皮肤屏障功能、4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物以及相关物质的筛选方法与流程

lipolytica)，山茶科山茶属植物为茶树，蔷薇科蚊子草属植物为旋果蚊子草，唇形科薄荷属植物为薄荷。
11.[3]根据上述[1]或[2]所述的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，蔷薇科蔷薇属植物为包含选自花翠素型花色苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飞燕草素苷化合物中的1种以上化合物的蔷薇花瓣，山茶科山茶属植物为茶树的叶，蔷薇科蚊子草属植物为旋果蚊子草的花，唇形科薄荷属植物为薄荷全株。
[0012]
[4]一种皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，包含金缕梅科金缕梅属植物的萃取物及/或车前草科车前草属植物的萃取物作为有效成分。
[0013]
[5]根据上述[4]所述的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，金缕梅科金缕梅属植物为金缕梅，车前草科车前草属植物为大车前草。
[0014]
[6]根据上述[4]或[5]所述的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，金缕梅科金缕梅属植物为金缕梅的叶，车前草科车前草属植物为大车前草种子。
[0015]
[7]根据上述[4]～[6]中任一项所述的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，介由基底膜功能的下降抑制或改善来抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。
[0016]
[8]根据上述[7]所述的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，基底膜功能的下降抑制或改善是介由4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善。
[0017]
[9]一种皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，包含基底膜功能的下降抑制或改善剂作为有效成分。
[0018]
[10]根据上述[9]所述的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，基底膜功能的下降抑制或改善剂是介由4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善来抑制基底膜功能的下降或改善基底膜功能。
[0019]
[11]一种4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，包含选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、金缕梅科金缕梅属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物、车前草科车前草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物作为有效成分。
[0020]
[12]根据上述[11]所述的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，蔷薇科蔷薇属植物为蔷薇，耶氏酵母(yarrowia)属酵母为解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)，山茶科山茶属植物为茶树，金缕梅科金缕梅属植物为金缕梅，蔷薇科蚊子草属植物为旋果蚊子草，车前草科车前草属植物为大车前草，唇形科薄荷属植物为薄荷。
[0021]
[13]根据上述[11]或[12]所述的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物，其特征在于，蔷薇科蔷薇属植物为包含选自花翠素型花色苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飞燕草素苷化合物中的1种以上化合物的蔷薇花瓣，山茶科山茶属植物为茶树的叶，金缕梅科金缕梅属植物为金缕梅的叶，蔷薇科蚊子草属植物为旋果蚊子草的花，车前草科车前草属植物为大车前草种子，唇形科薄荷属植物为薄荷全株。
[0022]
[14]根据上述[1]～[13]中任一项所述的组合物，其特征在于，其为皮肤外用剂。
[0023]
[15]根据上述[1]～[14]中任一项所述的组合物，其特征在于，其为化妆品。
[0024]
[16]一种选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵
母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物的使用，其特征在于，用于通过4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善来抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。
[0025]
[17]一种金缕梅科金缕梅属植物的萃取物及/或车前草科车前草属植物的萃取物的使用，其特征在于，用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。
[0026]
[18]一种选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、金缕梅科金缕梅属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物、车前草科车前草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物的使用，其特征在于，用于抑制4型胶原蛋白表达的下降或改善所述表达。
[0027]
[19]一种通过4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善来抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能的方法，其特征在于，投用选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物。
[0028]
[20]一种抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能的方法，其特征在于，投用金缕梅科金缕梅属植物的萃取物及/或车前草科车前草属植物的萃取物。
[0029]
[21]一种抑制4型胶原蛋白表达的下降或改善所述表达的方法，其特征在于，投用选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、金缕梅科金缕梅属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物、车前草科车前草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物。
[0030]
[22]一种具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质的筛选方法，其特征在于，包含，
[0031]
将人类表皮角化细胞在体外以含受试物质的培养基或不含所述受试物质的对照培养基进行培养的工序，以及，
[0032]
