同时测定样品中甘氨酸酐和DL-蛋氨酸亚砜的方法与流程

同时测定样品中甘氨酸酐和dl-蛋氨酸亚砜的方法
技术领域
1.本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及一种利用hplc法测定复方甘草酸苷片中甘氨酸酐和dl-蛋氨酸亚砜的药物分析方法。


背景技术：

2.甘草酸单铵盐，化学名称：(20β)-3β-[[2-o(β-d-吡喃葡萄糖苷醛酸)-β-d-吡喃葡萄糖苷醛酸]羧基]-11-氧代齐墩果烷-12-烯-30-酸
[0003]
分子式：c
42h65
no
16
[0004]
分子量：839.96
[0005]
其结构式如下：
[0006][0007]
甘氨酸，化学名称：氨基乙酸
[0008]
分子式：c2h5no2[0009]
分子量：75.07
[0010]
其结构式如下：
[0011][0012]
dl-蛋氨酸(本文后面均以“蛋氨酸”代称)，化学名称：dl-2-氨基-4-甲硫基丁酸
[0013]
分子式：c5h
11
no2s
[0014]
其结构式如下：
[0015][0016]
复方甘草酸苷片，用于治疗慢性肝病，改善肝功能异常。其可用于治疗湿疹、皮肤炎、斑秃。组分为每片含甘草酸单铵盐(以甘草酸苷计)25mg，甘氨酸25mg，蛋氨酸25mg，其中甘草酸苷具有抗炎症作用、免疫调节作用、对实验性肝细胞损伤的抑制作用、肝细胞增殖促
进作用、抑制病毒增殖和对病毒的灭活作用；有报导称甘氨酸和蛋氨酸，可以抑制给大白鼠口服甘草酸苷所引起的尿量和钠排泄减少。
[0017]
甘氨酸自身结构中含有羧基和氨基，在药物制备及贮存过程中如遇高温，甘氨酸分子间的羧基和氨基会发生缩合成环，得到甘氨酸酐。
[0018]
蛋氨酸自身结构中含有硫醚键，易被氧化生成亚砜类化合物，即dl-蛋氨酸亚砜。杂质产生机理如下：
[0019]
甘氨酸酐：
[0020][0021]
dl-蛋氨酸亚砜：
[0022][0023]
目前，尚未有能同时检测甘氨酸和蛋氨酸降解产物的方法，为了简便检测方法，亟需开发一种合理的色谱系统，制定出简单、灵敏度高的杂质检测方法，以便能够同时检测甘氨酸和蛋氨酸降解产物，严格控制复方甘草酸苷片的质量。


技术实现要素：

[0024]
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供如下技术方案：
[0025]
一种同时测定复方甘草酸苷片中甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的方法，其包括采用hplc法对复方甘草酸苷片中的甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a进行定性检测或者定量检测。
[0026]
根据本发明的一个实施方案，hplc的检测条件包括色谱柱、200nm至230nm的检测波长、20℃至40℃的柱温、0.4ml/min至1.6ml/min的流速、10μl至80μl的进样体积、流动相a和流动相b。
[0027]
根据本发明的一个实施方案，色谱柱选自氨基酸专用柱，流动相a选自含1.4g/l辛烷磺酸钠的0.02mol/l甲酸铵溶液，流动相b选自乙腈。
[0028]
根据本发明的一个实施方案，检测波长为210nm至220nm、优选213nm至217nm、更优选215nm，柱温为25℃至35℃、更优选30℃，流速为0.5ml/min至1.5ml/min、优选0.8ml/min至1.2ml/min、更优选1.0ml/min，进样体积为40μl至80μl、优选20μl至60μl、更优选50μl。
[0029]
根据本发明的另一个实施方案，定性检测包括如下步骤：
[0030]
(1)以待测复方甘草酸苷片为供试品，以流动相a为溶剂，配制供试品溶液；然后将供试品溶液注入液相色谱仪，记录第一色谱图；
[0031]
(2)以待测复方甘草酸苷片、甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸杂质a对照品为系统适用性样品，以流动相a为溶剂，配制含甘氨酸、蛋氨酸、甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的系统适用性溶液；将系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录第二色谱图；
[0032]
(3)若步骤(1)中供试品的所述第一色谱图中出现与步骤(2)中甘氨酸杂质b对照
品和蛋氨酸杂质a对照品的保留时间一致的色谱峰，则待测样品中含有甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a。
[0033]
根据本发明的另一个实施方案，在步骤(2)的系统适用性溶液中，甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml，蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml，甘氨酸杂质b的浓度为18至22μg/ml、优选20μg/ml，蛋氨酸杂质a的浓度为45至55μg/ml、优选50μg/ml。
[0034]
根据本发明的另一个实施方案，在步骤(1)的供试品溶液中，甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml，蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml。
[0035]
根据本发明的另一个实施方案，定量检测包括如下步骤：
[0036]
(1)分别以甘氨酸的标准物质和蛋氨酸的标准物质为对照品，以流动相a为溶剂，配制含甘氨酸和蛋氨酸的对照品溶液；在配制步骤中，配制1份对照品溶液，对照品溶液中甘氨酸和蛋氨酸的浓度分别为c1和c2；将对照品溶液注入液相色谱仪，记录第三色谱图，对照品溶液中甘氨酸和蛋氨酸的峰面积分别为a1和a2；
[0037]
(2)以待测复方甘草酸苷片为供试品，以流动相a为溶剂，配制供试品溶液；将供试品溶液注入液相色谱仪，记录第四色谱图，供试品溶液中杂质的峰面积为a3；
[0038]
