融合构建体的纯化和蛋白质印迹分析。在蛋白g纯化hvl、hvlze和zhvlhx构建体后，在4-15％聚丙烯酰胺无染色凝胶上分离来自峰洗脱的样品。通过蛋白质印迹进行hvlhx和hvlznt构建体的分析，所述蛋白质印迹含有已通过离心澄清的小规模叶样品。将样品在4-15％聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到pvdf膜上，并用hrp标记的山羊抗人igg抗体检测。
27.图9根据某些实施方案描绘了野生型和糖工程化(glycoengineered)植物产生的igg融合构建体的c1q结合比较。用10μg/ml人c1q包被elisa板，并用5μg/ml的每种纯化构建体孵育。使用多克隆山羊抗人igg-hrp检测构建体。三个重复的平均od450值显示为
±
标准误差，如通过单因素方差分析在指示的组之间进行比较所测量的，两个星号表示p《0.01。如该图中所用，wt是指在野生型本氏烟草(nicotiana benthamiana)植物中制造的构建体，而gngn是指在木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶被沉默的糖工程化植物中制造的构建体。
28.图10根据某些实施方案描绘了构建于6d8抗体主链上的igg融合体之间的clq结合比较。用10μg/ml人c1q包被elisa板，并用从50μg/ml开始的每种纯化构建体的10倍连续稀释液孵育。使用多克隆山羊抗人igg-hrp检测构建体。显示了三次重复的平均od450值。如该图中所用，wt是指在野生型本氏烟草植物中制造的构建体；gngn是指在木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶被沉默的糖工程化植物中制造的构建体；ag是指用6d8表位标签化的登革热共有登革热e蛋白结构域iii(ce)；zhl是指与hl相同但ze3与6d8重链的n-末端融合。
29.图11根据某些实施方案描绘了将构建于6d8抗体主链(hvl)上的单链抗体的表位结合与野生型6d8抗体的表位结合进行比较。用900ng纯化的表位标签化蛋白包被elisa板，用连续稀释的hvl(可变重链与融合到6d8重链的可变轻链区连接的单链抗体)或全长6d8抗体孵育板。
30.图12根据某些实施方案描绘了显示ric不溶性的代表性sds-page。从用指定构建体农杆菌渗入的本氏烟草的叶中提取蛋白质，并在非还原条件下通过sds-page分离然后进行蛋白质印迹。使用山羊抗人igg-hrp检测构建体。可溶(s)是指经澄清的叶粗提物，而不溶(is)是指澄清后的沉淀物，其重悬浮于sds样品缓冲液中。
31.图13a-图13c根据某些实施方案描绘了对6d8表位标签突变体的溶解度和结合的研究。对于图13a-图13b，从用指定构建体农杆菌浸润的本氏烟草的叶子中提取蛋白质，并在非还原条件下通过sds-page分离，然后使用山羊抗人igg-hrp作为探针进行蛋白质印迹。可溶是指经澄清的叶粗提物，而不溶是指澄清后的沉淀物，其重悬浮于sds样品缓冲液中。命名为“a”的表位突变体具有由vykldisea(seq id no.2)组成的肽序列。命名为“b”的表位突变体具有由vykldise(seq id no.3)组成的肽序列。命名为“c”的表位突变体具有由ykldise(seq id no.4)组成的肽序列。命名为“d”的表位突变体具有由ykldis(seq id no.1)组成的肽序列。对于图13c，用全尺寸6d8随后用山羊抗人κ-hrp探测用纯化重链的连续稀释液包被的elisa板，所述连续稀释液含有指定的表位标签突变体。平均od450值显示为三次重复
±
标准误差。
32.图14a和14b分别根据某些实施方案描绘了靶向诺如病毒(nov)的重组免疫复合物(ric)构建体的示意图和纯化的ric构建体的sds-page。在图14b中，靶向vp1突出结构域的保守表位的ric构建体标记为p-ric(抗原单元包含串联连接的序列seq id no.34-42)；vp1
壳结构域，标记为s-ric(抗原单元包含串联连接的序列seq id no.45-53)；t细胞表位，标记为t-ric(抗原单元包含串联连接的序列seq id no.58-72)；并且含有抗原单元，其包含来自人诺如病毒gi.3、人诺如病毒gii.4和鼠诺如病毒(mnv)的非结构蛋白1(ns1)的表位，标记为n-ric(抗原单元包含串联连接的序列seq id no.55-57)。将ric纯化，在还原条件下通过sds-page分离，并在uv下通过无染色2,2,2-三氯乙醇(tce)成像可视化。“ 抑制剂”是指加入植物蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)以减少n-ric的降解。
33.图15根据某些实施方案描绘了靶向诺如病毒的纯化ric构建体的sds-page(左)和蛋白质印迹(右)。纯化的ric在非还原(nr)或还原(r)条件下通过sds-page分离，并在uv下通过无染色2,2,2-三氯乙醇(tce)成像可视化(左)。用抗鼠诺如病毒1(mnv)ns1/2抗体或抗mnv衣壳抗体进行蛋白质印迹。p，p-ric；s，s-ric；t，t-ric；n-ric。
34.图16根据某些实施方案描绘了与鼠诺如病毒结合的血清。用3剂通过ric构建体递送的2μg总抗原、或人诺如病毒gi.i(诺瓦克病毒)/人诺如病毒gii.4(minerva病毒)混合的vlp(标记为“vlp”)免疫小鼠，通过elisa测试来自所述小鼠的血清与鼠诺如病毒1(mnv-1)病毒的结合。聚苯乙烯96孔板用兔抗mnv衣壳包被，用5％pbstm封闭，然后用感染mnv-1的raw267.4细胞的裂解物孵育。孵育后，将小鼠血清的连续稀释液加入板，然后用山羊抗小鼠igg-hrp偶联物检测。显示了含有两个技术重复的合并小鼠血清的平均od
450
值
±
标准误差。缩写：p-ric：用p-ric免疫的小鼠的血清；s-ric：用s-ric免疫的小鼠的血清；t-ric：用t-ric免疫的小鼠的血清；n-ric：用n-ric免疫的小鼠的血清；pstn-ric：用p-ric、s-ric、t-ric和n-ric(但剂量为单个实验所用剂量的四分之一)免疫的小鼠的血清。
35.图17根据某些实施方案描述了血清与gi.i vlp结合。用3剂通过ric构建体递送的2μg总抗原免疫小鼠，通过elisa测试所述小鼠的血清与gi.i诺如病毒vlp的结合。聚苯乙烯96孔板用植物制造的诺瓦克病毒vlp孵育，封闭，然后用小鼠血清的系列稀释液孵育。用山羊抗小鼠igg-hrp偶联物检测结合的抗体。显示了含有两个技术重复的六个样品的平均od
450
值
±
标准误差。缩写：p-ric：用p-ric免疫的小鼠的血清；s-ric：用s-ric免疫的小鼠的血清；t-ric：用t-ric免疫的小鼠的血清；n-ric：用n-ric免疫的小鼠的血清；pstn-ric：用p-ric、s-ric、t-ric和n-ric(但剂量为单个实验所用剂量的四分之一)免疫的小鼠的血清。
36.图18根据某些实施方案描绘了与人诺如病毒gii.2vlp结合的血清。用3剂通过ric构建体递送的2μg总抗原免疫小鼠，通过elisa测试所述小鼠的血清与人诺如病毒gii.2(雪山病毒)vlp的结合。聚苯乙烯96孔板用植物制造的gii.2vlp孵育，封闭，然后用小鼠血清的系列稀释液孵育。用山羊抗小鼠igg-hrp偶联物检测结合的抗体。显示了含有两个技术重复的合并血清样品的平均od
450
值
±
标准误差。缩写：p-ric：用p-ric免疫的小鼠的血清；s-ric：用s-ric免疫的小鼠的血清；t-ric：用t-ric免疫的小鼠的血清；n-ric：用n-ric免疫的小鼠的血清；pstn-ric：用p-ric、s-ric、t-ric和n-ric(但剂量为单个实验所用剂量的四分之一)免疫的小鼠的血清。
37.图19根据某些实施方案描绘了用靶向诺如病毒的vlp或ric构建体免疫的小鼠产生ifn-γ。从免疫的小鼠中收获脾细胞并用其相应抗原刺激72小时。收集来自受刺激和未受刺激的脾细胞的上清液，通过elisa测定ifn-γ的产生。聚苯乙烯96孔板用连续稀释的脾细胞上清液或重组小鼠ifn-γ标准品包被，用5％pbstm封闭，然后用大鼠抗小鼠ifn-γ和山羊抗大鼠igg辣根过氧化物酶偶联物进行探测。od
