血液凝固时间测定方法与流程

1.本发明涉及一种血液凝固时间测定方法。


背景技术：

2.血液凝固检查是通过在患者的血液样本中添加规定的试剂来测定血液凝固时间等，从而用于诊断患者的血液凝固能力的检查。作为血液凝固时间的典型的例子，有凝血酶原时间(pt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶时间等。能够利用血液凝固检查来调查患者的止血能力、纤溶能力。血液凝固能力的异常主要导致凝固时间的延长。例如凝固时间的延长是由于抗凝药剂的影响、参与凝固的成分的减少、先天性血液凝固因子的缺乏、获得性的阻碍凝固反应的自身抗体等造成的。
3.近年来，进行血液凝固检查的自动测量的自动分析装置被广泛使用，能够简便地实施血液凝固检查。例如在某种的自动分析装置中，对可在血液样本中添加试剂而得到的混合液照射光，基于得到的光量的变化测量该血液样本的凝固反应。例如在测量散射光量的情况下，从向血液样本添加试剂开始经过一定程度的时间的时刻，通过凝固的进行，使散射光量急剧地上升，其后，凝固反应接近结束，并且散射光量饱和，而达到平稳。能够基于这样的散射光量的时间的变化来测定血液凝固时间。
4.作为利用自动分析装置的凝固时间的算出方法，使用百分率法、微分法等几种方法(参照专利文献1)。在基于散射光量算出凝固时间的情况下，对于百分率法，典型的是，算出测量的散射光量达到其最大值的一定比例的时刻为止的时间作为凝固时间。百分率法不仅可以对正常样本，还可以对低纤维蛋白原样本、乳糜样本、溶血样本等异常样本进行相当准确的凝固时间计算。另一方面，在基于百分率法的自动分析中，需要将样本的测量时间设定的较长，以使得即使利用低纤维蛋白原样本等凝固能力低的异常样本也能够检测出最大散射光量，因此分析需要耗费时间。
5.对于微分法，典型的是，算出散射光量的微分值达到峰或者其一定比例的时刻为止的时间作为凝固时间。然而，利用低纤维蛋白原样本等凝固能力低的异常样本，有时散射光量的微分值看不到清晰的峰。并且，异常样本中，有时产生2种以上的微分值的峰。有时使用基于通过微分值曲线的拟合制作的单峰的曲线来算出凝固时间的方法，拟合有时损害关于样本的凝固能力的正确的信息。
6.并且，分析装置中的测光数据中包含由装置、试剂、样本的状态等引起的各种噪声，这些也可能带来凝固时间的误检测。对于血液样本的自动分析，要求除去噪声的负面影响来算出有可靠性的凝固时间。
7.现有技术文献
8.专利文献
9.专利文献1：日本特开平6-249855号公报


技术实现要素：

10.本发明涉及一种血液凝固时间测定方法，能够正确地测定表示各种血液凝固反应曲线的血液样本的凝固时间。
11.即，本发明提供以下的方法。
12.〔1〕一种血液凝固时间测定方法，包括：
13.测量关于试样的凝固反应，上述试样是被测样本和凝固时间测定试剂混合而成的，
14.由得到的测量数据算出关于与凝固速度有关的波形的运算对象区域的加权平均时间，以及
15.基于该加权平均时间来确定该被测样本的血液凝固时间；
16.该运算对象区域是该与凝固速度有关的波形中的该波形为规定的下限值以上的区域。
17.〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，所述与凝固速度有关的波形是凝固反应曲线或者其相对值的一阶微分曲线。
18.〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，在将所述与凝固速度有关的波形设为f(t)(t为时间)、将f(t)为最大值的x％(x为在5～95的范围设定的规定值)时的时间设为t1、t2(t1＜t2)时，上述加权平均时间由下述式表示：
[0019][0020]
〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，所述被测样本为血浆。
[0021]
〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，所述血液凝固时间为活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶原时间(pt)、纤维蛋白原浓度测定中的凝固时间。
[0022]
〔6〕一种凝固因子浓度的测定方法，包括基于由所述〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法测定的被测样本的血液凝固时间来测定该被测样本的凝固因子浓度。
[0023]
〔7〕根据〔6〕所述的方法，其中，所述被测样本为血浆。
[0024]
〔8〕根据〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，所述凝固因子为纤维蛋白原。
[0025]
〔9〕根据〔8〕所述的方法，其中，所述血液凝固时间为纤维蛋白原浓度测定中的凝固时间。
[0026]