(3)以待测复方甘草酸苷片、甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸杂质a对照品为系统适用性样品，以流动相a为溶剂，配制含甘氨酸、蛋氨酸、甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的系统适用性溶液；将系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录第五色谱图；
[0039]
(4)按照公式(1)、公式(2)和公式(3)计算待测样品中甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的含量；
[0040][0041][0042][0043]
在公式(1)至(3)中：c1、c2分别表示对照品溶液中的甘氨酸、蛋氨酸浓度，以mg/ml计；w1、w2分别表示甘氨酸、蛋氨酸对照品的称样量，以mg计；w3表示供试品的称样量，以mg计；w
总
表示供试品的总重量，以mg计；p1、p2分别表示甘氨酸、蛋氨酸对照品的含量；b1、b2分别表示甘氨酸和蛋氨酸的规格，每片含甘氨酸25mg、蛋氨酸25mg；s1、s2分别表示甘氨酸、蛋氨酸对照品的稀释倍数；s3表示供试品的稀释倍数；a1、a2分别表示对照品溶液中的甘氨酸、蛋氨酸的峰面积；a3表示供试品溶液中的甘氨酸杂质b、蛋氨酸杂质a及其他未知杂质(例如其他未知单杂)的峰面积；d表示研细片数；f表示甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的校正因子(即算哪个杂质含量，就用相应杂质的校正因子去计算，未知杂质因为不能确定标准物质，无法得到校正因子，故不进行校正)，蛋氨酸杂质a的校正因子为0.69，甘氨酸杂质b的校正因子为1.0。
[0044]
根据本发明的另一个实施方案，在步骤(3)的系统适用性溶液中，甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml，蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml，甘氨酸杂质b的浓度
为18至22μg/ml、优选20μg/ml，蛋氨酸杂质a的浓度为45至55μg/ml、优选50μg/ml。
[0045]
根据本发明的另一个实施方案，在步骤(1)的对照品溶液中，甘氨酸对照品的浓度为0.09至0.11mg/ml，优选0.1mg/ml，蛋氨酸对照品的浓度为0.09至0.11mg/ml，优选0.1mg/ml；在步骤(2)的供试品溶液中，甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml，蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml。
[0046]
本发明提供了同时测定复方甘草酸苷片中甘氨酸酐和dl-蛋氨酸亚砜的方法，该方法利用hplc法进行测定，操作简单，灵敏度高，且具有良好的精密度及良好的准确度；该方法呈现良好的线性关系，对流速、柱温、检测波长、流动相中盐浓度及不同批号色谱柱的耐用性好，适用于同时检测复方甘草酸苷片中的甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a，并且控制复方甘草酸苷片的质量。
附图说明
[0047]
下面结合附图来说明本发明，但本发明因此而受任何限制。其中：
[0048]
图1为本发明实施例1中利用方法1进行色谱分析的色谱图；
[0049]
图2为本发明实施例1中利用方法2进行色谱分析的色谱图；
[0050]
图3为本发明实施例1中利用方法3进行色谱分析的色谱图；
[0051]
图4为本发明实施例2中系统适用性溶液的色谱图
[0052]
图5为本发明实施例4中各组分检测限的色谱图；
[0053]
图6为本发明实施例5中各组分定量限的色谱图；
[0054]
图7为本发明实施例9中9.1蛋氨酸杂质a的线性关系曲线；
[0055]
图8为本发明实施例9中9.1甘氨酸杂质b的线性关系曲线；
[0056]
图9为本发明实施例9中9.1甘氨酸和蛋氨酸加和的线性关系曲线。
具体实施方式
[0057]
为了更好地理解本发明，下面通过特定实施方案并且结合附图来详细描述本发明，但是本发明并不限于此。
[0058]
需要说明的是，本发明中提及但未解释说明和详述的科学术语和测试方法，与本领域技术人员所理解的含义和内容均是相同的。另外，本发明的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四
”……“
第n”(n表示正整数)仅用于描述的目的，而不能理解为表明相对重要性。除非另外说明，否则本发明中的份、％均基于质量，所有的设备、原料和试剂均为本领域已知和商购可得的。
[0059]
另外，需要说明的是，本发明中的数值范围均包括端值以及端值之间的任何点值。例如，数值范围1～10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；数值范围0.1～0.9包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9；数值范围0.01～0.09包括0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；数值范围0.08～0.21包括0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21。另外，本发明中的“以上”、“以下”和“以内”均包括本数，“大于/高于”、“小于/不到”和“不足”均不包括本数。
[0060]
本发明所用的术语“供试品”是指由国家药监管理部门指定的单位制备、标定和供应。本发明所用的术语“供试品溶液”是直接分析测定用的样品溶液的通称。
[0061]
本发明所用的术语“对照品”是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质。
[0062]
本发明所用的术语“贮备液”是指配制成的比使用浓度高1至3个数量级并且为储存用的浓标准溶液。
[0063]
本发明所用的术语“梯度洗脱”又称梯度淋洗或程序洗脱，在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。梯度洗脱的优点包括：缩短分析周期；提高分离能力；峰型得到改善，很少拖尾；增加灵敏度。
[0064]