将以含所述受试物质的培养基培养的皮肤细胞及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量进行比较的工序，当以含所述受试物质的培养基培养的皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量多于所述对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量时，选择所述受试物质作为具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质。
[0033]
根据本发明，可提供一种能够抑制皮肤屏障功能的下降或改善该功能的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物。此外，根据本发明，可提供一种4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物。此外，根据本发明，可提供一种抑制皮肤屏障功能的下降或改善该功能的方法以及抑制4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达的方法。根据本发明，可提供一种具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质的筛选方法。
具体实施方式
[0034]
本发明的第一种形式为一种4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物，其包含选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、金缕梅科金缕梅属植物的萃取物、蔷薇科蚊子
草属植物的萃取物、车前草科车前草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物作为有效成分。也将本发明的第一种形式的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物称为本发明的第一种形式的组合物。
[0035]
上述萃取物，具有抑制4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达的作用。4型胶原蛋白表达的下降抑制，包含抑止4型胶原蛋白表达下降的进展，维持4型胶原蛋白的表达，减轻(缓和)4型胶原蛋白表达下降的程度等。4型胶原蛋白表达的改善，包含使4型胶原蛋白的表达恢复等。恢复包含至少部分地恢复。就4型胶原蛋白的表达而言，包含编码4型胶原蛋白的基因的表达以及以4型胶原蛋白的蛋白质水平计的表达，可为它们中的任一者或两者。4型胶原蛋白，优选人类的4型胶原蛋白，更优选人类4型胶原蛋白α1链。人类4型胶原蛋白α1链，为4型胶原蛋白a1(col4a1)基因所编码的蛋白质。在一种形式中，本发明的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物，可通过抑制人类4型胶原蛋白α1链表达的下降或改善该表达，而用于抑制人类中的4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达。
[0036]
4型胶原蛋白的表达会因紫外线等外在因素或年龄增长等内在因素而下降(表达量减少)。
[0037]
如后述实施例所示，如果在表皮角化细胞中抑制4型胶原蛋白表达下降或改善表达，则皮肤的经上皮电阻值(teer)的下降会得到抑制或改善。这表示皮肤屏障功能的下降得到抑制或皮肤屏障功能得到改善。通过4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善而使皮肤屏障功能的下降得到抑制或使该功能得到改善的详细机制并未确定，但可推定：由于4型胶原蛋白为基底膜的成分，所以通过抑制或改善4型胶原蛋白表达的下降，使得基底膜功能的下降得到抑制或该功能得到改善，皮肤的恒定性得到维持，其结果，使得皮肤屏障功能的下降得到抑制或该功能得到改善。从而期待可通过抑制基底膜功能的下降或改善该功能来抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。由于上述植物或酵母的萃取物，具有优异的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善作用，因此可用于抑制基底膜功能的下降或改善该功能。
[0038]
从4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善的效果的观点出发，在本发明的第一种形式的组合物中，上述萃取物优选为选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物以及蔷薇科蚊子草属植物的萃取物中的1种以上。
[0039]
皮肤屏障功能，是指防止异物从外部侵入生物体、或防止体内的水分从皮肤过量蒸发从而维持皮肤水分的皮肤的屏障功能。皮肤屏障功能的下降抑制，包含抑止皮肤屏障功能的下降的进展、维持皮肤屏障功能、减轻(缓和)皮肤屏障功能的下降的程度等。皮肤屏障功能的改善，包含使皮肤屏障功能恢复等。皮肤屏障功能的下降，也可为年龄增长所引起的皮肤屏障功能的下降、紫外线暴露引起的皮肤屏障功能的下降等。
[0040]
如上所述，通过基底膜功能的下降抑制或改善，可抑制皮肤屏障功能的下降或改善该功能。
[0041]
本发明的第二种形式为一种皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其包含基底膜功能的下降抑制或改善剂作为有效成分。以下，也将本发明的第二种形式的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物称为本发明的第二种形式的组合物。
[0042]
作为基底膜的功能，已知为连接表皮与真皮的机械性支撑或表皮与真皮之间物质交换的选择性过滤器等功能。抑制4型胶原蛋白等基底膜成分表达的下降或改善该表达，对基底膜功能的下降抑制或改善有效。
[0043]
基底膜功能的下降抑制或改善剂，只要具有基底膜功能的下降抑制或改善作用，例如具有基底膜的构成成分表达的下降抑制或改善作用即可，没有特别限定。基底膜功能的下降抑制或改善剂，优选为介由4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善而抑制基底膜功能的下降或改善基底膜功能的物质。基底膜功能的下降抑制或改善剂，例如可使用具有4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善作用的上述植物或酵母的萃取物。在一种形式中，作为基底膜功能的下降抑制或改善剂，可使用选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、金缕梅科金缕梅属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物、车前草科车前草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物。
[0044]
上述萃取物中，作为基底膜功能的下降抑制或改善剂，优选为选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物以及蔷薇科蚊子草属植物的萃取物中的1种以上。
[0045]
本发明的第三种形式为一种介由4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其包含选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物作为有效成分。以下，也将本发明的第三种形式的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物称为本发明的第三种形式的组合物。
[0046]
在本发明的第三种形式的组合物中，上述萃取物优选为选自葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物以及蔷薇科蚊子草属植物的萃取物中的1种以上。
[0047]