根据本发明的方法，能够正确地测定表示包含正常样本、异常样本的各种血液凝固反应曲线的血液样本的凝固时间。并且，在利用自动分析装置实时地分析大量的样本的情况下，本发明的方法与以往的百分率法相比，能够使每1个样本中的分析时间缩短化，可提高分析效率。
附图说明
[0027]
图1是本发明的血液凝固时间测定方法的一个实施方式的基本流程。
[0028]
图2是图1所示的数据解析工序的顺序的一个实施方式。
[0029]
图3是凝固反应曲线的一个例子。
[0030]
图4是预处理后的凝固反应曲线的一个例子。
[0031]
图5是a：凝固反应曲线的一个例子的部分放大图，b：预处理后的凝固反应曲线的一个例子的部分放大图。
[0032]
图6是校正0阶曲线的一个例子。
[0033]
图7是校正一阶曲线的一个例子。
[0034]
图8是表示运算对象区域和加权平均点的概念图。
[0035]
图9是表示根据运算对象区域的加权平均点的变化的概念图。
[0036]
图10是20％运算对象区域中的vt20％的、相对于基于百分率法的aptt的线性回归直线。
[0037]
图11是5～95％运算对象区域中的vt(vt5％～vt95％)的、相对于基于百分率法的aptt的线性回归直线的斜率(a)、截距(b)以及相关系数(c)。
[0038]
图12是相对于针对24个样本的5～95％运算对象区域中的加权平均时间(vt5％～vt95％)的对照(基于百分率法的aptt)的误差。表中的由灰色表示的单元是加权平均时间与对照之差表示对照的
±
5％以内(a)以及
±
2.5％以内(b)。
[0039]
图13是30％运算对象区域中的vt30％的、相对于基于百分率法的pt的线性回归直线。
[0040]
图14是5～95％运算对象区域中的vt(vt5％～vt95％)的、相对于基于百分率法的pt的线性回归直线的斜率(a)、截距(b)以及相关系数(c)。
[0041]
图15是针对23个样本的5～95％运算对象区域中的加权平均时间(vt5％～vt95％)的相对于对照(基于百分率法的pt)的误差。表中的由灰色表示的单元表示加权平均时间与对照之差在对照的
±
5％以内(a)以及
±
2.5％以内(b)。
[0042]
图16是35％运算对象区域中的基于加权平均时间的[fbg]运算值的、相对于基于百分率法的[fbg]运算值的线性回归直线。
[0043]
图17是基于5～95％运算对象区域中的vt(vt5％～vt95％)的[fbg]运算值的、相对于基于百分率法的[fbg]运算值的线性回归直线的斜率(a)、截距(b)以及相关系数(c)。
[0044]
图18是针对20个样本的浓度系列样本数据的5～95％运算对象区域中的[fbg]运算值的、相对于期待值的误差。表中的由灰色表示的单元表示运算值与期待值的误差在
±
10％以内(a)以及
±
5％以内(b)。
具体实施方式
[0045]
在血液凝固检查中，在血液样本中添加规定的试剂，测量其后的血液凝固反应，根据凝固反应测定血液凝固时间。在以下的本说明书中，存在将血液样本称为样本的情况。血液凝固反应的测量可使用一般的手段，例如测量散射光量、透射度、吸光度等的光学手段、或者测量血浆的粘度的力学的手段等。正常样本的凝固反应曲线依赖于测量手段，但基本上显示s形状。例如基于正常样本的散射光量的凝固反应曲线通常在从添加试剂后经过一定程度的时间的时刻因凝固的进行急剧地上升，其后，凝固反应接近结束，并且达到平稳。另一方面，具有凝固异常的异常样本的凝固反应曲线表示曲线的上升时间的延迟、缓慢的上升等因异常原因导致的各种形状。多种多样的异常样本的凝固反应曲线不易利用自动分析装置正确测定凝固时间。
[0046]
以往的一般的血液凝固时间测定中，取得至少到凝固反应结束为止的数据，基于
取得的数据算出凝固时间。例如有在基于散射光量算出凝固时间的情况下，将散射光量饱和的时刻判断为凝固反应结束后，从添加试剂时刻开始到凝固反应结束时刻为止期间，凝固反应曲线达到最大速度或者其1/n的时刻确定为凝固时间的方法(微分法)、达到凝固反应结束时刻的散射光量的1/n的时刻确定为凝固时间的方法(百分率法、参照专利文献1)等。然而，由于上述的异常样本的凝固反应曲线的异常的形状、噪声，引起凝固反应速度的峰、凝固反应结束的误探测，例如有时在反应速度的峰、反应结束过早的时刻进行探测。这样的误探测会导致算出不正确的凝固时间。
[0047]
在自动分析装置中，为了高效地分析大量样本，因此期望针对一个样本取得需要的数据后，迅速地结束测量，开始接下来的样本的测量。然而，这种方法中，在上述过早的时刻的凝固反应结束的误探测会导致过早的测量结束，存在丢失需要的数据的风险。另一方面，如果将每一个样本的凝固反应测量时间固定为充分长的时间，则能够防止由凝固反应结束的误探测导致的数据丢失。然而，这种方法对于大量的样本而言测量时间不必要地变长，因此降低整体的分析效率。
[0048]