450
值用于构建标准曲线，并显示了六个
样品的平均ifn-γ产生
±
标准误差，每个样品含有两个技术重复。缩写：p-ric：用p-ric免疫的小鼠的血清；s-ric：用s-ric免疫的小鼠的血清；t-ric：用t-ric免疫的小鼠的血清；n-ric：用n-ric免疫的小鼠的血清；pstn-ric：用p-ric、s-ric、t-ric和n-ric(但剂量为单个实验所用剂量的四分之一)免疫的小鼠的血清。
38.图20-图39描绘了pbyr11em-h6d8ze3、pbyr11ema-baze3-hgp371、pbyr11ema-baze3-h、pbykemd-hze3、pbykemd-ze3h、pbykemd-ze3hx、pbykemd-hvlze、pbykemd2-hvl-hx、pbykemd2-hvlznt、pbykemd2-zhvlnt、pbykemd2-zhvle、pbykemd2-zhvlhx、pbykemd-6d8k、pbykeam-n12mhd、pbykeam-nphd、pbykeam-nshd、pbykeam-nthd、pbykehm-cphd、pbykehm-cshd、和pbykehm-cthd的图谱。
具体实施方式
39.本公开的详细方面和应用在以下附图和具体实施方案中描述。除非特别指出，否则旨在对说明书和权利要求书中的词语和短语赋予对于适用领域的普通技术人员而言简单、普通和习惯的含义。
40.在以下描述中，并且出于解释的目的，阐述了许多具体细节以便提供对本公开的各个方面的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本文公开的技术的实施方案。应当注意的是，有许多不同的和可选的配置、设备和技术可以应用所公开的技术。本文公开的技术的全部范围不限于以下描述的实施例。
41.单数形式“一”、“一个”和“所述
……”
包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个步骤”包括提及一个或多个此类步骤。
42.如本文所用，术语“6d8抗体”是指针对埃博拉病毒gp1蛋白的单克隆抗体(描述于wilson等人，2000中；植物优化序列描述于huang等人，2010中)。在一些实施方案中，6d8抗体的ch1结构域是指包含tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvs
43.wnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc(seq id no.5)的肽序列，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列相似性的肽序列。在一些实施方案中，6d8抗体的ch2结构域是指包含dkthtcppcpapellggpsvflfppkp
44.kdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvehnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqd
45.wlngkeykckvsnkalapiektiskakg(seq id no.6)的肽序列，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列相似性的肽序列。在一些实施方案中，6d8抗体的ch3结构域是指包含
46.qprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsff
47.lyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no.7)的肽序列。在一些实施方案中，6d8抗体的可变重链结构域是指包含genbank登录号aeb96146的肽序列，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列相似性的肽序列。在一些实施方案中，6d8抗体的可变轻链结构域是指包含genbank登录号aeb96146的肽序列，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列相似性的肽序列。在一些方面，编码轻链变体结构域的核酸在genbank登录号hq407546中列出。在一些方面，编码重链变体结构域的核酸在genbank登录号aeb96148中列出。
48.如本文所用，术语“连接”当用于描述蛋白质结构或蛋白质结构域的构型时是指两个结构域或结构部分之间的连接，优选其中除了接头之外没有其他在中间的结构域或结构部分。在一些方面，如本文所用的术语“接头”是指蛋白质结构域或结构部分之间的氨基酸序列，其中接头的唯一功能是连接所述蛋白质结构域或结构部分。例如，接头是由甘氨酸、缬氨酸和/或苏氨酸残基组成的序列。在一些实施方案中，接头是由甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸残基组成的序列。在一些方面，接头由长度为1至50个的氨基酸组成，例如由长度为3、4、6、10、12、14或16个的氨基酸组成。在某些实施方案中，接头是柔性接头。
49.如本文所用，术语“单元”是指作为更大的多组分蛋白质的功能片段的单个肽。单个肽可以是抗原性片段或蛋白质的结构域，例如免疫球蛋白的结构域。因此，如本文所用，对包含两个肽单元的重组蛋白的描述是指具有两个此类功能片段的重组蛋白(例如肽的二聚体)，这两个功能片段可以连接在一起或可以不连接在一起。
50.如本文所用，术语“免疫复合物”是指包含与其同源抗原结合的免疫球蛋白分子或其片段的复合物。如本文所用，术语“重组免疫复合物”或“ric”是指不由自然产生免疫复合物中的免疫球蛋白分子的原始物种产生的免疫复合物。例如，示例性重组免疫复合物包含在植物中合成的人免疫球蛋白。
51.本公开涉及免疫球蛋白变体。在特别优选的实施方案中，本公开涉及作为免疫球蛋白g变体的重组蛋白，在本文中也称为igg融合体。尽管与免疫球蛋白的天然结构有所不同，但所描述的重组蛋白确实具有免疫原性潜力。事实上，重组蛋白诱导的免疫应答与预期的重组蛋白中的抗原的免疫应答是同一类。本文所述的重组蛋白适用于产生针对多种病原体(例如寨卡病毒和诺如病毒)的疫苗。
52.尽管免疫球蛋白结构有变化，但fc的糖基化状态强力地控制其功能。通过调节fc的稳定性、构象和聚集，糖基化可以增强或抑制与fcγ受体、fcrn和c1q的结合。这些改变导致抗体效应子功能的重要差异，所述抗体效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞介导吞噬作用(adcp)、补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性病毒感染增强(ade)。糖工程的进步已允许在各种重组表达系统中针对性地优化fc糖基化状态。使用缺乏核心木糖和岩藻糖n-聚糖的糖工程化植物，产生了一种与fcγri、fcγriiia和c1q的结合得到改善的抗cd20抗体。与哺乳动物细胞中产生的商业抗cd20抗体相比，该抗体具有增强的adcc和cdc。类似地，已证明在糖工程化植物中产生的抗denv抗体放弃了其ade活性，因此与哺乳动物细胞产生的对应物相比，它们具有更好的功效和安全性数据。在糖工程化植物中制造的抗体治疗剂已用于治疗患有埃博拉病毒、hiv和基孔肯雅(chikungunya)病毒病的恒河猴和人。
53.已鉴定了fc区中赋予抗体期望的特性的突变。m252y、s254t和t256e突变的引入通过改善低ph条件下与fcrn的相互作用，在人中将抗呼吸道合胞病毒抗体的血清半衰期从20天增加到60天。h237y突变减少了铰链区的有害切割，同时提高了fcγriii结合和adcc活性。已报道了设计额外的二硫键以防止fc融合体的去折叠和聚集。s239d和i332e突变改善了cd37抗体的fcγriii结合和adcc活性。用来自igg3或骆驼抗体的较长铰链区替换igg1铰链区增加了表皮生长因子受体抗体的adcc。具有e345r、e430g和s440y突变的igg1形成了大大增强c1q结合和补体激活的六聚体。突变t437r和k248e也促进了ox40受体抗体的多聚化