本发明的第四种形式为一种皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，其包含金缕梅科金缕梅属植物的萃取物及/或车前草科车前草属植物的萃取物作为有效成分。以下，也将本发明的第四种形式的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物称为本发明的第四种形式的组合物。本发明的第四种形式的组合物，优选为含有金缕梅科金缕梅属植物的萃取物作为有效成分。
[0048]
本发明的第三种形式的组合物及第四种形式的组合物中所使用的上述萃取物，具有4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善作用。籍此，可实现基底膜功能的下降抑制或改善。在一种形式中，本发明的第三种形式及第四种形式的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，可介由基底膜功能的下降抑制或改善，而使用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。此外，本发明的第四种形式的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，可介由基底膜功能的下降抑制或改善，而使用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能，所述基底膜功能的下降抑制或改善是介由4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善。在一种形式中，本发明的第四种形式的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，可通过4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善，而使用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善。
[0049]
以下，也将本发明的第一种形式的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物、第二种形式、第三种形式以及第四种形式的皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物统称为本发明的组合物。在本发明的组合物中，也可将2种以上上述萃取物组合而作为有效成分使用。
[0050]
在本发明中，蔷薇科蔷薇属(rosaceae rosa)植物为以rosa hybrida(学名)为代表的蔷薇科蔷薇属的蔷薇。
[0051]
作为蔷薇科蔷薇属植物，优选包含选自花翠素型花色苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飞燕草素苷化合物中的1种以上的化合物的蔷薇，更优选在花瓣中包含选自花翠素型花色苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飞燕草素苷化合物中的1种以上的化合物的蔷薇。其中，优选在花瓣中包含花翠素型花色苷的蔷薇。
[0052]
花翠素型花色苷，为呈现紫色或蓝色的花瓣中大量包含的色素。作为花翠素型花色苷，可列举花翠素、二甲花翠素、矮牵牛花色素或它们经糖、酰基等修饰而得的化合物。作为包含花翠素型花色苷的蔷薇，可列举呈现蓝色系或淡紫色系色调的蔷薇，例如，
サントリーブルーローズアプローズ
(suntory blue rose applause，日本注册商标)等品种的蔷薇。蔷薇中所包含的花翠素型花色苷，例如可通过日本专利5697040号公报等中记载的方法，用hplc进行确认。
[0053]
玫瑰花青苷化合物为选自玫瑰花青苷a1、玫瑰花青苷a2及玫瑰花青苷b中的1种以上的化合物。包含玫瑰花青苷化合物的蔷薇，只要是包含1种以上上述化合物的蔷薇即可，优选为包含玫瑰花青苷a1、玫瑰花青苷a2以及玫瑰花青苷b的蔷薇。玫瑰花青苷a1为在下述通式(ⅰ)中，r1为氢原子的化合物，玫瑰花青苷a2为在下述通式(ⅱ)中，r2为氢原子的化合物，玫瑰花青苷b为在下述通式(ⅲ)中，r3为氢原子的化合物。
[0054]
[化1]
[0055][0056]
(上述式中，葡萄糖的1位羟基的配位(波浪线)表示α体与β体的互变异构性。r1表示氢原子或羟基。)
[0057]
[化2]
[0058][0059]
(上述式中，r2表示氢原子或羟基。)
[0060]
[化3]
[0061][0062]
(上述式中，r3表示氢原子或羟基。)
[0063]
作为包含玫瑰花青苷化合物的蔷薇，可列举呈现蓝色系或淡紫色系色调的蔷薇，例如紫夫人(madame violet)、紫雨(purple rain)、薰衣草(lavande)、曼哈顿蓝(manhattan blue)、尚蒂伊蕾丝(chantilly lace)、蓝月(blue moon)、黄昏(tasogare)、戴高乐(charles de caulle)、紫罗兰多莉(violet dolly)、蓝丝带(blue ribon)、青空(aozora)、x女士(lady x)、蓝宝石(blue ribbon)、纯银(sterling silver)等品种的蔷薇。这些蔷薇在花瓣中包含玫瑰花青苷化合物，故而优选。
[0064]
玫瑰飞燕草素苷化合物为选自玫瑰飞燕草素苷a1、玫瑰飞燕草素苷a2及玫瑰飞燕草素苷b中的1种以上的化合物。包含玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇，只要是包含1种以上上述化合物的蔷薇即可，优选包含玫瑰飞燕草素苷a1、玫瑰飞燕草素苷a2以及玫瑰飞燕草素苷b的蔷薇。玫瑰飞燕草素苷a1为在上述通式(ⅰ)中，r1为羟基的化合物，玫瑰飞燕草素苷a2为在上述通式(ⅱ)中，r2为羟基的化合物，玫瑰飞燕草素苷b为在上述通式(ⅲ)中，r3为羟基的化合物。
[0065]
上述玫瑰飞燕草素苷化合物，不存在于野生种的蔷薇中，其为在下述蔷薇中合成属于蓝色色素的花翠素，并在其上键合没食子酸酯或特里马素类所生成的化合物，所述蔷薇为以基因重组等方法导入编码类黄酮3’,5
’‑
羟化酶的基因(以下也称为类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因)而得的蔷薇，或以基因重组蔷薇作为亲本而得的具有类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因
的蔷薇。
[0066]
作为包含上述玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇，可使用以基因重组等方法导入了类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因的蔷薇以及以此种基因重组蔷薇作为亲本而得的具有类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因的蔷薇。作为此种蔷薇，例如可使用
サントリーブルーローズアプローズ
(suntory blue rose applause，日本注册商标)等品种的蔷薇。已知在
サントリーブルーローズアプローズ
(suntory blue rose applause，日本注册商标)的花瓣中，包含玫瑰花青苷a1、玫瑰花青苷a2及玫瑰花青苷b以及玫瑰飞燕草素苷a1、玫瑰飞燕草素苷a2及玫瑰飞燕草素苷b(例如wo2010/110382)。
サントリーブルーローズアプローズ
(suntory blue rose applause，日本注册商标)可从三得利花卉株式会社(日本东京都)获得。具有类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因的蔷薇，可由wo2010/110382等中记载的方法来制备。作为类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因，可列举wo2004/020637中所记载的源自植物的基因，例如优选为源自堇菜属三色堇(堇菜属黑色三色堇(viola spp.cv black pansy)等)的类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因等。具有类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因的蔷薇，在花瓣中包含玫瑰飞燕草素苷化合物，故而优选。此外，本说明书中所记载的学术文献及专利文献全部并入本说明书中作为参照。