本发明能够防止由上述的凝固反应曲线的异常的形状带来的凝固时间的误检测，并测定正确的凝固时间。并且，根据本发明，对于包含正常样本、异常样本的各种血液样本，能够应用各凝固时间测定所需的最低限度的凝固反应测量时间，因此能够使每1个样本中的分析时间缩短。
[0049]
〔血液凝固时间测定方法〕
[0050]
本发明涉及一种血液样本的血液凝固时间测定方法。本发明的血液凝固时间测定方法(以下，也称为本发明的方法)包括：测量关于试样的凝固反应，上述试样是被测样本和凝固时间测定试剂混合而成的；由得到的测量数据算出关于与凝固速度有关的波形的规定的运算对象区域的加权平均时间。参照图1说明本发明的方法的一个实施方式。在本方法中，首先根据被测样本制备试样，接着，实施关于该试样的凝固反应测量(步骤1)。对得到的测量数据进行解析，取得关于该试样的与凝固速度有关的波形，接着，算出关于该波形的规定的运算对象区域的加权平均时间(步骤2)。基于得到的加权平均时间，确定被测样本的凝固时间(步骤3)。
[0051]
1.凝固反应测量
[0052]
凝固反应测量中测量将试剂混合而成的被测样本的凝固反应。根据由该测量得到的凝固反应的时间序列数据，测定血液凝固时间。作为本发明的方法中测定的血液凝固时间的例子，可举出凝血酶原时间(pt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、纤维蛋白原浓度(fbg)测定中的凝固时间等。以下的本说明书中，作为凝固时间，主要例举出活化部分凝血活酶时间(aptt)，说明本发明的方法。对于其他的凝固时间(例如对凝血酶原时间(pt))的本发明的方法的变更，只要是本领域技术人员就可以实施。
[0053]
在本发明的方法中，作为被测血液样本，可优选使用被测者的血浆。该样本中可添加凝固检查中通常使用的抗凝固剂。例如在使用加入了柠檬酸钠的采血管进行采血后，通过离心分离而得到血浆。
[0054]
在该被测样本中添加凝固时间测定试剂，开始血液凝固反应。可测量添加试剂后的混合液的凝固反应。使用的凝固时间测定试剂可结合测定目的任意地选择。用于测定各种凝固时间的试剂有市售(例如，aptt试剂coagpia aptt-n；积水医疗株式会社制)。凝固反
应的测量只要使用一般的手段，例如测量散射光量、透射度、吸光度等的光学的手段、或者测量血浆的粘度的力学的手段等即可。凝固反应的反应开始时刻典型的是可定义为在样本中混合试剂而开始凝固反应的时刻，其他的时刻也可以定义为反应开始时刻。继续凝固反应的测量的时间例如可以是从样本与试剂混合的时刻起数十秒～7分钟左右。该测量时间可以是任意确定的固定的值，但也可以是到检测各样本的凝固反应的结束的时刻为止。可在该测量时间期间以规定的间隔反复进行凝固反应的进行状况的测量(光学性检测的情况下测光)。例如可以以0.1秒间隔进行测量即可。该测量中的混合液的温度是通常的条件，例如30℃～40℃，优选为35℃～39℃。另外，测量的各种条件可根据被测样本、试剂、测量手段等适当地设定。
[0055]
上述的凝固反应测量中的一系列的操作可以使用自动分析装置进行。作为自动分析装置的一个例子，可举出血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)。或者，一部分的操作也可以利用手动操作进行。例如，能够由人来制备被测样本，其后的操作可以利用自动分析装置进行。
[0056]
2.数据解析
[0057]
2.1)数据的预处理及校正处理
[0058]
接下来，对步骤2的数据解析进行说明。图2表示数据解析的流程。步骤2的数据解析可以与步骤1的凝固反应测量同时进行，或者可以使用预先测定的凝固反应测量的数据，在之后进行。优选地，步骤2的数据解析与步骤1的凝固反应测量同时进行，在能够取得被测样本的凝固时间计算所需的数据的时刻，结束该样本的凝固反应测量，移至后续的样本的凝固反应测量。
[0059]
在步骤2a中，取得凝固反应测量中的测量数据。该数据是例如反映在上述的步骤2中的aptt测定中得到的试样的凝固反应过程的数据。例如可取得表示从包含被测样本和凝固时间测定试剂的试样的添加氯化钙液后的凝固反应的进行量(例如散射光量)的时间变化的数据。在本说明书中，将这些凝固反应测量中得到的数据也称为凝固反应信息。
[0060]
将步骤2a中取得的凝固反应信息的一个例子示于图3。图3是基于散射光量的凝固反应曲线，横轴表示添加氯化钙液后的经过时间(凝固反应时间)，纵轴表示散射光量。由于经过时间，并且进行了混合液的凝固反应，因此散射光量增加。在本说明书中，将表示这样的凝固反应量相对于凝固反应时间的变化的曲线称为凝固反应曲线。
[0061]
图3所示的基于散射光量的凝固反应曲线通常为s状(
シグモイド
状)。另一方面，基于透射光量的凝固反应曲线通常为反s状(逆
シグモイド
状)。以下的本说明书中，针对作为凝固反应信息而使用了基于散射光量的凝固反应曲线的数据解析进行说明。
[0062]