并改善了效应子功能。
54.可以使用人样(human-like)糖基化适当地组装本文所述的igg变体，并在植物中以非常高的水平表达。这些构建体可以在植物中有效地制造，适当地组装，并通过蛋白g柱层析纯化。如实施例所示，纯化的重组蛋白具有很强的免疫原性。
55.如本文所述的实施例所示，优化抗体设计的各个方面(例如复合物大小)以产生所述免疫球蛋白变体，导致植物中优化的表达水平和改善的稳定性、溶解度和免疫受体结合。在将免疫球蛋白变体设计为以寨卡病毒包膜蛋白结构域iii的一部分作为抗原的某些实施方案中，通过施用免疫球蛋白变体而产生的总igg滴度是通过施用单独的抗原而产生的总igg滴度的150倍。事实上，仅施用两剂免疫球蛋白变体而没有任何佐剂，终点滴度》1:500,000。可以以超过抗体治疗剂商业可行性的估计阈值的水平产生重组蛋白。
56.重组蛋白
57.本文所述的重组蛋白是变体免疫球蛋白结构，其包含抗原单元、fc融合体单元、igg的可变重链(vh)结构域单元和igg的ch1结构域单元。fc融合体包含igg的ch2结构域和ch3结构域。与免疫球蛋白fc结构域的蛋白质融合体是非常成功的治疗剂。它们可以提高融合伴侣的溶解度和稳定性，同时还提供一种简单且经济高效的纯化方法。此外，fc融合体可以通过与体内的新生儿fc受体(fcrn)相互作用来避免溶酶体降解，从而延长fc融合体的血清半衰期。与单独的抗原相比，重组蛋白诱导针对附着在重组蛋白上的抗原的更强的免疫应答。因此，重组蛋白增加了抗原的免疫原性。
58.抗原单元不是igg的表位。在某些实施方案中，抗原单元来自与igg的表位不同的生物体。抗原单元的氨基酸序列长度介于5和500个残基之间。在某些实施方案中，抗原单元的长度介于5和400个残基之间。例如，抗原单元的长度介于5和300个残基之间、介于5和250个残基之间、介于5和200个残基之间、介于5和100个之间、介于9和300个残基之间、介于9和250个残基之间、介于9和200个残基之间、介于9和100个残基之间、介于10和300个残基之间、介于10和250个残基之间、介于10和200个残基之间、介于10和100个残基之间、介于20和300个残基之间、介于20和250个残基之间、介于20和200个残基之间、介于20和100个残基之间、介于30和300个残基之间、介于30和250个残基之间、介于30和200个残基之间、介于30和100个残基之间、介于50和300个残基之间、介于50和250个残基之间、介于50和200个残基之间、或介于50和100个残基之间。在一些方面，抗原单元包含串联连接的表位。
59.在一些方面，串联连接的表位包含不同的表位，其可能来自或可能不来自相同或相似的抗原蛋白。例如，靶向多种诺如病毒的重组蛋白可以包含来自多种诺如病毒的相同靶标抗原上的表位(见图15-图19中研究的重组免疫复合物)以解决诺如病毒多样性基因型的问题。因此，串联连接的表位可以包含来自相同抗原蛋白的表位。在其他方面，串联连接的表位是单个表位的重复。
60.抗原单元在n-末端与igg的vh结构域单元连接或在c-末端与igg的ch3结构域连接。igg的ch1结构域单元与igg的ch2结构域连接。在一些方面，抗原单元、fc融合体单元、igg的vh结构域单元、和igg的ch1结构域单元形成重组蛋白的一半。例如，重组蛋白在产生时自组装，其中在ch2结构域和ch1结构域的连接处形成二硫键以连接两个fc融合体单元(见图1a和图7)。因此在一些实施方案中，重组蛋白包含两个抗原单元、两个fc融合体单元、两个igg的vh结构域单元和两个igg的ch1结构域单元。在某些实施方案中，抗体是6d8抗体。
61.在某些实施方案中，重组蛋白包含抗原单元、包含igg的ch2结构域和ch3结构域的fc融合体单元、igg的vh结构域单元、igg的ch1结构域单元；和igg的轻链可变(vl)结构域单元。抗原单元不是igg的表位，它在n-末端与igg的vh结构域单元连接或在c-末端与igg的ch3结构域连接。igg的ch1结构域单元与igg的ch2结构域连接，而igg的vl结构域单元与igg的vh结构域单元和igg的ch1结构域融合。
62.在一些方面，重组蛋白在产生时自组装，在igg的ch2结构域和ch1结构域的连接处形成的二硫键连接两个fc融合体单元。因而，重组蛋白包含两个抗原单元、两个fc融合体单元、两个igg的ch1结构域单元、两个igg的vh结构域单元和两个igg的vl结构域单元。在一些方面，每个igg的vl结构域单元与igg的vh结构域单元和igg的ch1结构域连接。在特定实施方案中，重组蛋白不包含igg的任何轻链恒定(cl)结构域。此类实施方案的重组蛋白是单链抗体变体(见例如图7)。如图8所示，单链抗体变体可以在植物中产生并有效纯化。igg为6d8抗体的单链抗体变体也保留了其结合6d8表位的能力(图11)。
63.在重组蛋白的一些实施方案中，重组蛋白包含两个抗原单元、两个fc融合体单元、两个igg的ch1结构域单元、两个igg的vh结构域单元和两个igg的vl结构域单元，重组蛋白进一步包含两个表位标签单元，其中表位标签是igg的表位。在一些实施方案中，两个表位标签单元在igg的ch3结构域的c-末端与两个fc融合体单元连接，两个抗原单元与两个igg的vh结构域单元连接。在其他实施方案中，两个表位标签单元与两个抗原单元连接，两个抗原单元在igg的ch3结构域的c-末端处与两个fc融合体单元连接。其中抗体是6d8抗体，表位标签包含肽序列ykldis(seq id no.1)。在一些方面，表位标签包含序列vykldisea(seq id no.2)。在其他方面，表位标签由序列ykldis(seq id no.1)组成。
64.在其他实施方案中，重组蛋白包含抗原单元、包含igg的ch2结构域和ch3结构域的fc融合体单元、igg的vh结构域单元、igg的ch1结构域单元、igg的vl结构域单元；和igg的cl结构域单元。在此类实施方案中，igg是6d8抗体，fc融合体包含选自以下的至少一个置换突变：e345r、e430g、和s440y。在某些实施方案中，fc融合体包含置换突变e345r、e430g和s440y。抗原单元不是6d8抗体的表位，它在c-末端与igg的ch3结构域连接。igg的vl结构域单元与igg的cl结构域单元连接，igg的cl结构域单元与igg的ch1结构域单元连接。然后将igg的ch1结构域单元与igg的ch2结构域连接。在一些方面，重组蛋白进一步包含用于6d8抗体的表位标签，例如包含肽序列ykldis(seq id no.1)。在一些方面，重组蛋白中的表位标签包含序列vykldisea(seq id no.2)。在其他方面，表位标签由序列ykldis(seq id no.1)组成。
65.在重组蛋白的另外其它实施方案中，igg变体包含两个抗原单元、两个fc融合体单元、两个igg的vh结构域单元和两个igg的ch1结构域单元。抗原不是igg的表位，两个抗原单元在n-末端与两个igg的vh结构域单元连接。两个igg的ch1结构域单元与两个fc融合体单元在igg的ch2结构域处连接。在一些方面，重组蛋白不包含igg的cl结构域并且不包含igg的vl结构域。
66.寨卡病毒
67.寨卡病毒(zikv)是严重的全球健康威胁，缺乏安全、负担得起和有效的疫苗。除了其广泛的治疗价值外，igg融合体由于其安全性和自佐剂(self-adjuvating)性质而是有前景的候选疫苗。
68.在示例性实施方案中，将一些igg变体设计为生成针对zikv的免疫应答。因此，重组蛋白中的抗原是靶向zikv的抗原。在一些方面，抗原靶向寨卡病毒包膜结构域iii(ze3)。这些igg变体在植物中高度稳定且高度表达。因此，本文所述的重组蛋白是候选疫苗，例如针对zikv。