[0067]
蔷薇中包含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物，例如可由wo2010/110382、wo2015/178385等中记载的方法，通过hplc-tof-ms来确认。
[0068]
葡萄种子及果皮为葡萄科葡萄属(vitaceae vitis)植物葡萄(学名vitis spp.)的种子及果皮。葡萄的品种没有特别限定，例如可列举卡本内苏维浓(cabernet saivignon)、康科德(concord)、梅洛(merlot)、麝香贝利a(muscat bailey a)等黑葡萄；夏多内(chardonnay)、甲州(koshu)等白葡萄等。其中，优选为夏多内或黑葡萄，更优选为黑葡萄，进一步优选为卡本内苏维浓、梅洛等。葡萄种子及/或果皮的萃取物中的葡萄可为1种，也可为2种以上。葡萄种子及/或果皮的萃取物，优选为葡萄种子及果皮的萃取物。
[0069]
作为耶氏酵母(yarrowia)属酵母，优选为解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物，优选为解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)的萃取物。
[0070]
作为山茶科山茶属(theaceae camellia)植物，优选为茶树(学名camellia sinensis)。
[0071]
作为金缕梅科金缕梅属(hamamelidaceae hamamelis)植物，优选为金缕梅(学名hamamelis virginiana)。
[0072]
作为蔷薇科蚊子草属(rosaceae filipendula)植物，优选为旋果蚊子草(学名filipendula ulmaria)。
[0073]
作为车前草科车前草属(plantaginaceae plantago)植物，优选为大车前草(学名plantago major)。
[0074]
作为唇形科薄荷属(lamiaceae mentha)植物，优选为薄荷(学名mentha xpiperita)。
[0075]
就植物萃取物的调制而言，可使用上述植物的任意部位，例如根、根茎、茎、叶、枝、树皮、花、种子(包含种皮、胚芽、胚乳、胚轴、子叶等)、果实(包含果肉、果皮)或它们的多种组合。可通过将植物的任意部位用溶剂进行萃取来制造植物萃取物。
[0076]
作为用于制备植物萃取物的优选部位，例如可列举以下的部位。作为本发明中的
植物萃取物，优选为植物的下述部位的萃取物。
[0077]
蔷薇科蔷薇属植物，优选花特别是花瓣。葡萄使用种子及/或果皮，优选使用种子及果皮。山茶科山茶属植物、金缕梅科金缕梅属植物优选为叶。蔷薇科蚊子草属植物优选为花。车前草科车前草属植物优选为种子。唇形科薄荷属植物优选为全株。
[0078]
上述植物的部位，可直接付诸于萃取工序，也可经粉碎、切断或干燥后付诸于萃取工序。在本发明中，植物萃取物可为将上述植物直接进行萃取而得的萃取物，也可为萃取自将该植物进行粉碎、切断或干燥而得的物质的萃取物。优选为源自将上述植物进行粉碎、切断或干燥而得的物质的萃取物。
[0079]
用于获得植物萃取物的植物的萃取方法没有特别限定，可通过植物成分的萃取中所使用的通常萃取方法来获得。萃取方法可适当设定，萃取条件也没有特别限定。例如，优选通过将上述植物在常温或加温下用溶剂(萃取溶剂)进行萃取来获得植物萃取物。在植物萃取物的调制中，作为原料的上述植物可直接付诸于萃取工序，也可经粉碎、切断或干燥后再付诸于萃取工序。
[0080]
植物萃取物的调制中使用的萃取溶剂可适当选择，可使用植物成分的萃取中通常所使用的物质。作为萃取溶剂，例如可列举水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等碳原子数1～5的一元醇；乙二醇、丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇等碳原子数2～5的多元醇；丙酮、甲基乙基酮等酮；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯；四氢呋喃、二乙醚等链状及环状醚；聚乙二醇等聚醚；角鲨烷等。它们可单独使用，也可使用将2种以上进行混合而得的混合溶剂(混合液)。作为碳原子数1～5的一元醇，优选为碳原子数1～4的物质，更优选为碳原子数2～4的物质，进一步优选为乙醇。作为碳原子数2～5的多元醇，优选为碳原子数2～4的2元或3元醇，更优选为2元醇，进一步优选为1,3-丁二醇。其中，作为萃取溶剂，优选为水、碳原子数1～5的一元醇、碳原子数2～5的多元醇、它们中的2种以上的混合溶剂，更优选为水、碳原子数2～4的一元醇或其水溶液、碳原子数2～4的2元醇或其水溶液，进一步优选为水、乙醇、乙醇水溶液、1,3-丁二醇、1,3-丁二醇水溶液，特别优选为水、乙醇水溶液或1,3-丁二醇水溶液。在一种形式中，乙醇水溶液及1,3-丁二醇水溶液，优选为乙醇或1,3-丁二醇浓度为10～98体积％，更优选为30～90体积％，进一步优选为30～70体积％。作为本发明中的植物萃取物，可适合地使用上述溶剂萃取物。
[0081]
在萃取时，可添加酸或碱来调节萃取溶剂的ph。在萃取后，优选将植物残渣(萃取后的植物体或其部分)从萃取液中去除。将植物残渣从萃取液中去除的方法没有特别限定，可列举过滤、离心分离等公知的分离方法。
[0082]
作为植物的萃取方法的一例，例如可使用以下方法。将植物直接或使其进行干燥、细碎，再加入以重量计为0.1～30倍量的萃取溶剂，在常压下于室温，优选萃取10分钟～15日、更优选30分钟～10日、进一步优选1小时～7日，或者在萃取溶剂的沸点附近，优选萃取10分钟～1日(更优选10分钟～2小时)左右之后再进行过滤而获得滤液。萃取时，可静置，也可进行适当搅拌。此外，可将所得的滤液(植物萃取液)直接作为植物萃取物，也可视需要进行稀释、浓缩或干燥等。
[0083]
在本发明中，可将由萃取而得的植物萃取液直接用作植物萃取物。此外，只要不损害本发明的效果，可通过公知方法进行稀释、浓缩或干燥，从而制成稀释液、浓缩物或粉末，也可调制成糊状来使用。作为干燥方法，例如可列举冷冻干燥、喷雾干燥等。进而，针对上述
植物萃取液、其浓缩物或干燥粉末等，在不损害本发明效果的范围内，也可视需要进一步进行脱臭、脱色等纯化。此种纯化方法，只要任意选择通常方法进行即可。
[0084]
本发明中的植物萃取物，包含由如上所述萃取方法所得的各种溶剂萃取液、其稀释液、其浓缩物或其干燥粉末、它们的纯化物。此外，萃取物可以用与萃取溶剂不同的溶剂进行稀释或溶解后使用。
[0085]
此外，上述植物萃取物已市售，也可使用市售品。
[0086]
耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物，优选耶氏酵母(yarrowia)属酵母的菌体或菌体培养物的萃取物。作为菌体或菌体培养物的萃取物，可列举对菌体或包含菌体的菌体培养物(优选菌体培养液)进行自溶处理或酶分解处理等菌体破碎处理，在培养液中等溶出酵母菌体内容物的物质(菌体破碎物)；从进行了菌体破碎处理的菌体或菌体培养物(菌体破碎物)中去除菌体残渣的物质。优选将菌体或包含菌体的菌体培养物(优选菌体培养液)进行自溶处理而得的物质。对于菌体破碎物或从其中去除菌体残渣而得的物质，视需要也可进行加热处理等灭菌处理等。上述酵母的萃取物，可为进行了此种灭菌处理等的物质。耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物的形态没有特别限定，例如可列举糊状、悬浮状、提取物状、液状、粉末状等。