本发明所用的术语“系统适用性”是指按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求。本发明所用的术语“系统适用性溶液”是指按照要求配制的溶液，用以检查系统适用性是否达到规定的要求，若能达到要求，则可继续开展实验，若不能达到要求，则应停止试验，并调查原因，直至所配制的溶液系统适用性能够达到规定的要求，方可继续试验。
[0065]
本发明所用的术语“定位溶液”是指用对照品或者标准物质配制的溶液，定位溶液中的主要色谱峰即为该物质在色谱系统中的出峰位置，用以确认供试品溶液中该物质的出峰位置。
[0066]
本发明所用的术语“加标配制”是指向供试品中加入已知量的杂质对照品进行测定，杂质加入的最终浓度应为限度浓度，即供试品中主成分的浓度与杂质的限度的乘积所得的值。
[0067]
本发明所用的术语“保留时间”是指被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用rt表示，常以分(min)为时间单位。
[0068]
本发明所用的术语“理论板数”是指在精馏塔中，假设气相与液相有充分的接触时间，足以使两相达到相平衡，而且塔板上各组分间的关系符合平衡曲线所规定的关系时所需的塔板数。
[0069]
本发明所用的术语“拖尾因子”是衡量正常色谱峰与不正常色谱峰的指标，用t表示，其定义为：t＝w
0.05h
/2d1；峰不对称度在0.95～1.05之间为对称峰，小于0.95为前沿峰，大于1.05为拖尾峰。
[0070]
本发明所用的术语“分离度”又称总分离效能指标或分辨率，为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度总和一半的比值，其表示相邻两个峰分离程度的优劣，是色谱柱分离效能的指标，是既能反映柱效能又能反映选择性的指标。
[0071]
本发明所用的术语“极差”又称范围误差或全距(range)，以r表示，是用来表示统计资料中的变异量数，其最大值与最小值之间的差距，即最大值减最小值后所得之数据。
[0072]
本发明所用的术语“rsd”又称相对标准偏差，是用来表示分析测试结果的精密度，分析测试结果的标准偏差与测量结果算数平均值的比值；“标准偏差”又称标准离差或均方根差，是反映一组测量数据离散程度的统计指标，即每个测试结果与所有测试结果的算数平均值的差值的平方和，将平方和计算均值后再进行开方，所得的数值为标准偏差。
[0073]
所述甘氨酸酐，称为甘氨酸杂质b，结构如下(分子式为c4h6n2o2，分子量为114.10)：
[0074][0075]
所述dl-蛋氨酸亚砜，称为蛋氨酸杂质a，结构如下(分子式为c5h
11
no3s，分子量为165.21)：
[0076][0077]
本发明提供的同时测定复方甘草酸苷片中甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的方法，包括如下步骤：
[0078]
采用hplc法对复方甘草酸苷片中甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a进行定性检测或者定量检测；
[0079]
其中，所述hplc的检测条件如下：
[0080]
色谱柱：氨基酸专用柱(ultimate amino acid plus，4.6
×
300mm)；
[0081]
检测波长：210nm至220nm、优选213nm至217nm；
[0082]
柱温：25℃至35℃；
[0083]
流速：0.5ml/min至1.5ml/min、优选0.8ml/min至1.2ml/min；
[0084]
进样体积：40μl至80μl、优选20μl至60μl；
[0085]
流动相a：0.02mol/l甲酸铵溶液(含1.4g/l辛烷磺酸钠)；
[0086]
流动相b：乙腈。
[0087]
优选地，所述hplc的检测条件如下：
[0088]
色谱柱：氨基酸专用柱(ultimate amino acid plus，4.6
×
300mm)；
[0089]
检测波长：215nm；
[0090]
柱温：30℃；
[0091]
流速：1.0ml/min；
[0092]
进样体积：50μl；
[0093]
流动相a：0.02mol/l甲酸铵溶液(含1.4g/l辛烷磺酸钠)；
[0094]
流动相b：乙腈。
[0095]
洗脱程序如下：
[0096][0097]
上述的测定方法中，所述定性检测的步骤如下：
[0098]
(1)以待测的复方甘草酸苷片为供试品，以流动相a为溶剂，配制供试品溶液；将所述供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；
[0099]
(2)以待测的复方甘草酸苷片、甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸杂质a为系统适用性样品，以流动相a为溶剂，配制含甘氨酸、蛋氨酸、甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的系统适用性溶液；将所述系统适用性溶液注入上述色谱仪，记录色谱图；
[0100]
(3)若步骤(1)中供试品的色谱图中出现与步骤(2)中所述甘氨酸杂质b对照品和蛋氨酸杂质a对照品的保留时间一致的色谱峰，则待测样品中含有甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a。
[0101]
定性检测步骤中，步骤(2)中所述系统适用性溶液中甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0102]
步骤(2)中所述系统适用性溶液中蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0103]
步骤(2)中所述甘氨酸杂质b在所述系统适用性溶液中的浓度为18至22μg/ml、优选20μg/ml；
[0104]
步骤(2)中所述蛋氨酸杂质a在所述系统适用性溶液中的浓度为45至55μg/ml、优选50μg/ml；
[0105]
定性检测步骤中，步骤(1)中所述供试品溶液中甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0106]
步骤(1)中所述供试品溶液中蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0107]
上述的测定方法中，所述定量检测的步骤如下：
[0108]