根据需要，可以对凝固反应曲线实施预处理(步骤2b)。该预处理中可包括用于除去噪声的平滑化处理、或者零点调整。图4表示经过预处理(平滑化处理和零点调整)的图3的凝固反应曲线的一个例子。平滑化处理中可使用任一公知的噪声除去方法。另外，如图3所示，包含被测样本的混合液使各种光散射，因此测定开始时刻(时间0)的散射光量比0大。通过平滑化处理后的零点调整，如图4所示，时间0的散射光量被调整为0。图5a和b分别表示预处理前和后的图3的凝固反应曲线的部分放大图。图5b中，相对于图5a的数据，进行平滑化处理和零点调整。
[0063]
凝固反应曲线的高度依赖被测样本的纤维蛋白原浓度。另一方面，纤维蛋白原浓
度存在个人差，因此，该凝固反应曲线的高度因被测样本而不同。因此，在本方法中，根据需要，在步骤2c中，进行用于使预处理后的凝固反应曲线进行相对值化的校正处理。根据该校正处理，能够获得不依赖于纤维蛋白原浓度的凝固反应曲线，由此能够定量地比较样本之间的预处理后的凝固反应曲线的形状的差异。
[0064]
在一个实施方式中，该校正处理中，对预处理后的凝固反应曲线以最大值成为规定值的方式进行校正。优选地，在该校正处理中，根据下述式(1)，根据预处理后的凝固反应曲线求出校正凝固反应曲线p(t)。在式(1)中，d(t)表示预处理后的凝固反应曲线，dmax和dmin分别表示d(t)的最大值和最小值，drange表示d(t)的变化宽度(即dmax-dmin)，a是表示校正凝固反应曲线的最大值的任意的值。
[0065]
p(t)＝[(d(t)-dmin)/drange]
×aꢀꢀꢀ
(1)
[0066]
作为一个例子，图6中表示以图4所示的凝固反应曲线成为最大值100的方式校正的数据。应予说明，图6中校正后的值从0校正到100，但也可以为其它的值(例如从0到10000，即式(1)中a＝10000)。另外，该校正处理不一定必须进行。
[0067]
或者，上述的校正处理可以对后述的与凝固速度有关的波形、或者从该波形提取的参数进行。例如对于未进行校正处理的预处理后的凝固反应曲线d(t)算出与凝固速度有关的波形后，可以将其变换为相对于p(t)的值。或者从该与凝固速度有关的波形提取参数后，可以将该参数的值变换为与p(t)相当的值。
[0068]
在本说明书中，将上述的校正凝固反应曲线以及未进行校正处理的凝固反应曲线分别称为校正0阶曲线和未校正0阶曲线，并且将它们统称为“0阶曲线”。并且，在本说明书中，将该校正0阶曲线和该未校正0阶曲线的一阶微分曲线分别称为校正一阶曲线和未校正一阶曲线，并且将这些统称为“一阶曲线”。
[0069]
2.2)与凝固速度有关的波形的算出
[0070]
在步骤2d中，算出与凝固速度有关的波形。在本说明书中，该与凝固速度有关的波形包含未校正一阶曲线和校正一阶曲线。未校正一阶曲线表示将凝固反应曲线(未校正0阶曲线)进行一阶微分而得到的值，即任意的凝固反应时间中的凝固反应量的变化率(凝固速度)。校正一阶曲线表示将校正凝固反应曲线(校正0阶曲线)进行一阶微分而得到的值，即任意的凝固反应时间中的凝固反应量的相对变化率。因此，该与凝固速度有关的波形可以是表示试样的凝固反应的凝固速度或者其相对值的波形。在本说明书中，可以将表示由一阶曲线表示的包含该凝固速度及其相对值的血液凝固的进行的值统称为一阶微分值。凝固反应曲线或者校正凝固反应曲线(未校正以及校正0阶曲线)的微分可以使用公知的方法进行。图7表示将图6所示的校正0阶曲线进行一阶微分而得到的校正一阶曲线。图7的横轴表示凝固反应时间，纵轴表示一阶微分值。
[0071]
2.3)参数的提取
[0072]
在步骤2e中，进行对该与凝固速度有关的波形标记特征的参数的提取。更详细而言，在该参数的提取工序中，从该与凝固速度有关的波形提取规定的运算对象区域，接着，算出关于该运算对象区域的加权平均时间。基于该加权平均时间，可以确定被测样本的血液凝固时间(步骤3)。该参数如下进行说明。
[0073]
首先，对从与凝固速度有关的波形提取规定的运算对象区域的顺序进行说明。运算对象区域是指该与凝固速度有关的波形中该波形为规定的下限值以上的区域。更详细而
言，运算对象区域在将与凝固速度有关的波形(一阶曲线)设为f(t)(t＝时间)，将f(t)的最大值设为vmax时，满足f(t)≥vmax
×
x％的f(t)的区域(部分)。更详细而言，该运算对象区域是满足vmax≥f(t)≥vmax
×
x％的一阶曲线f(t)的区域(部分)。因此，“vmax
×
x％”表示运算对象区域的下限值。参照图8对运算对象区域进行说明。图8中表示了一阶曲线f(t)(t＝时间)和f(t)的最大值vmax。另外，表示vmax
×
x％的基线由虚线图示，表示了f(t)＝vmax
×
x％的时刻t1、t2。运算对象区域是f(t)为基线以上且vmax以下(f(t)≥vmax
×
x％，t1≤t≤t2)的区域。
[0074]