[0087]
在一种形式中，作为蔷薇科蔷薇属植物的萃取物，优选为蔷薇(优选花瓣)的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。
[0088]
作为葡萄种子及/或果皮的萃取物，优选为葡萄种子及/或果皮的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。
[0089]
作为山茶科山茶属植物的萃取物，优选为茶树(优选叶)的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。
[0090]
作为金缕梅科金缕梅属植物的萃取物，优选为金缕梅(优选叶)的1,3-丁二醇萃取物或1,3-丁二醇水溶液萃取物。
[0091]
作为蔷薇科蚊子草属植物的萃取物，优选为旋果蚊子草(优选花)的1,3-丁二醇萃取物或1,3-丁二醇水溶液萃取物。作为车前草科车前草属植物的萃取物，优选为大车前草(优选种子)的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。
[0092]
作为唇形科薄荷属植物的萃取物，优选为薄荷(优选全株)的乙醇萃取物、乙醇水溶液萃取物或热水萃取物。
[0093]
本发明的组合物的形态没有特别限定，可为粉末状、颗粒状、糊状、固体状等，也可为液状，可适当选择。在本发明的组合物中，只要不损害本发明的效果，除上述萃取物外，可调配其他成分。作为其他成分，例如可列举能够在后述化妆品、饮食品、医药品、医药部外品等中使用的成分。
[0094]
本发明的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物、皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物，作为一例，可以以制剂的形态提供，但并不限定于本形态。可将该制剂直接作为组合物或制成包含该制剂的组合物来提供。在一种形式中，本发明的组合物，也可称为4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善剂、皮肤屏障功能的下降抑制或改善剂。
[0095]
本发明的第一种形式的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物，被用于抑制对象的4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达，优选被用于抑制对象的皮肤中的4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达。本发明的第二种形式，第三种形式以及第四种形式的皮肤
屏障功能的下降抑制或改善用组合物，被用于抑制对象的皮肤屏障功能的下降或改善该功能。
[0096]
本发明的组合物，例如可用于预防或改善起因于皮肤屏障功能下降、基底膜功能下降或4型胶原蛋白表达下降的不良情况。作为此种不良情况，例如可列举肌肤干燥、瘙痒、干枯、敏感肌肤、肌肤粗糙等。在一种形式中，本发明的组合物，可通过皮肤屏障功能的下降抑制或改善，或者抑制或改善皮肤中的4型胶原蛋白表达的下降，而用于预防或改善肌肤干燥、瘙痒、干枯、敏感肌肤、肌肤粗糙等。不良情况的预防，包括发病的防止、发病的延迟、发病率的下降等。不良情况的改善，包括症状的缓解、症状的好转、症状的进展抑制等。
[0097]
本发明的组合物，可使用于化妆品、饮食品、医药品、医药部外品等各种各样的用途中。本发明的组合物，可其本身为用于4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善，或者也可为用于皮肤屏障功能的下降抑制或改善的化妆品、饮食品、医药品或医药部外品等，或者还可为调配于该化妆品、饮食品、医药品或医药部外品等中而使用的素材或制剂等。
[0098]
本发明的组合物，可适当地使用例如作为皮肤外用剂。皮肤外用剂包含化妆品、医药品、医药部外品，优选为化妆品。
[0099]
本发明的组合物，也可使用作为皮肤外用剂以外的医药品或医药部外品。
[0100]
在另一实施形式中，优选将本发明的组合物制成饮食品。以下针对将本发明的组合物制成化妆品、医药品、医药部外品等皮肤外用剂、饮食品等的情况进行说明。
[0101]
将本发明的组合物等制成皮肤外用剂时，剂型等没有特别限定，例如可制成溶液、乳液、乳霜、凝胶、粉末、气溶胶、喷雾、胶囊及贴片等任意形态。皮肤外用剂，优选为化妆品。化妆品的制品形态也没有特别限定，例如可列举洗面奶、卸妆品、化妆水、美容液、面膜、乳液、乳霜、防晒品等皮肤护理化妆品；粉底、底妆、口红、眼影、眼线笔、睫毛膏、眉笔、腮红、指甲油等彩妆化妆品；洗发水、护发素、整发剂、染发剂、生发剂等头发化妆品；肥皂、沐浴露等洗净剂；入浴剂等。
[0102]
在不损害本发明效果的范围内，上述化妆品中可适当含有化妆品中可允许的载体、添加剂等成分，例如水、醇类、油剂、表面活性剂、增粘剂、金属皂、凝胶化剂、粉体、螯合剂、水溶性高分子、皮膜形成剂、树脂、包接化合物、抗菌剂、除臭剂、盐类、ph调节剂、紫外线吸收剂、除上述以外的源自动植物/微生物的萃取物、角质溶解剂、酶、激素类、其他维生素类、保湿剂、灭菌剂、抗炎剂、香料等中的1种或2种以上。化妆品，可通过一般的制造方法来制造。例如可通过将有效成分中所使用的上述萃取物及1种或2种以上可在上述化妆品中使用的成分进行混合后，加工成所期望的形态来获得。
[0103]
将皮肤外用剂制成医药品或医药部外品时，在不损害本发明效果的范围内，也可使用医药品或医药部外品中可允许的载体、添加剂等成分。作为此种成分，例如可列举赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、着色剂等中的1种或2种以上，这些可视需要使用。
[0104]
本发明的组合物，可制成上述皮肤外用剂以外的医药品、医药部外品。此种医药品或医药部外品，可经口投用，也可非经口投用。医药品或医药部外品可制成经口投用制剂(内服剂)或非经口投用制剂的形态。作为经口投用制剂的剂型，可列举液剂、片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片、胶囊剂、悬浮液、乳剂、咀嚼剂等。作为非经口投用制剂的剂型，可列举注射剂、输液剂等。此种医药品或医药部外品中，也可使用医药品或医药部外品中可允许的载体、添加剂等成分。作为此种成分，例如可列举赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化
剂、着色剂、矫味剂等中的1种或2种以上，它们可视需要使用。医药品、医药部外品，可通过一般的制造方法来制造。例如可通过将有效成分中所使用的上述萃取物及1种或2种以上可在医药品或医药部外品中使用的成分进行混合后，加工成所期望的形态来获得。
[0105]
将本发明的组合物制成饮食品时，饮食品没有特别限定，例如可列举一般的饮食品、健康食品、功能性标示食品、特定保健用食品等。饮食品的形态也没有特别限定。上述健康食品、功能性标示食品、特定保健用食品，例如也可制成液剂、片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片、胶囊剂、悬浮液、乳剂、咀嚼剂、流质食物等各种制剂形态。
[0106]
在不损害本发明效果的范围内，上述饮食品中可调配饮食品中可允许的成分，例如其他饮食品材料、可调配至饮食品中的添加剂等。此种饮食品，可通过一般的制造方法来制造。例如在饮食品的制造中，只要将在本发明中使用于有效成分中的上述萃取物调配至饮食品材料等中即可。
[0107]
在本发明的组合物为皮肤外用剂、皮肤外用剂以外的医药品或医药部外品、饮食品等任何形态的情况下，有效成分中所使用的上述萃取物的含量，在该组合物中，例如以该萃取物的干燥物换算的重量计，优选为0.0000001～100重量％，更优选为0.000001～100重量％，进一步优选为0.00001～10重量％。在包含2种以上萃取物的情况下，上述含量为其合计含量。