69.在一些方面，靶向ze3的抗原包含登录号amc13911.1的k301-t406。在其他方面，靶向ze3的抗原包含与登录号amc13911.1的k301-t406具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列相似性的肽序列。在另外其他方面，靶向ze3的抗原包含这样的序列，其是来自其他寨卡病毒毒株的genbank登录号amc13911的相应区域的功能等效形式，例如在以下genbank登录号中的ze3的相应序列：ay632535、ku321639、kj776791、kf383115、kf383116、kf383117、kf383118、kf383119、kf268948、kf268949、kf268950、eu545988、kf993678、jn860885、hq234499、ku501215、ku501216、ku501217。
70.本文描述的靶向zikv的重组蛋白在没有佐剂且仅两剂的情况下引发针对zikv的强烈免疫应答(图6a、图6b)。许多重组蛋白在植物中以高水平产生(0.5-1.5mg/g lfw)(图2)，并且在反复冻融和储存后稳定(图5)。与单独的ze3抗原相比，最好的igg融合体组产生高出100倍以上的抗体应答。这与先前的研究一致，所述先前研究表明ze3或zikv e本身具有弱免疫原性，需要佐剂和3-4剂。
71.预期形成聚合物结构的构建体对降解的抗性最强，并且具有最高的总产率。通过优化ric的分子间结合，生成了更小的复合物，其溶解度大大提高，产生1.5毫克igg融合体每克叶鲜重(mg/g lfw)，并具有等效或改善的免疫原性特性。当用于免疫小鼠时，使用无佐剂仅两剂igg融合体即可引发高滴度的寨卡病毒特异性抗体，超过单独的ze3产生的滴度20倍至150倍，并有效中和寨卡病毒。与未融合的ze3抗原相比，还发现igg融合体以与c1q结合相关的方式强烈增强igg2a的产生。这些发现证明了igg融合体作为可以在植物中有效制备的寨卡病毒自佐剂亚单位疫苗的优异潜力。
72.ze3与igg n-末端的融合增强了靶向zikv的igg融合体的c1q结合。去除igg轻链(hvl和hvl相关构建体)或fab区也增强了c1q结合。在igg fc区添加诱导六聚体的突变也增强了c1q结合。也通过添加自结合表位标签增强了c1q结合，以创建ric或在缺乏植物特异性β1,2-连接木糖和α1,3-连接岩藻糖n-聚糖的植物中产生igg融合体(例如，通过沉默木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶，见图9和图10)。与未复合的igg相比，ric构建体(hlze)和基于单链抗体变体的修饰免疫复合物(hvlze)均显著改善了c1q结合(图1、图9和图10)。免疫后的结果表明，hvlze构建体产生的抗体滴度与包含完整重链和轻链的传统ric产生的抗体滴度相似(图6a和图6b)。
73.在一些方面，ric构建体不是优选的，因为大的复合物尺寸使得在提取时其溶解性差(图2a和图10)，并且高浓度可能在储存过程中沉淀。非常大的ric也可能太大而无法从注射部位有效地引流到淋巴结，颗粒《200nm有利于该过程。已发现六聚体大小的igg是有效结合c1q的最佳底物。使6d8表位标签突变(构建体hlzd)也可以缓解ric构建体的问题。值得注意地，与ric相比，hlzd的可溶性显著更高(图13b)，具有中等密度(图4a)，显示出更高的c1q结合(图1b)，达到更高的表达水平(1.5mg/g lfw)(图2a)，并引发更高的igg2a滴度(图6a和图6b)。这些对ric候选疫苗设计的改进适用于其他抗原。
74.hvlze融合体具有比传统ric稍高的c1q结合(图1b)，并且在测试条件下具有高稳
定性(图5a)。由于与完整6d8抗体相比，这种单链构型减少了与表位标签的结合，因此hvlze形成更小的复合物(图4a中，与hlze相比，蔗糖梯度数据显示密度降低)。然而，一些非常致密的物质仍然与构建体hlzd不同。可以通过减少hvlze的表位结合来提高溶解度。
75.表1总结了重组蛋白(靶向zikv的抗原)的特征。对于表达，仅显示了完全组装产物的产量(mg/g lfw)。更多数量的“ ”符号表示该特性的平均值在统计学上显著增加(对于c1q、igg和igg2a)，或可重复观察到差异(对于密度)。对于zhx(*)，观察到低密度和高密度物质的峰。
76.表1.
77.构建体表达溶解度密度稳定性c1qiggigg2aze3n.d.n.d.n.d.n.d.n.d. hlz0.17mg/g高 中 hlze0.22mg/g低 高 hlzd1.50mg/g高 高 zh0.83mg/g高 中 zhx0.21mg/g低 *高 vhlze《0.1mg/g低 高 zfc0.57mg/g高 低
78.诺如病毒
79.人诺如病毒(hnov)感染的广泛发生造成了巨大的经济损失和疾病负担，然而没有可用的获得批准的疫苗或特定的治疗方法。hnov的巨大遗传多样性阻碍了控制这些病毒的努力，这些病毒不断进化以逃避天然免疫。大量已发表的抗体图谱和t细胞数据表明存在广泛保守的hnov b细胞和t细胞表位，至关重要地，人免疫系统可靶向这些表位。因此，将有可能设计重组蛋白，用于引发针对广泛保守的hnov抗原靶标的免疫应答的目的。
80.在示例性实施方案中，设计igg变体以生成针对诺如病毒(nov)的免疫应答。在一些方面，重组蛋白的抗原包含来自多种诺如病毒的表位，例如来自人诺如病毒gi.3、人诺如病毒gii.4、和/或鼠诺如病毒(mnv)。靶向诺如病毒的重组蛋白中的抗原包含至少一个来自nov的主要衣壳蛋白(vp1)或nov的非结构蛋白的表位。在一些方面，抗原靶向vp1的突出结构域或壳结构域。此类重组蛋白是针对nov的候选疫苗。
81.在某些实施方案中，可以组合使用靶向nov的重组蛋白，用作疫苗组合物。如实施例和图16-图19所示，这些抗原已成功用于生产能够广泛结合、阻断和中和来自不同基因组和基因型的一组不同nov的免疫球蛋白变体。
82.在一些方面，靶向vp1的抗原包含vp1和/或ns1的5至500个残基长的部分。在一些实施方案中，抗原单元包含在seq id no.34-72中列出的至少一个序列、至少三个序列、至少六个序列、至少九个序列、至少十二个序列、或至少十五个序列。例如，靶向vpl的重组蛋白中的抗原单元包含在seq id no.34-54中列出的至少一个序列、至少两个序列、至少三个序列、至少四个序列、至少五个序列、至少六个序列、至少七个序列、至少八个序列、或至少九个序列。在具体的实施方案中，靶向vpl的突出结构域的抗原单元包含选自seq id no.34-44的至少一个序列、至少两个序列、至少三个序列、至少四个序列、至少五个序列、至少六个序列、至少七个序列、至少八个序列、或至少九个序列。在某些实施方案中，靶向诺如
病毒的重组蛋白的抗原单元包含seq id no.34-42中列出的序列。在另一个具体的实施方案中，靶向vp1壳结构域的重组蛋白的抗原单元包含选自seq id no.45-54的至少一个序列、至少两个序列、至少三个序列、至少四个序列、至少五个序列、至少六个序列、至少七个序列、至少八个序列、或至少九个序列。在一些方面，靶向诺如病毒的重组蛋白的抗原单元包含seq id no.45-53中列出的序列。在又一个具体的实施方案中，靶向ns1的重组蛋白的抗原单元包含选自seq id no.55-57的至少一个序列或至少两个序列。在一些方面，靶向诺如病毒的重组蛋白的抗原单元包含seq id no.55-57中列出的序列。在另一个具体的实施方案中，设计用于生成t细胞介导的免疫应答的重组蛋白的抗原单元包含选自seq id no.58-72的至少一个序列、至少两个序列、至少三个序列、至少四个序列、至少五个序列、至少六个序列、至少七个序列、至少八个序列、或至少九个序列，例如，抗原单元的肽序列包含seq id no.58-72的序列。
83.生产方法
84.与哺乳动物细胞系统相比，植物重组表达系统具有固有的安全性、高可扩展性和低生产成本，使其特别适合制造igg融合体疫苗。虽然先前的工作已表明一些igg融合体疫苗可以增强抗原免疫原性，但尚未直接比较已开发的许多融合策略，使得难以确定创建最佳候选疫苗所涉及的关键特性。