加权平均点(vt,vh)相当于运算对象区域的“加权平均值”。将加权平均点的凝固反应时间(t)设为加权平均时间vt。即加权平均时间vt是从凝固反应开始时间到加权平均点的时间，是加权平均点的x坐标。另外，vt是相对于运算对象区域的横轴向的重心。加权平均高度vh是加权平均点的y坐标。
[0075]
在本说明书中，有时将基于规定的下限值的运算对象区域、以及来自于该运算对象区域的vt和vh基于相对于该下限值的vmax的百分率表示。例如有时将vmax的x％为下限值的运算对象区域称为“x％运算对象区域”，并且有时将来自于该“x％运算对象区域”的vt和vh分别称为vtx％和vhx％。例如下限值为vmax的20％的运算对象区域可以被称为20％运算对象区域，该运算对象区域的vt由vt20％表示。图8中表示了下限值x％的f(t)的运算对象区域的加权平均点(vtx％，vhx％)。
[0076]
对于一阶曲线的加权平均时间vt和加权平均高度vh可以按照以下的顺序求出。首先，一阶曲线f(t)的最大值为vmax，运算对象区域的下限值为vmax的x％，满足f(t)≥vmax
×
x％的时间t的数据组设为t[t1,
…
t2](t1＜t2)。即，f(t1)＝vmax
×
x％，f(t2)＝vmax
×
x％，时刻t1～t2的数据组为t[t1,
…
t2](t1＜t2)。此时，加权平均时间vt和加权平均高度vh分别由下式(2)和(3)算出。根据求出的vt和vh，导出x％运算对象区域的加权平均点(vtx％,vhx％)。
[0077][0078][0079]
运算对象区域的下限值可以由比vmax的0％大且小于vmax的范围确定。运算对象区域反映一阶曲线的形状，下限值越大，运算对象区域越反映一阶曲线的更上部的形状。在本发明的方法中，用于算出在凝固时间的测定中使用的加权平均时间的运算对象区域的下限值(“vmax
×
x％”)优选为在vmax的5～95％(即x＝5～95)的范围设定的规定值。更详细而言，用于算出在凝固时间的测定中使用的加权平均时间的运算对象区域的下限值在凝固时间为aptt的情况下优选为vmax的5～95％(x＝5～95)，更优选为vmax的5～50％(x＝5～50)，进一步优选为在vmax的10～35％(x＝10～35)的范围设定的规定值，在凝固时间为pt的情况下，在优选为vmax的5～95％(x＝5～95)，更优选为vmax的10～80％(x＝10～80)，进一步优选为vmax的25～50％(x＝25～50)的范围设定的规定值。
[0080]
图9中表示一阶曲线的运算对象区域与算出的加权平均点的关系。图9中，上段、中段以及下段表示下限值分别为vmax的5％、40％和75％时的一阶曲线的运算对象区域和加
权平均点(黑圆圈)。伴随着运算对象区域的变化，加权平均点的位置如图9所示发生变化。
[0081]
在上述的图8、9中，将校正一阶曲线作为例子，对运算对象区域以及其加权平均点进行了说明，但即使在未校正一阶曲线中也可算出相同的参数。
[0082]
3.凝固时间测定
[0083]
如后述的实施例所示，按照上述的顺序算出的加权平均时间vt与被测样本的血液凝固时间具有高相关性。因此，能够基于该加权平均时间vt来确定被测样本的凝固时间。例如在凝固时间为aptt、pt的情况下，可以将该加权平均时间vt确定为凝固时间。在本发明的方法中，通过求出凝固反应的一阶曲线的加权平均，从而与单纯地检测一阶曲线的峰的情况相比，不易受到由测量噪声、凝固异常导致的多峰性峰等影响，能够实现可靠性更高的凝固时间测定。
[0084]
另外，在本发明的方法中，在凝固反应的一阶曲线达到最大值vmax后，能够在成为运算对象区域的下限值(vmax
×
x％)以下时测定凝固时间。因此，在本发明的方法中，可以可以不用像以往的百分率法那样持续测量到凝固反应达到稳定。并且即使在利用自动分析装置分析多样本的情况下，根据本发明的方法，也不需要如以往的百分率法那样在凝固能力低的异常样本中设置而设定较长的测量时间。因此，根据本发明，可以使样本的分析时间缩短化或者最佳化而提高分析的效率。
[0085]
4.凝固因子浓度测定
[0086]
通常的血液中包含凝固第i～第xiii因子等凝固因子，这些凝固因子的异常、缺乏导致凝固能力的异常。通常，被测样本的凝固因子浓度可以使用针对凝固因子的专用试剂，基于由该被测样本制备的测定试样的凝固时间进行测定。因此，利用本发明的方法，能够使用基于加权平均时间进行测定的该测定试样的凝固时间，测定该被测样本的凝固因子浓度。通常，凝固因子浓度基于表示凝固时间与凝固因子浓度的关系的标准曲线进行测定。因此，通过对预先制作的标准曲线应用利用本发明的方法测定的测定试样的凝固时间，能够测定该被测样本的凝固因子浓度。作为本发明的方法中测定的凝固因子的优选的例子，可举出第i因子(纤维蛋白原)、第viii因子、第ix因子等。
[0087]
在本发明的方法中，用于算出在凝固因子浓度的测定中使用的凝固时间(加权平均时间)的运算对象区域的下限值(“vmax