[0108]
本发明的组合物的使用量没有特别限定，只要是能获得皮肤屏障功能的下降抑制或改善效果、4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善效果的量(有效量)即可，可根据对象者的状态、体重、性别、年龄或其他因素等适当设定。本发明的组合物的使用量，如果为化妆品等皮肤外用剂，例如成人(60kg)每1人每1日，以有效成分中所使用的上述萃取物(干燥物换算)计，例如优选为0.01～500mg。经口投用医药品或医药部外品的情况下，投用量例如成人(60kg)每1人每1日，以上述萃取物(干燥物换算)计，例如优选为0.01～500mg。如果为饮食品，其摄取量例如成人(60kg)每1人每1日，以上述萃取物(干燥物换算)计，例如优选为0.01～500mg。可将上述量的萃取物单次或分数次进行摄取或投用。在使用2种以上萃取物的情况下，上述萃取物的量为其合计量。将包含上述萃取物的皮肤外用剂适用于皮肤的时机，摄取或投用饮食品、医药品或医药部外品的时机等没有特别限定。
[0109]
作为本发明的组合物的适用对象(也可称为投用对象)没有特别限定，可适用于人类或非人类哺乳动物等，优选人类。作为适用对象，例如可列举希望或需要皮肤屏障功能的下降抑制或改善的对象；希望或需要4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善的对象等。作为此种对象，例如可列举确实感受到肌肤干燥、瘙痒、干枯、敏感肌肤、肌肤粗糙的人。本发明的组合物，可根据其形态、剂型等以本身公知的多种方法进行摄取或投用。在一种形式中，本发明的组合物优选为适用于皮肤。
[0110]
本发明的组合物的有效成分中所使用的上述萃取物，可使用于抑制对象的4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达。上述萃取物，可使用于抑制对象的皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能，优选通过4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善而使用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。
[0111]
本发明也包含以下使用及方法。
[0112]
一种选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物
以及唇形科薄荷属植物的萃取物的1种以上的萃取物的使用，其用于通过4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善来抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。
[0113]
一种通过4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善来抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能的方法，其为投用选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物。
[0114]
一种金缕梅科金缕梅属植物的萃取物及/或车前草科车前草属植物的萃取物的使用，其用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能。
[0115]
一种抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能的方法，其为投用金缕梅科金缕梅属植物的萃取物及/或车前草科车前草属植物的萃取物。
[0116]
一种选自蔷薇科蔷薇属植物的萃取物、葡萄种子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(yarrowia)属酵母的萃取物、山茶科山茶属植物的萃取物、金缕梅科金缕梅属植物的萃取物、蔷薇科蚊子草属植物的萃取物、车前草科车前草属植物的萃取物以及唇形科薄荷属植物的萃取物中的1种以上的萃取物的使用，其用于抑制4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达。
[0117]
一种抑制4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达的方法，其为投用上述1种以上的萃取物。
[0118]
上述萃取物，优选投用(适用)于皮肤，可使用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善该功能，使用于抑制皮肤中的4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达，或使用于抑制基底膜功能的下降或改善该功能。在一种形式中，上述萃取物，可使用于起因于皮肤屏障功能的下降、基底膜的功能下降或4型胶原蛋白的表达下降的不良情况的预防或改善。上述萃取物，例如可通过皮肤屏障功能的下降抑制或改善，或者通过皮肤中的4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善，而使用于预防或改善肌肤干燥、瘙痒、干枯、敏感肌肤、肌肤粗糙等。
[0119]
在上述使用及方法中，上述萃取物、其投用的对象、萃取物的投用量及它们的优选形态等，与上述本发明的组合物中的情况相同。上述萃取物，可直接使用，也可与其他成分组合使用。还可使用本发明的组合物。上述萃取物，可以以上述皮肤外用剂、饮食品等形态使用。
[0120]
上述使用，可为治疗性使用，也可为非治疗性使用。上述方法，可为治疗性方法，也可为非治疗性方法。非治疗性是指不包含医疗行为即人类手术、治疗或诊断的概念。
[0121]
本发明的其他形式也为一种上述萃取物的使用，其用于制造皮肤屏障功能的下降抑制或改善用组合物；一种上述萃取物的使用，其用于制造4型胶原蛋白表达的下降抑制或改善用组合物。萃取物及它们的优选形态等，与上述本发明的组合物中的情况相同。
[0122]
本发明的进一步的其他形式也为一种基底膜功能的下降抑制或改善剂的使用，其用于抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能；一种抑制皮肤屏障功能的下降或改善皮肤屏障功能的方法，其为投用基底膜功能的下降抑制或改善剂。
[0123]
基底膜功能的下降抑制或改善剂及其优选形态，与上述相同。
[0124]
本发明，还包含具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质的筛选方法。针对本发明的筛选方法进行说明。
[0125]
本发明的具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质的筛选方法，包含将人
类表皮角化细胞在体外以含受试物质的培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养的工序，以及将以包含上述受试物质的培养基培养的皮肤细胞及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量进行比较的工序，在以含上述受试物质的培养基培养的皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量多于上述对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量的情况下，选择上述受试物质作为具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质。
[0126]
本发明的筛选方法中，将人类表皮角化细胞在体外以含受试物质的培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养。人类表皮角化细胞已市售，可使用市售品。