(1)分别以甘氨酸的标准物质和蛋氨酸的标准物质为对照品，以流动相a为溶剂，配制含甘氨酸和蛋氨酸对照品的溶液；所述配制步骤中，配制1份对照品溶液，对照品溶液中甘氨酸和蛋氨酸的浓度记为c1和c2；将所述对照品溶液注入色谱仪，记录色谱图，所述对照品溶液中甘氨酸和蛋氨酸的峰面积记为a1和a2；
[0109]
(2)以待测的复方甘草酸苷片为供试品，以流动相a为溶剂，配制供试品溶液；将所述供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，所述供试品溶液中杂质的峰面积记为a3；
[0110]
(3)以待测的复方甘草酸苷片、甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸杂质a为系统适用性样品，以流动相a为溶剂，配制含甘氨酸、蛋氨酸、甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的系统适用性溶液；将所述系统适用性溶液注入色谱仪，记录色谱图；
[0111]
(4)按照如下公式(1)、公式(2)和公式(3)计算待测样品中甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的含量；
[0112][0113][0114][0115]
式中：c1、c2分别为对照品溶液中甘氨酸、蛋氨酸浓度，以mg/ml计；
[0116]
w1、w2分别为甘氨酸、蛋氨酸对照品称样量，以mg计；
[0117]
w3为供试品称样量，以mg计；
[0118]w总
为供试品总重，以mg计；
[0119]
p1、p2分别为甘氨酸、蛋氨酸对照品含量；
[0120]
b1、b2分别为甘氨酸和蛋氨酸的规格，每片含甘氨酸25mg，蛋氨酸25mg；
[0121]
s1、s2分别为甘氨酸、蛋氨酸对照品稀释倍数；
[0122]
s3为供试品稀释倍数；
[0123]
a1、a2分别为对照品溶液中甘氨酸、蛋氨酸的峰面积；
[0124]
a3为供试品溶液中杂质的峰面积；
[0125]
d为研细片数；
[0126]
f为杂质的校正因子，蛋氨酸杂质a为0.69，甘氨酸杂质b为1.0。
[0127]
定量检测步骤中，步骤(1)中所述甘氨酸对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.09至0.11mg/ml，优选0.1mg/ml；
[0128]
步骤(1)中所述蛋氨酸对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.09至0.11mg/ml、优选0.1mg/ml；
[0129]
定量检测步骤中，步骤(2)中所述供试品溶液中甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0130]
步骤(2)中所述供试品溶液中蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0131]
定量检测步骤中，步骤(3)中所述系统适用性溶液中甘氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0132]
步骤(3)中所述系统适用性溶液中蛋氨酸的浓度为9至11mg/ml、优选10mg/ml；
[0133]
步骤(3)中所述甘氨酸杂质b在所述系统适用性溶液中的浓度为18至22μg/ml、优选20μg/ml；
[0134]
步骤(3)中所述蛋氨酸杂质a在所述系统适用性溶液中的浓度为45至55μg/ml、优选50μg/ml。
[0135]
本发明方法的方法学验证结果如下：
[0136]
已知杂质甘氨酸杂质b、蛋氨酸杂质a约相当于两主成分浓度和的0.0003％以上可被检出；已知杂质甘氨酸杂质b、蛋氨酸杂质a约相当于两主成分浓度和的0.0005％以上可被定量；3个浓度9份样品中甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a分别按主成分外标法计算的回收率结果均在90％至108％范围内；甘氨酸杂质b在1.998μg/ml至99.898μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系(y＝25.8324x 9.1006，相关系数r为0.9999)；蛋氨酸杂质a在10.410μg/ml至208.192μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系(y＝12.9187x 5.2487，相关系数r为1.0000)。
[0137]
本发明最终系统适用性溶液是供试品加标配制，方法开发及验证阶段是原料加标配制，区别在于供试品加标配制，蛋氨酸峰型较好，原料加标配制，蛋氨酸峰易分叉，得到两个基线无法分离的峰。
[0138]
本发明测定复方甘草酸苷片中甘氨酸杂质b、蛋氨酸杂质a的液相色谱法操作简便、灵敏度高，且具有良好的精密度(具体地说，不同分析技术人员测定六份加标供试品溶液，蛋氨酸杂质a和甘氨酸杂质b含量的rsd值均不大于3％；双人共测定十二份加标供试品溶液，蛋氨酸杂质a和甘氨酸杂质b含量的rsd值均不大于6％)及良好的准确度(具体地说，
回收率值在90％至108％范围内)，方法呈现良好的线性关系(具体地说，相关系数r不小于0.990)，对流速、柱温、检测波长、流动相中盐浓度及不同批号色谱柱的耐用性好(具体地说，改变色谱条件，甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a的含量与正常条件测定的相应杂质含量所得极差不大于0.1％)，适用于同时检测复方甘草酸苷片中的甘氨酸杂质b和蛋氨酸杂质a，可利用该方法控制复方甘草酸苷片的质量。
[0139]
实施例
[0140]
下面通过具体实施例来进一步详述本发明。但是，下述实施例仅为示例性和说明性的，本发明并不限于这些实施例。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本领域技术人员可对这些实施例和优选实施方案进行各种修改、替代、改变，经过修改、替代和改变后的实施例和优选实施方案仍落入本发明的范围内。
[0141]
下述实施例的试验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的各标准物质均可从商业途径购买得到。