85.本文所述的生产方法包括在转基因植物中表达重组蛋白。在某些实施方案中，重组蛋白在木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶被沉默的转基因植物中表达。在一些方面，例如重组蛋白是ric，优选使用木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶被沉默的植物来产生蛋白质。所述方法包括将双元载体引入农杆菌，所述双元载体表达抗原单元、fc融合体单元、igg的vh结构域单元；和igg的ch1结构域单元。因此，该双元载体编码igg的重链结构域。接着，用含有双元载体的农杆菌渗入植物部分以产生转化的植物部分。提取植物部分的粗蛋白，然后纯化得到重组蛋白。在一些方面，使用本领域公认的方法(例如蛋白g亲和层析或金属亲和层析)纯化重组蛋白。
86.当重组蛋白包含igg的vl结构域单元和igg的cl结构域单元时，该方法进一步包括将不同的双元载体引入农杆菌中，所述不同的双元载体编码igg的轻链结构域，即igg的vl结构域单元和igg的cl结构域单元。植物部分的转化包括用含有编码igg重链结构域的双元载体的农杆菌和含有编码igg轻链结构域的双元载体的农杆菌共渗入植物部分。
87.在具体的实施方案中，生产本文所述的重组蛋白的方法包括将选自以下的载体引入农杆菌：pbyr11em-h6d8ze3、pbyr11ema-baze3-hgp371、pbyr11ema-baze3-h、pbykemd-hze3、pbykemd-ze3h、pbykemd-ze3hx、pbykemd-hvlze、pbykemd2-hvl-hx、pbykemd2-hvlznt、pbykemd2-zhvlnt、pbykemd2-zhvle、pbykemd2-zhvlhx、pbykeam-n12mhd、pbykeam-nphd、pbykeam-nshd、pbykeam-nthd、pbykehm-cphd、pbykehm-cshd、和pbykehm-cthd，并用含有所述载体的农杆菌渗入植物部分以产生转化的植物部分。然后从转化的植物中提取粗蛋白，然后纯化重组蛋白。对于其中引入农杆菌的载体选自pbyr11em-h6d8ze3、pbyr11ema-baze3-hgp371、pbyr11ema-baze3-h、和pbykemd-hze3的生产方法，所述方法进一步包括用含有pbykemd-6d8k的农杆菌与含有所述载体的农杆菌共渗入。
88.根据某些实施方案的说明性、非限制性实施例
89.通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应被解释为限制性的。本技术
全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图，出于所有目的通过引用整体并入本文。
90.a.具有zikv包膜结构域iii的igg融合体的设计和c1q结合
91.ze3是有前景的候选亚单位疫苗，但它本身没有强烈的免疫原性，使得需要有佐剂的高抗原剂量和重复免疫。基于与ze3融合的人源化埃博拉病毒单克隆抗体6d8设计了一组人igg1变体(图1a)。通过柔性接头将ze3与6d8重链的c-末端融合，创建了ric构建体。用6d8表位结合位点标签化ze3以允许形成免疫复合物。该构建体称为“hlze”，因为它含有重链、轻链、c-末端ze3融合体和表位标签。作为免疫复合物形成的对照，创建了一个没有表位标签、其他均相同的构建体(构建体“hlz”)，因此预期不会形成免疫复合物。首先，研究了igg变体的c1q结合。为了改善免疫受体结合，在糖工程化的本氏烟草中表达所有构建体。与在野生型植物中表达的构建体相比，在糖工程化植物中制造的6d8抗体或ric显示出高度改善的c1q结合(图9)。由于密集簇集的抗原-抗体复合物而认为ric以高亲合力与c1q结合，并且正如预期的那样，与hlz相比，hlze显示出大大改善的c1q结合(p《0.001)(图1b)。与hl相比，也注意到hlz的c1q结合小幅增加，这可能表明构建体的低水平聚集(p《0.05)(图1b)。
92.据报道，除非同源抗原与抗体结合，否则抗体fab臂可以通过抑制c1q结合在补体激活中发挥调节作用。与这些数据一致，加入携带6d8表位标签的可溶性抗原改善了c1q结合(图10，比较hl与hl ag)，并且通过去除6d8轻链或有趣地通过抗原与6d8重链n-末端融合，大大增强了c1q结合(图10，比较hl、h和zhl)。因此，在没有轻链的情况下，创建了ze3与6d8的n-末端融合的构建体(构建体“zh”)，并发现其有效结合c1q(图1b)。为了进一步改善与c1q的相互作用，创建了除了将e345r、e430g和s440y突变引入6d8 fc区之外与zh相同的构建体，其有利于形成六聚体。与zh相比，该构建体(zhx)进一步改善了c1q结合(p《0.001)(图1b)。有趣地，虽然已显示igg1-fc融合体具有可变的c1q结合，但与6d8 fc融合的ze3(构建体“zfc”)显示出非常强烈的c1q结合(图1b)。为了构建也缺乏轻链恒定区的简化ric，首先制造构建体，使得6d8的可变轻链(vl)结构域插入6d8的可变重链(vh)结构域和ch1结构域之间，产生构建体hvl。发现该构建体与6d8表位标签化的抗原结合，尽管与未改变的6d8相比水平有所降低(图11)。将该构型插入hlze以创建单链ric hvlze，其显示出有效c1q结合(图1b)。
93.注意到有趣的是，理论上为单体的构建体hlz(由与6d8的c-末端融合的ze3组成，没有任何表位标签)在c1q结合方面产生了小的但可重复的改善(图1b)。这可以表明由于ze3融合导致一些低水平的聚集(图4a，比较hl和hlz)。此外，据报道，fab介导的事件影响c1q结合，因为igg fab臂的缺失诱导形成寡聚体并通过未知机制进一步增强c1q结合。hlz通常低表达，表明c-末端ze3融合体可能干扰折叠或以其他方式导致不稳定(图2a)。在纯化后通过sds-page可见许多降解产物(图3)，有趣的是，通过在rt孵育2周或重复冻融循环进一步降解时，hlz的c1q结合继续增加(图5b)。这些数据表明降解产物可能比原始构建体具有更高的免疫原性，这一发现可以解释hlz产生的相对较高的总igg滴度(图6a)。然而，与其他构建体相比，hlz igg2a滴度降低(图6b)。由于igg2a是th1应答的一般指标，hlz可能仍具有导致t细胞活化的受损效应子功能，如减少的补体激活。值得注意地，与未融合的ze3相比，所有igg融合体强烈地增强igg2a的产生(图6b)。虽然最近显示与小鼠抗体相比，人抗体对小鼠fc受体具有相似的结合亲和力，但人igg1与低亲和力小鼠fcγriii/cd16的结合降
低。还显示与同一igg融合体的单体形式相比，聚合登革热igg融合体疫苗在人腺体扁桃体组织中显示出增强的免疫原性，然而两者在表达人fcγri/cd64的小鼠中显示出等同的免疫原性。因此，需要在其他动物模型中进行进一步测试，以更全面地评估这些构建体的免疫原性。
94.抗原结合可以引起igg的构象变化，这可能改善c1q结合。将6d8与含有6d8表位的抗原混合仅产生小幅增加的c1q结合(图10)，并且与ric构建体相比，发现其免疫原性较差(数据将在别处显示)。然而，n-末端抗原融合体对c1q结合具有更显著的影响(图1b)，可能是通过强烈诱导类似于抗原结合的构象变化。一般地，与6d8 n-末端的抗原融合体大大增强对各种大和小抗原的c1q结合。此外，6d8轻链的缺失(构建体zh)也显著增强了c1q结合(图1b)。这些发现与抗体的fab部分在c1q结合中起调节作用的假设一致。此外，去除轻链也可能影响糖基化，从而影响c1q结合。构建体zhx将去除轻链和n-末端ze3融合体的效果与诱导六聚体的突变协同组合，导致更有效地增强c1q结合(图1b)和高的总igg和igg2a滴度(图6b)。尽管zhx具有强烈的免疫原性，但与zh相比，zhx的产量降低(图2a)。此外，zhx表现出在蔗糖梯度的最底部发现了一些在构建体zh中未发现的非常大的物质(图4b)，表明六聚体突变可能有助于聚集。需要进一步的工作来优化这些构建体的溶解度。