×
x％”)，优选是在vmax的5～95％(即x＝5～95)的范围设定的规定值，更优选为vmax的30～95％(即x＝30～95)，进一步优选为vmax的60～75％(即x＝60～75)的范围设定的规定值。
[0088]
5.对其它的凝固反应测量法的应用
[0089]
以上，将基于散射光量的凝固反应测量的情况作为例子，说明本发明的血液凝固时间测定方法。然而，如果为本领域技术人员，能够将本发明的方法应用于使用了其它的凝固反应测量法(例如基于透射度、吸光度、粘度等的血液凝固反应测量法)的血液凝固时间测定方法。例如由基于透射光量的反s状的凝固反应曲线得到的一阶曲线f(t)相对于基于上述的散射光量，正负是相反的。在这样的情况下，在参数的计算中f(t)的符号反转，例如，最大值vmax被置换为最小值vmin，x％运算对象区域为满足f(t)≤vmin
×
x％的区域等对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0090]
实施例
[0091]
以下，举出实施例，对本发明进一步详细地进行说明，本发明并不限于这些实施
例。
[0092]
实施例1基于加权平均时间的凝固时间(aptt)测定
[0093]
1.方法
[0094]
1.1)试样
[0095]
作为被测样本，使用了正常血浆9个样本、aptt延长的异常血浆15个样本的合计24个样本。正常血浆使用了clinisys associates,ltd.制的normal donor plasma。就异常血浆而言，作为缺乏凝固因子的血浆(factor deficient plasma)，缺乏第fviii因子的血浆、缺乏第fix因子的血浆、缺乏第fxi因子的血浆和缺乏第fxii因子的血浆使用了各2个样本，狼疮抗凝剂阳性血浆(lupus anticoagulant plasma)使用了2个样本，以及未分级的含肝素的血浆(anticoagulant plasma)使用了5个样本(均为clinisys associates,ltd.制)。
[0096]
1.2)试剂
[0097]
作为aptt试剂，使用coagpia aptt-n(积水医疗株式会社制)。
[0098]
1.3)凝固反应测量
[0099]
凝固反应测量使用血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)进行。将样本50μl分注到到比色皿(反应容器)后，在37℃加热45秒钟，接着，在比色皿中添加加热到约37℃的aptt试剂50μl，另外，在经过171秒后，添加氯化钙液50μl而开始凝固反应。反应在维持在约37℃的状态下进行。凝固反应的测量(测光)是通过将以波长660nm的led光为光源的光照射到比色皿，以0.1秒间隔对90度侧方散射光的散射光量进行测光而进行。最大测量时间为360秒(数据数3600个，0.1秒间隔)。
[0100]
1.4)aptt测定(百分率法)
[0101]
通过百分率法，测定各样本的aptt。即，在测量时间内，将散射光量达到最大值的时刻确定为凝固反应结束点，将凝固反应结束点的达到散射光量的50％的时刻确定为aptt。将被测样本的种类和数量以及各种类的样本中的aptt的最小值以及最大值示于表1。
[0102]
[表1]
[0103][0104]
1.5)凝固反应曲线的制作
[0105]
在对来自各样本的测光数据，进行包含除去噪声的平滑化处理后，以测光开始时刻的散射光量成为0的方式进行零点调整处理，算出凝固反应曲线p(t)。接着，以凝固反应曲线的最大值pmax成为100的方式进行校正，将得到的校正凝固反应曲线(校正0阶曲线)进行一阶微分，算出校正一阶曲线。
[0106]
1.6)加权平均时间vt的算出
[0107]
根据从各样本得到的一阶曲线，算出对于5～95％运算对象区域的加权平均时间
(vt5％～vt95％)。将运算对象区域的下限值x％设定为一阶曲线f(t)的最大高度vmax(100％)的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％的19个阶段，分别求出满足f(t)＝vmax
×
x％的时间t1和t2(t1＜t2)。使用上述式(2)，根据各个24个样本，算出19个加权平均时间vt5％～vt95％。
[0108]
2.基于加权平均时间的aptt测定
[0109]
2.1)加权平均时间与aptt的相关性
[0110]
对基于百分率法的aptt与加权平均时间的相关性进行了评价。对于针对5～95％运算对象区域的各个加权平均时间(vt5％～vt95％)，进行基于与百分率法的aptt的线性回归分析，求出回归直线的斜率、截距以及相关系数。
[0111]