[0142]
下述实施例中所用的仪器与试剂：高效液相色谱仪(岛津2030c 3d plus，二极管阵列检测器)，高效液相色谱仪(1260infinityⅱ，紫外检测器)，电子天平(赛多利斯，十万分之一精度)，电子天平(奥豪斯，万分之一精度)，离心机(湘仪，即长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)，乙腈(mreda，色谱纯)，辛烷磺酸钠(mreda，色谱纯)，甲酸铵(mreda，分析纯)，水(屈臣氏，蒸馏水)。
[0143]
所用复方甘草酸苷片样品中甘氨酸的浓度为10mg/ml，蛋氨酸的浓度为10mg/ml。
[0144]
实施例1：检测条件的确定
[0145]
方法1：hplc等度法
[0146]
色谱柱：氨基酸专用柱(ultimate amino acid plus，4.6
×
300mm)；
[0147]
检测波长：200nm；
[0148]
流速：1.0ml/min；
[0149]
柱温：30℃；
[0150]
进样体积：20μl；
[0151]
流动相：0.02mol/l甲酸铵溶液。
[0152]
分别称取甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸杂质a对照品各约10mg，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液。精密称取甘氨酸原料药约100mg，置于10ml容量瓶中，加入上述杂质贮备液0.1ml，加入水溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀，作为加样溶液。注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0153]
结果：在此条件下，各相邻峰均能有效分离，但各峰出峰时间过早，甘氨酸峰在空白溶剂(水)的梯度上(见图1)。
[0154]
方法2：hplc梯度法-1
[0155]
色谱柱：氨基酸专用柱(ultimate amino acid plus，4.6
×
300mm)；
[0156]
检测波长：200nm；
[0157]
流速：1.0ml/min；
[0158]
柱温：30℃；
[0159]
进样体积：20μl；
[0160]
流动相a：含1.4g/l辛烷磺酸钠的0.02mol/l甲酸铵溶液
[0161]
流动相b：乙腈。
[0162]
按照下表进行梯度洗脱。
[0163]
表1.方法2洗脱程序
[0164][0165]
分别称取甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸杂质a对照品各约10mg，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液。精密称取甘氨酸原料、蛋氨酸原料各约100mg，置于10ml容量瓶中，加入上述杂质贮备液1ml，加入水溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀，作为加样溶液。注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0166]
结果：在此条件下，甘氨酸与空白溶剂(水)的梯度峰分离度略有改善，各相邻峰均能有效分离，各杂质的峰型较好，灵敏度高，但甘氨酸响应低(见图2)。
[0167]
方法3：hplc梯度法-2
[0168]
色谱柱：氨基酸专用柱(ultimate amino acid plus，4.6
×
300mm)；
[0169]
检测波长：215nm；
[0170]
流速：1.0ml/min；
[0171]
柱温：30℃；
[0172]
进样体积：50μl；
[0173]
流动相a：含1.4g/l辛烷磺酸钠的0.02mol/l甲酸铵溶液
[0174]
流动相b：乙腈
[0175]
分别称取甘氨酸对照品、蛋氨酸对照品、甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸杂质a对照品各约10mg，置于10ml容量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.1ml，置于10ml容量瓶中，用流动相a稀释至容量瓶的刻度，摇匀，作为混合溶液。注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0176]
按照下表进行梯度洗脱。
[0177]
表2.方法3洗脱程序
[0178][0179]
结果：甘氨酸与空白溶剂(流动相a)的梯度峰分离度明显改善，此条件下，各相邻峰均能有效分离，各成分的峰型较好，灵敏度高(见图3)。
[0180]
因此，将方法3中的各条件确定为本发明检测方法的检测条件。
[0181]
实施例2：系统适用性测定
[0182]
1、色谱条件
[0183]
色谱柱：氨基酸专用柱(ultimate amino acid plus，4.6
×
300mm)；
[0184]
检测波长：215nm；
[0185]
流速：1.0ml/min；
[0186]
柱温：30℃；
[0187]
进样体积：50μl；
[0188]
流动相a：含1.4g/l辛烷磺酸钠的0.02mol/l甲酸铵溶液
[0189]
流动相b：乙腈。
[0190]
按照表2进行梯度洗脱。
[0191]
2、溶液配制
[0192]
空白溶剂：流动相a。
[0193]
供试品溶液：精密称取本品研细粉末适量(约相当于甘氨酸和蛋氨酸各100mg)，置于10ml容量瓶中，加入适量所述空白溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放冷，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液，滤过，取续滤液。
[0194]
杂质贮备液：称取甘氨酸杂质b约20mg，蛋氨酸杂质a约50mg，置于200ml容量瓶中，加入溶剂适量超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0195]
系统适用性溶液：精密称取甘氨酸原料约100mg，蛋氨酸原料约100mg，置于10ml量瓶中，加入杂质贮备液2ml，加入溶剂适量超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0196]