95.n-末端ze3与6d8 ch1结构域的融合体(构建体zfc)大大改善了c1q结合(图1b)，引发了非常高的抗体滴度(图6a)。fc融合体的许多特性(包括c1q结合)看来基于个体融合伴侣而不同，因此必须对每个融合体根据经验确定。有趣地，已显示一些fc融合构建体形成六聚体，这可以解释此处观察到的zfc的强烈免疫原性。尽管zfc具有强烈的免疫原性，但zfc非常不稳定：即使在sds样品缓冲液中直接提取时，也有50％的ze3在提取之前或提取过程中被切割下来(图2a、图2b)，并且在反复冻融或储存后，少于25％的全尺寸zfc分子保持完整(图5a)。与hlz不同，这种降解与c1q结合的丧失有关(图5b)，表明fc受体结合结构域受损。zfc的二硫键少于整个igg，一般地，fc融合体经常遭受不稳定性或不期望的聚集的问题。虽然zfc引发了高滴度，但要递送8μg ze3(扣除igg融合伴侣的重量)，用于免疫的纯化样品的总量必须几乎是三倍，以对ze3融合体的高度降解和导致的损失负责。尚不清楚未融合的fc以及其他可能的降解产物的这种增加的递送是否导致了高免疫原性。相比之下，更大且更高度寡聚的构建体hlze、hlzd、zhx和hvlze(图4a和4b)在提取之前和提取过程中以及储存后(图5a)都更稳定。与其在elisa中不可与抗体探针接触一致(图2a)，这些构建体的分子内和分子间结合可以保护它们免受蛋白水解或其他降解过程的影响。
96.b.hvl融合构建体的表达和表征
97.已知ric具有免疫原性；然而，它们需要共表达重链和轻链以形成完全组装的产物。可以通过创建单链抗体融合体来简化该过程。单链抗体融合体的益处是可以在单个编码序列中产生整个抗体-抗原融合体，从而消除了共表达重链和轻链的需要。此外，新构建体仍将保留重链和轻链的可变区。核心单链抗体含有与可变轻链区连接的可变重链区，所述可变轻链区直接与抗体重链融合(图7)。虽然先前已表征和发表了在本氏烟草植物中表达的类似构建体，但很少有工作探索其中核心单链抗体与感兴趣的抗原融合的单链抗体融合体的潜力。创建并测试了数个单链抗体融合体(图7)。纯化构建体的结果可以在植物中表达，并在非还原条件下在sds-page凝胶上跑胶时显示为正确的大小。
98.c.igg融合构建体的表达
99.ric遭受可溶性产物产率低的问题。在6d8的c-末端添加6d8表位标签使得抗体几乎不溶；然而可以通过去除轻链来防止这种情况，这表明不溶性是由与表位标签结合的大抗体复合物引起的(图12)。为了提高ric溶解度，突变了6d8表位标签以减少抗体结合。将hlze上的表位标签减少到6d8的最小报道结合区(wilson等人，2000)(构建体“hla”，表位序列vykldisea，seq id no.2)显示溶解度没有改善，从3'端去除单个氨基酸(构建体“hlb”，vykldise，seq id no.3)也显示没有改善(图13a)。然而，从5'端进一步去除单个氨基酸(构建体“hlc”，ykldise，seq id no.4)和构建体“hld”中额外的截断(ykldis，seq id no.1)导致溶解度大大提高(图13b)。将该突变引入hlze(构建体hlzd)并进行表征。尽管通过elisa测定表位结合降低了大约25倍(图13c)，但hlzd仍然保持非常强烈的c1q结合(图1b)，表明保持了有效的复合物形成活性。
100.为了测量完全组装的igg融合体的产量，采用了elisa测定，首先捕获ze3，然后检测人igg。为了检测ze3的切割，还使用仅测量总igg的elisa作为比较。当探测ze3和igg时，高度可溶的单体构建体zh产生每克叶鲜重0.83mg完全形成的产物(mg/g lfw)，类似的zfc产生0.58mg/g lfw(图2a)。然而当测量总igg含量时，zh的产量大约高20％，zfc则高2.5倍，这表明zh尤其是zfc易受蛋白水解切割，可能是切割ze3接头(图2a)。通过sds-page可视化zfc切割产物而证实了这一发现(图2b)。hlz仅累积0.17mg/g lfw完全组装产物，大约40％的ze3因切割而丢失，表明构建体的总体不稳定性(图2a、图2b)。通过elisa测定，ric构建体的性能看来比单体构建体差：hlze和hlzd分别仅累积0.04mg/g lfw和0.30mg/g lfw，六聚体zhx仅累积0.08mg/g lfw(图2a)。然而，当在还原sds-page条件下可视化时，hlzd是最高表达的构建体，累积估计为1.5mg/g lfw(图2a、图2b)。这种差异可能是由于复合hlzd无法通过elisa与抗体探针接触。类似地，当通过凝胶定量测量时，hlze和zhx的总产率也更高(图2a、图2b)。尽管其溶解度低，但hlze的产率与hlz相似，hlzd大大超过hlz的产率。这一发现表明，形成复合物可以在细胞内或在提取过程中保护hlze和hlzd，尽管不能排除短的表位标签在增强hlze和hlzd稳定性方面发挥一些其他作用的可能性。通过elisa测定hvlze仅产生0.02mg/g lfw可溶产物，而通过sds-page无法检测到(图2a)；然而当用7.5m尿素提取时，它积累了非常高的水平，这表明不溶性导致了低产率。
101.d.igg融合体的纯化、聚集和稳定性
102.通过蛋白g亲和层析使用简单的一步纯化，将igg融合体纯化至》95％的同质性。与表达数据一致，更高度寡聚的构建体显示出比其他构建体更少的降解，而zfc融合体具有特别高的降解水平(图3)。为了研究每个构建体的聚集特征，通过蔗糖梯度离心分析了纯化的igg融合体。与形成大的免疫复合物一致，发现hlze和hvlze主要位于梯度的底部，而hlz、zh和zfc主要位于梯度的顶部(图4a和图4b)。zhx溶液含有低密度物质以及一些非常高密度的物质(图4b)。与hlz和hlze相比，hlzd溶液显示出中等密度(图4a)，当结合表达数据和c1q结合时，该结果与hlzd比hlze形成更小、更可溶的免疫复合物相一致。
103.通过在不同温度条件下处理后在sds-page上比较完全形成的产物和降解产物，分析了每个构建体的稳定性。在五个冻融循环或在4℃两周后，观察到所有构建体均有少量降解(图5a)。在4℃数天后，发现高浓度(》1mg/ml)的hlze和hvlze发生沉淀。在室温，大多数构建体在两周后降解了10-15％(图5a)。总体上，寡聚构建体保持最高稳定性，而单体构建体尤其是fc融合体降解更快(图5a)。大多数构建体在储存后保持强烈的c1q结合，然而在室温
储存或重复冻融循环而不是4℃储存后，构建体hlz显示出增加的c1q结合(图5b)。这可能是由于fab区的降解或轻链的丢失，因为降解产物在sds-page上可见(图3)，或是由于聚集。相反地，构建体zfc随着其降解程度升高而失去了c1q结合能力，这可能是由于c1q结合区的降解(图5b)。
104.e.小鼠免疫、滴度、igg2a、细胞因子
105.为了研究igg融合体的免疫原性，用两剂每种igg变体无佐剂皮下免疫balb/c小鼠(n＝6)，使得递送的ze3总剂量为8μg。作为对照，还用8μg未融合的植物表达的ze3免疫小鼠。所有igg融合体都非常强烈地增强了ze3特异性抗体的产生，产生的总igg滴度比单独的ze3高20倍至150倍(图6a，与ze3相比p《0.01)。与单独的ze3相比，所有igg融合体都显著增强了igg2a的产生(图6b，与ze3相比p《0.01)。虽然在igg融合体之间未观察到总滴度的产生的显著差异，但与除hlze之外的所有其他融合体相比，构建体hlz的igg2a的产生显著降低(图6b，与hlz相比p《0.05)。构建体zhx和zfc产生最高水平的总igg和igg2a(图6a、图6b)。
106.f.诺如病毒表位的igg融合体的设计、表达和纯化
107.诺如病毒(nov)衣壳蛋白vp1由内壳结构域(s)和突出结构域(p)组成，所述内壳结构域形成围绕病毒基因组的核心，所述突出结构域进一步细分为p1和p2子结构域。传统的人诺如病毒(hnov)疫苗方法以及天然感染引起的免疫反应主要靶向病毒衣壳上保守性差的免疫显性表位，导致针对新型毒株和针对不同基因型的相关病毒的保护有限。几乎所有hnov候选疫苗都专注于由vp1衣壳蛋白制造的病毒样颗粒(vlp)。基于主要衣壳蛋白vp1的序列差异，已鉴定出十个遗传组(genogroups,gi-gx)，其含有超过四十种nov基因型。在这十个遗传组中，gi和gii引起人的疾病最多。然而，即使是生成保守vlp的最佳尝试也仅在人临床试验中适度降低了疾病严重程度，并且通常难以诱导广泛的保护性免疫。