[0127]
受试物质没有特别限定，例如可列举植物萃取液、细胞萃取液、细胞培养上清、发酵产物、蛋白质、肽、维生素类、合成化合物等。这些可为已知物质，也可为新颖物质。
[0128]
将人类表皮角化细胞在体外以含受试物质的培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养的工序也称为培养工序。将以包含上述受试物质的培养基培养的皮肤细胞(也称为受试皮肤细胞)及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量进行比较的工序，也称为4型胶原蛋白表达量比较工序。
[0129]
在培养工序中，培养人类表皮角化细胞的条件没有特别限定，只要采用公知的条件即可。含受试物质的培养基，可通过将受试物质混合于培养基来调制。培养基，可使用人类表皮角化细胞的培养中所使用的物质，也可使用市售品。作为培养基的一例，可列举humedia-kb2培养基(kurabo公司制)、dmem培养基等。也可在培养基中添加胰岛素、人类egf、氢化可的松、血清、抗菌剂等。培养时间没有特别限定，只要根据培养条件等进行适当设定即可。就对照培养基而言，除了不含受试物质以外，只要使用与含受试物质的培养基相同的培养基即可。例如在含受试物质的培养基或对照培养基中，将人类表皮角化细胞优选培养1～72小时、更优选培养3～48小时即可。
[0130]
在培养工序中，也可进行紫外线照射、氧化应激负荷等应激负荷。例如，如果在紫外线照射、氧化应激负荷等应激负荷条件下进行培养，则可通过该应激所引起的皮肤屏障功能的下降抑制或在应激下的皮肤屏障功能的改善来筛选有效成分。
[0131]
在培养工序之后，进行4型胶原蛋白表达量比较工序。在上述培养后，将以含上述受试物质的培养基培养的皮肤细胞及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量进行比较。在以含上述受试物质的培养基培养的皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量多于上述对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量的情况下，选择上述受试物质作为具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质。
[0132]
4型胶原蛋白表达量，可通过测定编码4型胶原蛋白的mrna量或4型胶原蛋白的蛋白质量来进行。mrna或蛋白质量的测定，可通过公知方法进行。
[0133]
编码4型胶原蛋白的mrna量，可通过定量pcr、northern印迹、微阵列、使用荧光探针的实时成像等进行测定。4型胶原蛋白的蛋白质量，可通过免疫化学测定、质谱分析等进行测定。作为免疫化学测定，可列举enzyme linked immunosorbent assay(elisa)、蛋白质印迹检测等。就蛋白质量的测定而言，可使用市售的elisa试剂盒(my biosource公司制)等。人类的4型胶原蛋白的碱基序列或氨基酸序列(orf)为公知，碱基序列(mrna)以accession no.ah002741注册于公共数据库genbank。只要是本领域技术人员，即可容易地进行用于测定编码4型胶原蛋白的mrna量的引物设计或合成、dna扩增等。
[0134]
如上所述，可通过抑制4型胶原蛋白表达的下降或改善该表达，来实现皮肤屏障功
能的下降抑制或改善。因此，在受试皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量多于对照皮肤细胞中的4型胶原蛋白表达量的情况下，可将该受试物质判定为具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质。根据上述筛选方法，可进行具有皮肤屏障功能的下降抑制或改善作用的物质的筛选。
[0135]
实施例
[0136]
以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但并不因此限定本发明的范围。
[0137]
＜调制例1＞
[0138]
调制源自植物的萃取物。用于萃取的植物及其部位如下。
[0139]
(1)蔷薇(rosa hybrida，品种
“サントリーブルーローズアプローズ”
(suntory blue rose applause，日本注册商标)，三得利花卉株式会社)：花瓣
[0140]
(2)葡萄(vitis spp.)(卡本内苏维浓)：种子及果皮
[0141]
(3)茶树(camellia sinensis)：叶
[0142]
(4)金缕梅(hamamelis virginiana)：叶
[0143]
(5)旋果蚊子草(filipendula ulmaria)：花
[0144]
(6)大车前草(plantago major)：种子
[0145]
(7)薄荷(mentha x piperita)：全株
[0146]
上述蔷薇(品种
“サントリーブルーローズアプローズ”
(suntory blue rose applause))，为花瓣中包含花翠素型花色苷、玫瑰花青苷a1、玫瑰花青苷a2及玫瑰花青苷b以及玫瑰飞燕草素苷a1、玫瑰飞燕草素苷a2及玫瑰飞燕草素苷b的蓝色系蔷薇。
[0147]
将上述(1)～(7)的植物的破碎物浸于溶剂中进行萃取。更详细而言，针对上述(1)、(2)、(3)、(6)、(7)，将植物的破碎物浸于重量10倍量的30～90vol％乙醇水溶液中，并在室温下施加1日1次的搅拌操作，进行10分钟～7日的萃取，从而得到萃取液。针对上述(4)、(5)，使用1,3-丁二醇水溶液来代替乙醇水溶液，并用上述方法进行萃取。
[0148]
从所得的萃取液中，通过过滤去除植物残渣，得到滤液作为植物萃取液。
[0149]
将所得的植物萃取液用蒸发仪进行浓缩后，通过冷冻干燥以粉末的形式获得各植物的萃取物。将该粉末状的植物萃取物(蔷薇花瓣萃取物、葡萄种子及果皮萃取物、茶树叶萃取物、金缕梅叶萃取物、旋果蚊子草花萃取物、大车前草种子萃取物、薄荷萃取物)作为萃取物样品用于后述评价。
[0150]
＜调制例2＞
[0151]
解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)萃取物是通过培养解脂耶氏酵母并使其自溶后进行加热灭菌除菌操作，而得到粉末状的解脂耶氏酵母萃取物。
[0152]
在后述实施例中，就解脂耶氏酵母萃取物而言，使用上述粉末作为萃取物样品。
[0153]
＜实施例1＞在炎症刺激时，4型胶原蛋白的过量表达对皮肤屏障产生的影响
[0154]
制备将col4a1(refseq id：nm_001845.6)并入cmv启动子的下游而得的质粒(以下称col4a1质粒)。依照建议实验指南，将col4a1质粒、lipofectamine 3000reagent(thermo fisher scientific公司制)用opti-mem(日本注册商标)i reduced serum media(thermo fisher scientific公司制)(以下称opti-mem)进行稀释，制备质粒浓度不同的2种溶液(以下称opti-mem溶液)(质粒浓度：5μg/ml或20μg/ml)。此外作为对照，还制备添加opti-mem来代替质粒而得的溶液。
[0155]
使用humedia-kg2(以下称建议培养基)(kurabo公司制)，将正常人类成人表皮角化细胞(kurabo公司制)以3
×
104细胞/200μl/孔的浓度接种于24孔用cell culture inserts(millipore公司制)后，迅速地添加10μl的上述任一种opti-mem溶液。此外，在24孔培养板(agc techno glass(株式会社)制)内添加900μl的建议培养基。继而，在30分钟后仅针对一部分组，以终浓度成为100μm的形式添加过氧化氢水(nacalai tesque(株式会社)制)(h2o2处理)。在接种4小时后，更换成建议培养基。接种24小时后更换成通过添加cacl2而使培养基中ca
2