定位溶液：取甘氨酸、甘氨酸杂质b、蛋氨酸、蛋氨酸杂质a对照品各适量，分别用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含50μg的溶液。
[0197]
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、定位溶液、供试品溶液和空白溶剂各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。实验结果见图4。
[0198]
表3.系统适用性结果
[0199][0200]
由表3中可以看出，系统适用性溶液的出峰顺序依次为甘氨酸、蛋氨酸杂质a、甘氨酸杂质b、蛋氨酸，各杂质与主峰分离度均大于1.5，分离度良好。空白溶剂不干扰杂质的检测。
[0201]
实施例3：方法学验证-专属性
[0202]
空白溶剂：流动相a。
[0203]
空白溶液：称取空白(不含蛋氨酸与甘氨酸)约430mg，置于10ml容量瓶中，加入适量溶剂，进行超声溶解。将其放置冷却，用流动相稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟)，取上清液滤过，取续滤液。
[0204]
杂质贮备液：取蛋氨酸杂质a约25mg、甘氨酸杂质b约10mg，置于50ml容量瓶中，加溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0205]
加标供试品溶液：取本品研细，精密称取本品适量(约相当于甘氨酸和蛋氨酸各100mg)，置于10ml容量瓶中，加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，加杂质贮备液2ml，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液，滤过，取续滤液。
[0206]
定位溶液：取蛋氨酸、蛋氨酸杂质a对照品、甘氨酸与甘氨酸杂质b对照品各适量，分别用溶剂溶解并稀释制成每1ml约含50μg的溶液。
[0207]
系统适用性溶液：取蛋氨酸原料、甘氨酸原料、蛋氨酸杂质a对照品和甘氨酸杂质b对照品适量，加入溶剂溶解并稀释制成每1ml中含甘氨酸和蛋氨酸各约10mg、蛋氨酸杂质a约50μg、甘氨酸杂质b约20μg的混合溶液。
[0208]
精密量取上述空白溶剂、空白溶液、加标供试品溶液、系统适用性溶液和各杂质定位溶液各50μl，注入色谱仪，记录色谱图。
[0209]
表4.专属性结果
[0210][0211]
结论：空白溶剂和空白溶液均不干扰对各已知杂质的测定，各峰之间分离度符合规定。
[0212]
实施例4：方法学验证-检测限
[0213]
溶剂：流动相a。
[0214]
取甘氨酸、甘氨酸杂质b、蛋氨酸、蛋氨酸杂质a对照品适量，精密称定，加入溶剂使其溶解，并用溶剂逐级稀释至适宜浓度，在上述色谱条件下，以信噪比为3：1时对应的注入色谱仪的进样量确定检测限。图谱见图5。
[0215]
表5.检测限结果
[0216][0217]
结论：在拟定复方甘草酸苷片杂质检查浓度下(甘氨酸10mg/ml、蛋氨酸10mg/ml)，甘氨酸杂质b、蛋氨酸杂质a限度分别为0.2％、0.5％，约相当于两主成分浓度和的0.0003％以上可被检测，能够满足检测需求。精密量取检测限溶液50μl注入色谱仪，连续进样2次，实验结果见下表。
[0218]
表6.检测限结果(二)
[0219]
名称信噪比1信噪比2信噪比均值甘氨酸3.593.513.55蛋氨酸杂质a9.359.069.21甘氨酸杂质b11.3710.8411.11蛋氨酸8.878.338.60
[0220]
结论：各成分检测限浓度信噪比均大于3。
[0221]
实施例5：方法学验证-定量限
[0222]
溶剂：流动相a。
[0223]
取甘氨酸、甘氨酸杂质b、蛋氨酸、蛋氨酸杂质a对照品适量，精密称定，加入溶剂使其溶解，并用溶剂逐级稀释至适宜浓度，在上述色谱条件下，以信噪比为10：1时对应的注入色谱仪的进样量确定定量限，图谱见图6。
[0224]
表7.定量限结果
[0225][0226]
结论：拟定复方甘草酸苷片杂质检查浓度下(甘氨酸10mg/ml、蛋氨酸10mg/ml)，甘氨酸杂质b、蛋氨酸杂质a限度分别为0.2％、0.5％，约相当于两主成分浓度和的0.0005％以上可被定量，能够满足它们的拟定限度的定量需求。
[0227]
精密量取上述定量限溶液50μl，注入色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，测得6次主峰以及各杂质保留时间的相对标准偏差不得大于2.0％，峰面积的相对标准偏差不得大于15％。实验结果见下表。
[0228]
表8.定量限进样精密度结果
[0229][0230][0231]
结论：定量限溶液连续进样6针，各杂质的保留时间rsd值均不大于2.0％，峰面积rsd值均不大于15％，验证了杂质定量限的重复性较好。
[0232]
实施例6：方法学验证-进样精密度
[0233]
溶剂：流动相a。
[0234]
系统适用性溶液：取蛋氨酸原料、甘氨酸原料、蛋氨酸杂质a对照品和甘氨酸杂质b对照品适量，加入溶剂稀释，制成每1ml中含甘氨酸约10mg、蛋氨酸约10mg、蛋氨酸杂质a约50μg、甘氨酸杂质b约20μg的混合溶液。
[0235]
精密量取系统适用性溶液各50μl，注入色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，结果见下表。
[0236]
表9.系统适用性溶液进样精密度结果
[0237]
[0238][0239]
结论：系统适用性溶液连续进样6次，甘氨酸、蛋氨酸杂质a、甘氨酸杂质b、蛋氨酸保留时间和峰面积的rsd值均不大于2.0％，进样精密度良好。
[0240]
实施例7：方法学验证-准确度
[0241]
考察杂质的准确度，甘氨酸杂质b限度为0.2％，蛋氨酸杂质限度为0.5％，回收率的设计范围为限度浓度50％、限度浓度100％、限度浓度150％。
[0242]
溶剂：流动相a。
[0243]
系统适用性溶液：取蛋氨酸原料、甘氨酸原料、蛋氨酸杂质a对照品与甘氨酸杂质b对照品各适量，加入流动相a溶解并稀释制成每1ml中约含甘氨酸10mg、蛋氨酸10mg、蛋氨酸杂质a 50μg、甘氨酸杂质b 20μg的混合溶液。
[0244]