108.一种广泛反应性抗体定位(map)到在以下p1碱基处的高度保守表位：lpqewvqyfyqeaapa(seq id no.34)。至关重要地，该抗体结合p1中的线性表位，因此天然vp1构象对于引发功能性抗体不是必需的。靶向该表位的抗体以高亲和力结合来自8个gi、13个gii和1个giv基因型的vlp。针对第二广泛反应性线性表位(allrfvnpdtgrvlfe,seq id no.37)的抗体结合来自至少3个gi和7个gii遗传组的vlp。在p1结构域碱基处的第三广泛保守的线性表位是dswvnqfytlap(seq id no.41)。s结构域是vp1中最高度保守的。已鉴定了靶向强烈保守的线性表位qnvidpwirnnf(seq id no.45)、qapggeftvsprnapge(seq id no.46)和kvifaavpp(seq id no.47)的抗体对nov遗传组具有广泛的交叉反应性。在人13中鉴定了保守的hnov t细胞表位，即vp1 s结构域中的表位tmfphiivdv(seq id no.54)引发了针对gi和gii hnov的广泛t细胞激活。此外，在所有nov遗传组(包括hnov)之间高度保守的p1 c-末端结构域中的显性t细胞表位(swvsrfyql,seq id no.64)对于感染nov的小鼠的病毒清除至关重要。该区在衣壳组装中起着至关重要的作用，因此结构限制限制了突变逃逸的可能性。从ns1-2蛋白水解切割的非结构蛋白ns1由鼠nov(gv)感染或用hunov ns1-2转染的细胞分泌。分泌的ns1抑制小鼠肠道中ifn-λ的产生。重要地，单独的ns1疫苗接种比p结构域疫苗接种更好地保护小鼠，突出显示了ns1作为疫苗靶标。ns1-2疫苗接种产生针对ns1的抗体。
109.为了开发抗原以制造靶向诺如病毒的免疫球蛋白变体，已鉴定了来自人诺如病毒gi.3、人诺如病毒gii.4和鼠诺如病毒(mnv)vp1突出结构域的表位(seq id no.34-44)。还
aatcccactatccttcgc,seq id no.13)扩增突变体“a”，然后用spei-saci消化产物并将其连接到用spei-saci消化的pbyr11em-h6d8ze3中，来生成突变体“b”。与突变体“a”类似地创建突变体“c”和“d”，使用重叠寡核苷酸6d87-f(5'-ctagttacaagctggacatatctgagtaagagct,seq id no.14)和6d87-r(5
’‑
cttactcagatatgtccagcttgtaa,seq id no.15)用于“c”，和6d86-f(5
’‑
ctagttacaagctggacatatcttaagagct,seq id no.16)和6d86-r(5
’‑
cttaagatatgtccagcttgtaa,seq id no.17)。
115.为了制造其中可变重链(vh)结构域与可变轻链(vl)结构域连接、所述可变轻链结构域又直接与6d8抗体的恒定区融合的构建体，首先通过pbyr11em-h6d8ze3片段的pcr扩增和末端剪裁(end-tailoring)获得可变区。对于vh结构域，使用引物lir-h3a(5
’‑
aagcttgttgttgtgactccgag,seq id no.18)和6d8vh-spe-r(5
’‑
cggactagtagctgaagacactgtgac,seq id no.19)。通过使用引物35s-f(5
’‑
aatcccactatccttcgc,seq id no.13)和6d8vk-nhe-r(5
’‑
cgtgctagccttgatctccactttggtc,seq id no.20)pcr扩增pbyr11em-h6d8ze3来获得vl区。为了将vl区与人igg抗体的恒定区融合，通过用xhoi-nhei消化pcr片段并将其插入含有6d8重链的载体pks-hh-gp371中，创建了亚克隆。该亚克隆命名为pks-vl。接着，用sbfi-saci消化pbykem-6d8k，用sbfi-spei消化扩增了可变重链片段的pcr产物，并用spei-saci消化可变轻链亚克隆。组装这些片段以创建pbykemd2-vhlvk(hvl)。最后，该构建体用于通过两片段连接来创建pbykemd2-hvlze。用bsai和saci消化pbykemd2-vhlvk构建体以获得载体片段以及重链和轻链的可变区。为了获得ze3抗原片段和表位标签，也用bsai-saci消化pbyr11em-h6d8ze3。所得构建体命名为pbykemd-hvlze，用于生产hvlze。
116.构建体的hvl小组如下创建。通过两片段连接创建hvl-hx，其是含有单链抗体的构建体，所述单链抗体在fc区中具有三个点突变以促进形成单链六聚体。主链源自pbykemd2-vhlvk的bsai-saci消化片段，而含有用于六聚体形成的突变的插入片段源自pbykemd-ze3hx的bsai-saci消化片段。最终构建体命名为pbykemd2-hvl-hx。
117.hvlznt是在c-末端具有ze3抗原但没有表位标签的单链融合体，它是通过用bsai-saci消化来自pbykemd2-vhlvk的主链并与源自pbykemd-hze3的插入片段连接而创建的。该构建体命名为pbykemd2-hvlznt。
118.zhvlnt是单链ric，其ze3抗原与抗体n-末端连接，没有表位标签，通过以下连接创建。使用35s-f和vh-bsas-r引物，由pbyr11ema-baze3-hgp371扩增含有ze3抗原和vh片段的插入片段。在5'端对vh-bsas-r引物进行末端剪裁以包括一个bsai位点，其在用bsai消化时导致spei突出末端。用xhoi-bsai消化该pcr片段，并与由pbykemd2-vhlvk获得的主链xhoi-spei片段连接。最终构建体命名为pbykemd2-zhvlnt。
119.zhvle是具有n-末端融合的ze3抗原和表位标签的单链抗体ric，通过两片段连接创建。用bsai-saci消化pbykemd2-zhvlnt以产生含有n-末端ze3抗原和hvl构建体的载体片段。含有6d8表位标签的插入片段源自pbyr11ema-baze3-hgp371的bsai-saci消化。最终构建体命名为pbykemd2-zhvle。
120.zhvlhx是具有n-末端融合的ze3抗原和促进六聚体形成的点突变的单链抗体，通过两片段连接获得。通过pbykemd2-zhvlnt的bsai-saci消化获得载体片段，插入片段源自pbykemd2-hvl-hx的bsai-saci消化。最终构建体命名为pbykemd2-zhvlhx。
121.下面列出了本文所述的具体构建体：
122.·
pbyr11em-h6d8ze3(seq id no.21中列出的序列)
123.·
pbyr11ema-baze3-hgp371(seq id no.22中列出的序列)
124.·
pbyr11ema-baze3-h(seq id no.23中列出的序列)
125.·
pbykemd-hze3(seq id no.24中列出的序列)
126.·
pbykemd-ze3h(seq id no.25中列出的序列)
127.·
pbykemd-ze3hx(seq id no.26中列出的序列)
128.·
pbykemd-hvlze(seq id no.27中列出的序列)
129.·
pbykemd2-hvl-hx(seq id no.28中列出的序列)
130.·
pbykemd2-hvlznt(seq id no.29中列出的序列)
131.·
pbykemd2-zhvlnt(seq id no.30中列出的序列)
132.·
pbykemd2-zhvle(seq id no.31中列出的序列)
133.·
pbykemd2-zhvlhx(seq id no.32中列出的序列)
134.·
pbykemd-6d8k(seq id no.33中列出的序列)
135.2.本氏烟草叶的农杆菌渗入