浓度提高至1.41mm而得的建议培养基(以下称非典型建议培养基)。每隔2～3日用非典型建议培养基进行培养基更换。
[0156]
在接种96小时后、120小时后、144小时后用millicell ers-2(merck公司制)评价经上皮电阻值(teer(ω
·
cm2))。另外在接种144小时后用isogen((株式会社)nippon gene制)将细胞溶解后，提取mrna。然后，用high-capacity cdna reverse transcription kit及rnase inhibitor合成cdna，用taqman fast universal pcr master mix(皆为thermo fisher scientific公司制)、引物进行定量pcr，评价人类4型胶原蛋白a1(col4a1)的表达量。此外，就内因性对照而言，使用eukaryotic 18s rrna。
[0157]
就用于测定col4a1表达量的引物(col4a1)、用于定量内因性对照的引物(eukaryotic 18s rrna)而言，分别使用#hs00266237_m1、#hs99999901_s1(皆为thermo fisher scientific公司制)。
[0158]
将结果示于表1及表2。将未添加质粒且未经h2o2处理组(h2o2(-)、质粒(-))的col4a1表达量设为1时的col4a1的基因表达量示于表1。在表1及2中，h2o2( )为进行了h2o2处理的组。质粒(-)表示未添加col4a1质粒，质粒( )表示添加了col4a1质粒。*表示有显著差异(p＜0.05)(dunnett
′
s test(vs未添加质粒且经h2o2处理组))。随着h2o2刺激，可见到col4a1表达量的下降，但通过导入col4a1质粒，对于h2o2刺激组而言，可确认到显著且用量依赖性的表达的下降抑制或改善(*：p＜0.05)。
[0159]
[表1]
[0160] h2o2(-)、质粒(-)h2o2( )、质粒(-)h2o2( )、质粒( )h2o2( )、质粒( )h2o
2-100μm h2o2100μm h2o2100μm h2o2质粒
‑‑
0.05μg质粒0.20μg质粒col4a1表达量1.000.6125.70*86.39*
[0161]
将接种144小时后的teer值示于表2。*表示有显著差异(p＜0.05)(dunnett
′
s test(vs未添加质粒且经h2o2处理组))。随着h2o2刺激，可见到teer的显著下降，但通过导入col4a1质粒，对h2o2刺激组而言，可确认用量依赖性的且在高用量组中显著的teer改善作用(*：p＜0.05)。
[0162]
[表2]
[0163] h2o2(-)、质粒(-)h2o2( )、质粒(-)h2o2( )、质粒( )h2o2( )、质粒( )h2o
2-100μm h2o2100μm h2o2100μm h2o2质粒
‑‑
0.05μg质粒0.20μg质粒teer(ω
·
cm2)51.00*38.3344.1950.06*
[0164]
《实施例2～9》萃取物样品的4型胶原蛋白基因表达的下降抑制或改善作用的评价
[0165]
使用建议培养基，将正常人类成人表皮角化细胞(kurabo公司制)以5
×
104细胞/
ml/孔的浓度接种于12孔培养板(agc techno glass公司制)中，培养48小时。更换成含萃取物样品的建议培养基并开始进行样品处理后，在样品处理开始起30分钟后，以终浓度成为100μm的形式添加过氧化氢水(nacalai tesque(株式会社)制)。在过氧化氢水处理开始起3小时后，更换成不含萃取物样品的建议培养基。在样品处理开始起48小时后使用rlt buffer(含有1％2-巯基乙醇)将细胞进行溶解及回收后，使用rneasy mini kit及rnase-free dnaseset(皆为qiagen公司制)萃取mrna。然后，通过与实施例1相同的方法，进行cdna合成、定量pcr，评价col4a1的表达量。
[0166]
针对对照，除了经由以终浓度为0.1％的形式添加二甲基亚砜(dmso)来代替萃取物样品而得的建议培养基处理以外，以与上述相同的方法培养细胞，并添加过氧化氢水，评价col4a1的表达量。
[0167]
实施例2～9中使用的萃取物样品，为调制例1及2中调制而得的蔷薇花瓣萃取物、葡萄种子及果皮萃取物、茶树叶萃取物、金缕梅叶萃取物、旋果蚊子草花萃取物、大车前草种子萃取物、解脂耶氏酵母萃取物或薄荷萃取物。使萃取物样品溶解于超纯水或dmso并添加至培养基中。培养基中的萃取物样品的浓度设为5～20μg/ml。此外，使之溶解于超纯水的情况下，另行添加dmso，以使所有含萃取物样品的建议培养基都成为dmso终浓度为0.1％的形式。
[0168]
将实施例2～9的结果(n＝3～4的平均值)示于表3。表3所示结果为将对照的col4a1的表达量设为100％的情况下的经萃取物样品处理的细胞中的col4a1的表达量的相对值(％)。*表示相对于对照而言有显著差异(p＜0.05)(student
′
s t-test)。此外，在萃取物样品(受试物质)的浓度为5～20μg/ml的范围内，将col4a1的表达最高的情况的结果示于表3。针对蔷薇花瓣萃取物、葡萄种子及果皮萃取物、茶树叶萃取物、金缕梅叶萃取物、旋果蚊子草花萃取物、大车前草种子萃取物、解脂耶氏酵母萃取物、薄荷萃取物，相对于对照而言，可确认抑制col4a1表达的下降或改善该表达的显著的效果(*：p＜0.05)。
[0169]
[表3]
[0170] 样品col4a1表达量显著差异实施例2蔷薇花瓣萃取物277％*实施例3葡萄种子及果皮萃取物248％*实施例4茶树叶萃取物155％*实施例5金缕梅叶萃取物151％*实施例6旋果蚊子草花萃取物271％*实施例7大车前草种子萃取物142％*实施例8解脂耶氏酵母萃取物147％*实施例9薄荷萃取物178％*
[0171]
《实施例10～15》萃取物样品的皮肤屏障功能下降抑制或改善作用的评价
[0172]
使用含萃取物样品的建议培养基，将正常人类成人表皮角化细胞以3
×
104细胞/200μl/孔的浓度接种于millicell cell culture inserts。在接种起30分钟后，以终浓度成为100μm的形式添加过氧化氢水。在接种起4小时后，更换成不含萃取物样品的建议培养基。在接种起24小时后更换成非典型建议培养基。然后，通过与实施例1相同的方法，评价经上皮电阻值(teer)。
[0173]
针对对照，除了使用以终浓度成为0.1％的形式添加dmso而得的建议培养基来代替含萃取物样品的建议培养基以外，以与上述相同的方法培养细胞，并添加过氧化氢水，评价经上皮电阻值。
[0174]
实施例10～15中使用的萃取物样品，为调制例1及2中调制而得的表4所示的萃取物。使萃取物样品溶解于超纯水或dmso并添加于培养基。培养基中的萃取物样品的浓度设为5～20μg/ml。此外，使之溶解于超纯水的情况下，另行添加dmso，以使所有含萃取物样品的建议培养基都成为dmso终浓度为0.1％的形式。
[0175]
将结果(n＝4～6的平均值)示于表4。表4所示结果为将对照的teer设为100％的情况下的经萃取物样品处理的细胞中的teer的相对值(％)。此外，在萃取物样品(受试物质)的浓度为5～20μg/ml以及测定时间为接种后96～144小时的范围内，将teer值最高的情况的结果示于表4。在6种萃取物中可确认抑制或改善teer的下降的高效果，进而，针对葡萄种子及果皮萃取物、茶树叶萃取物、金缕梅叶萃取物、旋果蚊子草花萃取物、解脂耶氏酵母萃取物，相对于对照而言可确认显著的变化(*：p＜0.05)(student
′
s t-test)。
[0176]
[表4]
[0177]
样品teer显著差异实施例10蔷薇花瓣萃取物117％ 实施例11葡萄种子及果皮萃取物119％*实施例12茶树叶萃取物114％*实施例13金缕梅叶萃取物123％*实施例14旋果蚊子草花萃取物135％*实施例15解脂耶氏酵母萃取物117％*
[0178]
已明确上述植物的萃取物及解脂耶氏酵母的萃取物，具有抑制皮肤屏障功能的下降或改善该功能的作用。