空白溶液：称取空白(不含蛋氨酸与甘氨酸)约425mg，置于10ml容量瓶中，加入适量溶剂，超声溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液滤过，取续滤液。
[0245]
杂质贮备液：称取蛋氨酸杂质a对照品约25mg，甘氨酸杂质b对照品约10mg，置于50ml容量瓶中，加入适量溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0246]
对照品溶液：称取甘氨酸对照品、蛋氨酸对照品各约10mg，置于100ml容量瓶中，加入适量溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0247]
本底供试品溶液：取本品细粉适量(约相当于甘氨酸和蛋氨酸各100mg)，置于10ml容量瓶中，加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液滤过，取续滤液。(平行2份)
[0248]
50％加标供试品溶液：取本品细粉约625g，置于10ml容量瓶中，精密量取杂质贮备液1ml，加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液滤过，取续滤液。(平行3份)
[0249]
100％加标供试品溶液：取本品细粉约625mg，置于10ml容量瓶中，精密量取杂质贮
备液2ml，加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液滤过，取续滤液。(平行3份)
[0250]
150％加标供试品溶液：取本品细粉约625mg，置于10ml容量瓶中，精密量取杂质贮备液3ml，加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液滤过，取续滤液。(平行3份)
[0251]
精密量取上述溶液各50μl，注入色谱仪，记录色谱图，结果如下。
[0252]
表10.蛋氨酸杂质a回收率结果
[0253][0254]
表11.甘氨酸杂质b回收率结果
[0255][0256][0257]
结论：本方法用主成分外标法测得各杂质3个浓度9份样品回收率结果均在90％～108％范围内，本方法的准确度良好。
[0258]
实施例8：方法学验证-精密度
[0259]
8.1重复性
[0260]
在相同条件下，按照hplc测定方法，由同一个分析人员，平行配制6份加标供试品溶液，测定结果以进行评价该方法的重复性。
[0261]
溶液配置如下：
[0262]
溶剂：流动相a。
[0263]
空白溶液：称取空白(不含蛋氨酸与甘氨酸)约425mg，置于10ml容量瓶中，加入适量溶剂，超声溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液，滤过，取续滤液。
[0264]
系统适用性溶液：取蛋氨酸原料、甘氨酸原料、蛋氨酸杂质a对照品与甘氨酸杂质b
对照品各适量，加入溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含甘氨酸10mg、蛋氨酸10mg、蛋氨酸杂质a 50μg、甘氨酸杂质b 20μg的混合溶液。
[0265]
对照品溶液：取甘氨酸、蛋氨酸对照品各约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加入适量溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0266]
杂质贮备液：称取蛋氨酸杂质a约25mg，甘氨酸杂质b约10mg，置于50ml容量瓶中，加入适量溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0267]
加标供试品溶液：取本品适量(约相当于甘氨酸和蛋氨酸各100mg)，精密称定，置于10ml容量瓶中，精密加入杂质贮备液2ml。加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液，滤过，取续滤液。(平行6份)
[0268]
精密量取上述溶液各50μl，注入色谱仪，记录色谱图，结果见下表。
[0269]
表12.重复性试验结果
[0270][0271]
结论：平行配制的6份加标供试品测定的结果中，各杂质rsd值均不大于3％，本方法重复性良好。
[0272]
8.2中间精密度
[0273]
由不同实验员于不同时间采用不同仪器进行中间精密度考察，所得6份数据合并重复性试验中的6份结果，比较见下表。
[0274]
表13.中间精密度试验结果
[0275][0276]
结论：由中间精密度试验所得12组数据可知，蛋氨酸杂质a和甘氨酸杂质b检出量的rsd值均不大于6％。综上结果可知，本方法的精密度良好。
[0277]
实施例9：方法学验证-线性
[0278]
9.1线性
[0279]
溶剂：流动相a。
[0280]
线性贮备液1：取甘氨酸、甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸各约25mg，置于50ml容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。精密量取10ml，置于50ml容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0281]
线性贮备液2：称取蛋氨酸杂质a对照品约10mg，置于50ml容量瓶中，加入溶剂溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0282]
精密量取线性贮备液适量，用溶剂稀释制成一系列的浓度，作为一系列浓度的线性溶液。
[0283]
表14.甘氨酸、甘氨酸杂质b对照品、蛋氨酸线性溶液配制方式
[0284]
量取溶液名称移取体积(ml)容量瓶(ml)理论浓度(μg/ml)线性贮备液0.5252线性贮备液55010线性贮备液42516线性贮备液52520线性贮备液51050线性贮备液同线性贮备液/100
[0285]
表15.蛋氨酸杂质a线性溶液配制方式
[0286]
量取溶液名称移取体积(ml)容量瓶(ml)理论浓度(μg/ml)线性贮备液12010线性贮备液11020线性贮备液52050线性贮备液510100
线性贮备液610120线性贮备液同线性贮备液/200
[0287]