图10中表示了20％运算对象区域中的vt20％相对于针对24个样本的基于百分率法的aptt的线性回归直线。vt20％针对基于百分率法的aptt具有高度相关性。图11中表示5～95％运算对象区域中的vt(vt5％～vt95％)相对于百分率法aptt的线性回归直线的斜率、截距以及相关系数。在5～95％运算对象区域的区间，回归直线的倾斜为0.95～1.01，截距为-2.0～0.4，相关系数为0.998～1.000(图11a～c)。可以确认在运算对象区域从5％到95％的全部的条件下，基于加权平均时间的aptt测定法具有满足日本厚生劳动省的体外诊断用医药品承认基准“与对照测定方法比较，相关系数为0.9以上，并且回归直线式的斜率为0.9～1.1”的性能。由这些结果表示能够基于vt来测定aptt。
[0112]
2.2)测定的正确性
[0113]
将对于24个样本的5～95％运算对象区域中的加权平均时间与对照(基于百分率法的aptt)进行了比较。图12ab的表的各行表示各样本的加权平均时间(vt5％～vt95％)，加权平均时间与对照之差进入到对照的
±
5％以内(图12a)和
±
2.5％以内(图12b)的情况下，由灰色表示。在5～50％运算对象区域中，全部的样本的加权平均时间以
±
5％以内的误差与对照一致，在10～35％运算对象区域中，全部的样本的加权平均时间以
±
2.5％以内的误差与对照一致。
[0114]
实施例2基于加权平均时间的凝固时间(pt)测定
[0115]
1.方法
[0116]
1.1)试样
[0117]
作为被测样本，使用正常血浆9个样本和pt延长的异常血浆14个样本的合计23个样本。正常血浆使用健康人血浆。异常血浆使用给与了抗凝药的华法林的患者血浆，使用了表示血中华法林浓度的pt-inr值为1到2的5个样本、2到3的5个样本、以及3到4的4个样本。
[0118]
1.2)凝固反应测量
[0119]
凝固反应测量使用血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)进行。在将样本50μl分注到比色皿(反应容器)后，在37℃加热45秒钟，接着在比色皿中添加加热到约37℃的促凝血酶原激酶液100μl开始凝固反应。反应在维持在约37℃的状态下进行。凝固反应的测量(测光)将以波长660nm的led光为光源的光照射到比色皿，以0.1秒间隔对90度侧方散射光的散射光量进行测光而进行。最大测量时间为300秒(数据数3000个，0.1秒间隔)。
[0120]
1.3)pt测定(百分率法)
[0121]
通过百分率法，测定各样本的pt。在测量时间内，将散射光量达到最大值的时刻确定为凝固反应结束点，将达到凝固反应结束点的散射光量的45％的时刻确定为pt。将被测样本的种类和数量和各种类的样本中的pt的最小值和最大值示于表2。
[0122]
[表2]
[0123][0124]
1.4)加权平均时间vt的算出
[0125]
利用与实施例1的1.5)和1.6)相同的顺序，算出23个样本的校正一阶曲线，算出加权平均时间vt5％～vt95％。
[0126]
2.基于加权平均时间的pt测定
[0127]
2.1)加权平均时间与pt的相关性
[0128]
按照与实施例1的2.1)相同的顺序，对于5～95％运算对象区域的各加权平均时间(vt5％～vt95％)，进行与利用百分率法测定的pt的线性回归分析，求出回归直线的斜率、截距以及相关系数。
[0129]
图13中表示了30％运算对象区域的vt30％相对于针对23个样本的基于百分率法的pt的线性回归直线。vt30％与基于百分率法的pt具有高相关性。图14表示5～95％运算对象区域的vt(vt5％～vt95％)的相对于百分率法pt的线性回归直线的斜率、截距以及相关系数。在5～95％运算对象区域的期间，回归直线的倾斜为0.94～1.05，截距为-0.1～0.7，相关系数全部为1.000(图14a～c)。可以确认在运算对象区域从5％到95％的全部的条件中，基于加权平均时间的pt测定法具有满足日本厚生劳动省的体外诊断用医药品承认基准“与对照测定方法比较，相关系数为0.9以上且回归直线式的倾斜为0.9～1.1”的性能。由这些结果表示能够基于vt来测定pt。
[0130]
2.2)测定的正确性
[0131]
将对于23个样本的5～95％运算对象区域的加权平均时间与对照(基于百分率法的pt)进行了比较。图15ab的表的各行表示各样本的加权平均时间(vt5％～vt95％)，加权平均时间与对照之差落入对照的
±
5％以内(图15a)和
±
2.5％以内(图15b)的情况下，由灰色表示。在10～80％运算对象区域中，全部的样本的加权平均时间以
±
5％以内的误差与对照一致，在25～50％运算对象区域中，全部的样本的加权平均时间以
±
2.5％以内的误差与对照一致。
[0132]
实施例3基于加权平均时间的纤维蛋白原浓度测定
[0133]
1.方法
[0134]
1.1)试样
[0135]