136.通过电穿孔将双元载体分别引入根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)eha105中。所得菌株通过限制性消化或pcr验证，在30℃生长过夜，并用于渗入保持在23-25℃的5至6周龄本氏烟草叶。简要地，通过以5000g离心5min沉淀细菌，然后将细菌重悬于渗入缓冲液(10mm 2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph 5.5和10mm mgso4)中至od
600
＝0.2，除非另有描述。使用不带针头的注射器通过小孔将所得细菌悬浮液注射到叶中(huang和mason，2004)。为了评估糖基化的影响，采用了木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶被沉默的转基因植物。以5dpi收获植物组织。
137.3.蛋白质提取和纯化
138.根据制造商的说明，使用bullet blender机器(next advance,averill park,ny)通过用1:5(w:v)冰冷提取缓冲液(25mm tris-hcl,ph 8.0,125mm nacl,3mm edta,0.1％triton x-100,10mg/ml抗坏血酸钠,0.3mg/ml苯甲基磺酰氟)匀浆农杆菌渗入的叶样品来提取粗蛋白。在室温或4℃旋转匀浆化组织30min。通过在4℃以13000g离心15min来澄清植物粗提物，并通过sds-page或elisa分析上清液。可选地，为了评估原始匀浆中蛋白质的溶解度，将沉淀物指定为不溶部分，在100℃用sds样品缓冲液处理10min，然后上样到sds-page上。
139.通过蛋白g亲和层析纯化igg变体，包括hvlze。将农杆菌渗入的叶与1:3(w:v)冰冷提取缓冲液(25mm tris-hcl,ph 8.0,125mm nacl,3mm edta,0.1％triton x-100,10mg/ml抗坏血酸钠,0.3mg/ml苯基甲基磺酰氟)混合，在4℃搅拌30min，并过滤通过神奇滤布(miracloth)。为了沉淀内源性植物蛋白，边搅拌边用1m磷酸将ph值降至4.5，持续5min，然后用2m tris碱将ph值升至7.6。以16,000g离心20min后，按照制造商的说明将澄清的提取物上样到pierce蛋白g柱(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)上。用100mm甘氨酸(ph 2.5)将纯化的蛋白质直接洗脱到含有1m tris-hcl ph 8.0的收集管中，以中和洗脱缓冲液。以类似方式纯化hvl和zhvlhx构建体；然而，跳过酸沉淀步骤。
140.通过金属亲和层析纯化从pbye3r2k2mc-baze3表达的ze3-his。如上所述提取蛋白
质，但没有酸沉淀。根据制造商的说明，将经澄清的提取物加载到含有talon金属亲和树脂(metal affinity resin,bd clontech,mountain view,ca)的柱上。用pbs洗涤柱并用洗脱缓冲液(pbs,150mm咪唑,ph 7.4)洗脱。将峰ze3洗脱液合并，用pbs透析，并通过sds-page和蛋白质印迹分析。
141.4.sds-page和蛋白质印迹
142.将植物蛋白提取物或纯化蛋白样品与sds样品缓冲液(50mm tris-hcl,ph6.8,2％sds,10％甘油,0.02％溴酚蓝)混合，并在4-15％无染色聚丙烯酰胺凝胶(bio-rad,hercules,ca,usa)上分离。对于还原条件，加入0.5m dtt，在上样前煮沸样品10min。在紫外光下对聚丙烯酰胺凝胶进行可视化和成像，然后转移到pvdf膜上。对于igg检测，将蛋白质转移膜在4℃用pbst(含0.05％tween-20的pbs)中的5％奶粉封闭过夜，并用山羊抗人igg-hrp(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa，在1％pbstm中1:5000稀释)探测。用ecl试剂(amersham,little chalfont,united kingdom)检测结合的抗体。
143.5.c1q结合
144.在37℃用pbs中的15μg/ml人补体c1q包被96孔高结合聚苯乙烯板(corning inc,corning,ny,usa)2h。将板用pbst洗涤3次，然后用pbst中的5％奶粉封闭15分钟。用pbst洗涤3次后，以0.1mg/ml的10倍连续稀释液加入纯化的人igg(southern biotech,birmingham,al,usa)和纯化的igg-ze3融合体，并在37℃孵育1.5h。用pbst洗涤3次后，通过在37℃与1:1000多克隆山羊抗人igg-hrp(southern biotech,birmingham,al,usa)孵育1小时来检测结合的igg。将板用pbst洗涤4次，用tmb底物(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)显色，用1m hcl停止，在450nm处读取吸光度。
145.6.6d8表位结合
146.为了测试hvl与6d8表位标签结合的能力，将900ng纯化的6d8表位标签化的登革热共有包膜结构域iii与96孔高结合聚苯乙烯板(corning inc,corning,ny,usa)结合。在37℃孵育1小时后，将板用pbst洗涤三次，并用pbst中的5％奶粉封闭30分钟。然后用pbst洗涤板三次，并将纯化的hlv或全长6d8抗体的各种稀释液加入板中。将板在37℃孵育1小时，用pbst洗涤三次，并用1:2000稀释度的偶联hrp的小鼠抗人igg(仅fc)(southern biotech,birmingham,al,usa)抗体检测。然后，将板用pbst彻底清洗并用tmb底物(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)显色。在450nm处读取吸光度。
147.7.蔗糖梯度密度离心
148.将每个igg融合体的纯化样品(100μl)上样到不连续的蔗糖梯度上，所述梯度由2.0ml微量离心管中350μl pbs中的5、10、15、20和25％蔗糖的层组成，并在4℃以21000g离心16h。将级分收集并通过sds-page分析，然后在无染色凝胶(bio-rad,hercules,ca,usa)上进行可视化。使用imagej软件确定每个级分的相对条带强度，任意指定峰条带的值为1。
149.8.小鼠的免疫和样品采集
150.所有动物均按照动物福利法和亚利桑那州立大学iacuc进行处理。用纯化的igg融合变体皮下免疫6-8周龄的雌性balb/c小鼠。在所有治疗组中，抗原的总重量设定为递送等效的8μg ze3。在第0天和第14天给药。如santi等人，2008中所述，通过第0、14和28天颌下采血进行血清收集。
151.9.抗体测量
152.通过elisa测量小鼠抗体滴度。植物表达的6-his标签化的ze3以50ng/孔与96孔高结合聚苯乙烯板(corning inc,corning,ny,usa)结合，并用pbst中的5％脱脂奶粉封闭板。用pbst(含0.05％tween 20的pbs)洗涤孔后，用1％pbstm(含1％脱脂奶粉的pbst)稀释小鼠血清并孵育。通过与多克隆山羊抗小鼠igg-辣根过氧化物酶偶联物(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)孵育来检测小鼠抗体。该板用tmb底物(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)显色，用1m hcl停止，在450nm处读取吸光度。终点滴度取为最低稀释度的倒数，所述最低稀释度产生的od450读数是pbs用作样品产生的背景的两倍。从在1％pbstm中1:100稀释的血清测量igg2a抗体，并用igg2a辣根过氧化物酶偶联物(santa cruz biotechnology,dallas,tx,usa)检测。
153.通过引用方式引用和并入的参考文献
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