精密量取上述系列浓度的溶液各50μl，注入色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标(x轴)，以峰面积为纵坐标(y轴)，进行线性回归分析，结果见下表。图谱见图7至图9。
[0288]
表16.线性实验结果
[0289][0290][0291]
结论：甘氨酸杂质b浓度在1.998μg/ml～99.898μg/ml范围内，线性方程为y＝25.8324x 9.1006，线性相关系数r为0.9999(≥0.990)，浓度与峰面积呈良好的线性关系，符合要求。
[0292]
蛋氨酸杂质a浓度在10.410μg/ml～208.192μg/ml范围内，线性方程为y＝12.9187x 5.2487，线性相关系数r为1.0000(≥0.990)，浓度与峰面积呈良好的线性关系，符合要求。
[0293]
甘氨酸与蛋氨酸峰面积和浓度在4.083μg/ml～204.160μg/ml范围内，线性方程为y＝8.9135x-5.1028，线性相关系数r为1.0000(≥0.990)，浓度与峰面积呈良好的线性关系，符合要求。
[0294]
9.2校正因子
[0295]
以甘氨酸与蛋氨酸加和线性方程斜率和蛋氨酸杂质a、甘氨酸杂质b线性方程斜率，计算出各杂质的校正因子，结果见下表。
[0296]
表17.校正因子结果
[0297]
杂质名称斜率校正因子甘氨酸与蛋氨酸8.9135/蛋氨酸杂质a12.91870.69
甘氨酸杂质b25.83240.35
[0298]
结论：蛋氨酸杂质a校正因子为0.69，甘氨酸杂质b校正因子为0.35，不在0.9～1.1范围内，故验证过程需加校正因子计算；自拟标准中检验蛋氨酸杂质a按照加校正因子计算，甘氨酸杂质b按1.0计算，对甘氨酸杂质b进行了严控。
[0299]
实施例10：方法学验证-溶液稳定性
[0300]
溶剂：流动相a。
[0301]
杂质贮备液：称取甘氨酸杂质b约10mg，蛋氨酸杂质a约25mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入适量溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0302]
加标供试品溶液：称取本品细粉适量(约相当于甘氨酸和蛋氨酸各100mg)，置于10ml容量瓶中，精密加入杂质贮备液2ml，加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液，滤过，取续滤液。
[0303]
对照品溶液：取甘氨酸、蛋氨酸对照品各10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加入溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0304]
取加标供试品溶液与对照品溶液于室温放置，在不同时间点考察其溶液稳定性，其中以0小时对照品溶液按外标法计算不同时间点加标供试品溶液的杂质含量，结果见下表。
[0305]
表18.溶液稳定性试验结果
[0306][0307]
结论：对照品溶液于室温条件下放置64小时，对照品溶液中甘氨酸和蛋氨酸峰面积的rsd值均不大于2.0％，对照品溶液稳定。
[0308]
加标供试品溶液于室温条件下放置64小时，杂质检出量无明显差异，蛋氨酸杂质a和甘氨酸杂质b检出量的极差值均小于0.1％，且无新增杂质，供试品溶液稳定。
[0309]
综上所述，对照品溶液和供试品溶液在室温64小时内稳定。
[0310]
实施例11：方法学验证-耐用性
[0311]
通过改变柱温、波长、流动相盐浓度、流速，更换不同批号色谱柱来考察色谱参数有微小变动后，测定结果不受影响的承受程度。测定条件变化范围如下：
[0312]
表19.测定条件耐用性范围
[0313][0314]
配制加标供试品溶液、对照品溶液和空白溶液，在上述色谱条件下考察样品的有关物质结果变化情况和系统适用性情况，以考察色谱条件微小变动时对测定结果的影响程度。
[0315]
具体配制如下：
[0316]
溶剂：流动相a。
[0317]
空白溶液：称取空白(不含蛋氨酸与甘氨酸)约425mg，置于10ml容量瓶中，加入适量溶剂适量，超声溶解，放置冷却，用溶剂稀释至容量瓶的刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液，滤过，取续滤液。
[0318]
系统适用性溶液：取蛋氨酸原料、甘氨酸原料、蛋氨酸杂质a对照品与甘氨酸杂质b对照品各适量，加入溶剂溶解并稀释制成每1ml中含甘氨酸约10mg、蛋氨酸约10mg、蛋氨酸杂质a约50μg、甘氨酸杂质b约20μg的混合溶液。
[0319]
对照品溶液：取甘氨酸、蛋氨酸对照品各约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加入适量溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0320]
杂质贮备液：称取蛋氨酸杂质a约25mg，甘氨酸杂质b约10mg，置于50ml容量瓶中，加入适量溶剂超声溶解并稀释至容量瓶的刻度，摇匀。
[0321]
加标供试品溶液：取本品适量(约相当于甘氨酸和蛋氨酸各约100mg)，精密称定，置于10ml容量瓶中，精密加入杂质贮备液2ml。加入适量溶剂，通过超声使甘氨酸和蛋氨酸溶解，放置冷却，用溶剂稀释至刻度，摇匀，离心(10000转/分钟，5分钟)，取上清液，滤过，取续滤液。
[0322]
精密量取上述溶液各50μl，注入色谱仪，记录色谱图。结果见下表。
[0323]
表20.耐用性实验系统适用性结果
[0324][0325]
表21.耐用性实验有关物质测定结果
[0326][0327][0328]
结论：对色谱条件中的色谱参数进行耐用性实验，结果表明：当色谱条件中的流动相柱温、流速、波长、盐浓度发生微小变化时，当更换同品牌不同批号色谱柱进行试验时，系统适用性溶液出峰顺序和分离度均符合规定，各杂质在不同条件下的检出量，与正常条件下检出量的极差值均不大于0.1％，即各条件下杂质的检出量无明显差异。本方法耐用性良好。
[0329]
上面通过具体实施例和优选实施方案详细描述了本发明。然而，在不脱离本发明的宗旨和精神的前提下，可对本发明的实施例进行各种修改、修饰、变化和变型。并且，对本发明的实施方式的各种修改、修饰、变化和变型并不影响本发明权利要求的保护范围，相反均落入本发明权利要求的保护范围内。