在人纤维蛋白原除去血浆(affinity biologicals inc.制的fibrinogen deficient human plasma，制品名：fg deficient plasma)中添加人纤维蛋白原(enzyme research laboratories制的human fibrinogen，制品名：fib 2)，制成纤维蛋白原浓度
([fbg])为980mg/dl的样本(样本10)。作为用于制成标准曲线的标准样本，将样本10和生理食盐水以容量比1∶9、7∶3和10∶0进行混合，制备纤维蛋白原浓度([fbg])分别为98mg/dl、686mg/dl以及980mg/dl的这三种样本。另外，将样本10和所述人纤维蛋白原除去血浆以从容量比1∶9到10∶0进行混合，制备纤维蛋白原浓度([fbg])阶段性不同的10个浓度系列样本(表3)。
[0136]
[表3]
[0137]
样本稀释比率[fbg](mg/dl)11∶99822∶819633∶729444∶639255∶549066∶458877∶368688∶278499∶18821010∶0980
[0138]
1.2)凝固反应测量
[0139]
纤维蛋白原测定试剂使用附属于coagpiafbg(积水医疗株式会社制)的凝血酶试剂和样本稀释液。凝固反应测量使用血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)进行。将样本10μl和样本稀释液90μl分注到比色皿，在37℃加热45秒钟后，向比色皿中添加加热到约37℃的凝血酶试剂50μl，开始凝固反应。反应在维持在约37℃的状态下进行。凝固反应的测量将以波长660nm的led光为光源的光照射到比色皿，以0.1秒间隔测定90度侧方散射光的散射光量进行。最大测量时间为300秒(数据数3000个，0.1秒间隔)。凝固反应的测量针对3个标准样本和10个浓度系列样本分别各进行2次。
[0140]
1.3)基于凝固时间测定(百分率法)的纤维蛋白原浓度的算出
[0141]
通过百分率法，测定3个标准样本和浓度系列10个样本的凝固时间。即，将达到凝固反应结束点的散射光量的63％的时刻确定为凝固时间。各样本的凝固时间基于2次凝固反应测量，分别测定2次。对于由3个标准样本测定的凝固时间，算出2次测定的平均值，将该平均值的对数相对于该标准样本的[fbg](mg/dl)的对数制成图，制成由百分率法得到的标准曲线。根据制作的标准曲线，算出各浓度系列样本的纤维蛋白原浓度(基于百分率法的[fbg]运算值，mg/dl)。
[0142]
1.4)基于加权平均时间vt算出纤维蛋白原浓度
[0143]
利用与实施例1的1.5)和1.6)相同的顺序，针对10个浓度系列样本分别算出各2次加权平均时间vt5％～vt95％，得到20个样本成分的加权平均时间的数据。另外，对于3个标准样本，分别算出各2次加权平均时间vt5％～vt95％，算出2次测定的平均值。将该平均值的对数相对于该标准样本的[fbg](mg/dl)的对数制成图，制成基于加权平均时间的标准曲线。根据制作的标准曲线，算出各浓度系列样本的纤维蛋白原浓度(基于加权平均时间的[fbg]运算值，mg/dl)。
[0144]
2.基于加权平均时间的纤维蛋白原浓度测定的评价
[0145]
2.1)相关性解析
[0146]
图16中表示了基于浓度系列样本的数据(n＝10
×
2)的、相对于基于百分率法的[fbg]运算值的、由35％运算对象区域的vt35％算出的基于加权平均时间的[fbg]运算值(mg/dl)的线性回归直线。基于vt35％的[fbg]运算值与基于百分率法的[fbg]运算值具有高相关性。图17中表示由5～95％运算对象区域的vt(vt5％～vt95％)算出的[fbg]运算值的、相对于基于百分率法的[fbg]运算值的线性回归直线的斜率、截距以及相关系数。在5～95％运算对象区域的期间，回归直线的斜率为0.94～1.02，截距为-31.5～51.0，相关系数为0.990～0.996(图17a～c)。在运算对象区域从5％到95％为止的全部的条件下，基于加权平均时间的纤维蛋白原浓度测定法带来了与基于百分率法的标准的方法同等的结果，因此可确认具有满足日本厚生劳动省的体外诊断用医药品承认基准“与对照测定方法比较，相关系数为0.9以上，并且回归直线式的斜率为0.9～1.1”的性能。由这些结果表示能够基于vt来测定纤维蛋白原浓度。
[0147]
2.2)测定的正确性
[0148]
将针对浓度系列样本的数据(表3的10样本
×
2)的基于5～95％运算对象区域的加权平均时间的[fbg]运算值与期待值(表3所示的样本的fbg浓度)进行了比较。图18ab的表的各行表示各样本的加权平均时间(vt5％～vt95％)，基于加权平均时间的[fbg]运算值与期待值的误差落入
±
10％以内(图18a)和
±
5％以内(图18b)的情况下，由灰色表示。在30～95％运算对象区域中，全部的样本的[fbg]运算值的误差为
±
10％以内，在60～75％运算对象区域中，全部的样本的[fbg]运算值的误差在
±
5％以内。