用于高角度液体电子层析成像的装置和方法与流程

1.本发明总体上涉及使用透射电子束仪器对液体介质中的样本进行研究，特别是涉及用于在此类仪器中从此类样本获得层析成像数据的装置和方法。


背景技术：

2.在透射电子束层析成像中，基本上二维数据被采集并且在数学上被重建，以揭示样本的三维内部结构和成分。
3.特别是，在所谓的“倾斜层析成像(tilting tomography)”中，在一系列样本倾斜下，从透射电子束仪器中的样本采集一系列基本上是二维的数据集，并且重建数学模型以揭示样本的三维内部结构。
4.在倾斜层析成像中，平行于倾斜轴线的重建的数学模型的分辨率仅受限于二维数据集的分辨率，而垂直于倾斜轴线(即，沿着电子束仪器的光轴)的分辨率主要受限于数据采集之间的样本倾斜间隔的大小和采集数据的总样本倾斜范围。特别是，已经认识到可靠的倾斜层析成像需要至少120度的总倾斜范围。例如，参见m.kudryashev的resolution of tomographic reconstructions in cellular imaging:electron tomography and related techniques(springer 2018)的第10章第3节以及p.a:penczek和j.frank的influence of missing fourier information on resolution in tomographic reconstructions in electron tomography methods for three-dimensional visualisation of structures in the cell(springer,2005 2d ed.)的第9章第4节。
5.不同类型的数据可以用于根据所采用的透射电子束仪器/操作模式的具体类型(例如，在成像或衍射模式下操作的透射电子显微镜(“tem”)或扫描透射电子显微镜(“stem”)、或专用电子衍射仪(“ed”))以及数据和数据采集模式的具体类型(例如，使用能量分散x射线(“edx”)检测器的x射线光谱数据、使用电子能量损失光谱仪(“eels”)的能量损失数据、使用不同电子检测器配置的衍射或成像数据、或使用电子双棱镜或其他全息能力的全息数据)进行采集的层析成像重建。因此，在适当配备和操作的仪器中进行的透射电子束层析成像(包括倾斜层析成像)可以揭示关于内部三维微观和原子级结构的信息，包括化学成分、化学键合状态、电场和磁场等。例如，参见r.k.leary和p.a.midgley的electron tomography in material science,1279到1329页,在springer handbook of microscopy(springer 2019)的第26章。
6.传统的透射电子束仪器的高真空环境仅允许研究固体和真空稳定的样本。因此，在透射电子束仪器中对液体介质中天然存在的样本(特别是生物样本)的许多研究(包括层析成像研究)通常需要复杂且耗时的样本制备过程，比如脱水、固定和染色，这些过程容易引入样本制备伪像。
7.已经开发了促进包含纳米颗粒的液体样本脱水的装置。使用这种装置，通过毛细作用将液体介质中的纳米颗粒(例如，血液溶液中的血细胞)引入到一对电子透明膜之间，通过蒸发去除液体介质，留下由电子透明膜支撑的纳米颗粒(例如，血细胞)，并且将该装置
装载到传统的电子束仪器中。例如，参见美国公开申请no.20150194288a1(national health research institutes and materials analysis technology(us)corp.)。
8.对在液体介质中自然发现的样本的其他研究依赖于所谓的低温显微术，在低温显微术中，样本在数据采集期间被迅速冷却并且被保持在接近液氮温度的固相。低温显微术需要专门改装的装备并且实施起来必然复杂且昂贵。
9.用所谓的液体槽装置对液体介质中的生物样本和非生物样本进行了一些研究，其中在透射电子束仪器中进行数据采集期间，样本保持在液体介质中。“开放式”液体槽装置允许在数据采集期间进行液体循环，例如，参见美国公开专利申请no.20120120226a1(范德堡大学)，并且可选地用于在数据采集期间进行电化学过程。尽管开放式液体槽装置可以与传统的透射电子束仪器一起使用，但是它们确实需要专门改装的样本保持器(本文也称为试样保持器)。另一方面，“封闭式”液体槽装置可以用包含感兴趣的样本的液体介质填充，被密封，并且使用标准样本保持器被引入到传统的透射电子束仪器中。例如，参见美国专利no.7,807,979(中国台湾清华大学2010)。
10.尽管在透射仪器中广泛且长期地使用电子束层析成像，并且在透射电子束仪器中越来越广泛地使用液体槽装置，但是液体介质中的样本的透射电子束层析成像(包括倾斜层析成像)很少进行并且仅有限的成功。
11.例如，在康奈尔大学图书馆2019年7月7日出版的4d liquid phase electron microscopy of ferritin by brownian single particle analysis中marchello等人描述了一种技术，在这种技术中，在液体介质中经历平移和旋转布朗运动的单个粒子被顺序地成像，而无需倾斜液体槽装置。在粒子的不同取向上获得的最终tem图像通过在数学上进行组合，以创建粒子结构的3d表示。例如，参见图1。dearnaley等人在2019年的nano lett的第19卷第10期第6734-6741页描述了在仅为90
°
(或
±
45
°
)的总角度范围内倾斜的封闭式液体槽装置中对液体介质中的样本进行tem图像采集，该液体槽装置由包含氮化硅(“sin”)膜的硅芯片特别构造而成，该氮化硅膜锁定在涂覆有塑料薄膜的cu栅格上的适当位置并且支撑液体介质中的生物样本。使用这种布置，从附着于宿主细菌的噬菌体获得图像，并且使用层析成像重建来揭示其内部三维结构，参见第6735页右侧栏至第6736页左侧栏，尽管其固有的轴向分辨率有限。
12.karakulina等人在2018年的nano lett第18卷第10期第6286-6291页描述了在配备有电极和一对电子透明sin膜的商业开放式液体槽装置中，从浸没在有机电解质中的lifepo4粒子采集在60
°
的总共可用倾斜范围内的tem衍射数据。然而，可能由于布朗运动和有机电解质的移位，数据采集期间的lifepo4粒子的移动导致所采集的衍射数据的恶化，有效的液体槽装置/样本总倾斜范围减小到仅35
°
。参见第6287页右侧栏至第6288页左侧栏。使用karakulina等人的液体槽装置采集的任何图像数据都不足以进行可靠的层析成像重建，因为总共可用的倾斜范围仅为60
°
(或
±
30
°
)。
13.中国台湾的bio ma-tek公司提供了封闭式液体槽装置，本文使用商品名“k-kit”来指代，其中硅主体支撑一对平行的电子透明sin膜，所述膜由100至5000nm的固定间隙分隔，在所述膜之间可以通过毛细作用引入液体介质，类似于上文在美国公开申请no.20150194288a1中描述的用于血液样本脱水和检查的k-kit，并且类似于也在上文美国专利申请no.7,807,979中描述的用于观察液体介质中的样本的液体槽装置。例如，参见
http://www.bioma-tek.com/bioma-tek/en/technology.php？act＝view&no＝30。然而，k-kit固有地局限于仅约80
°
(或
±
40
°
)的总样本倾斜范围，从而降低了基于从k-kit液体槽装置采集的成像数据的任何三维数学重构的可靠性。
14.美国公开专利申请no.20120120226 a1描述了另一种开放式液体槽装置，其提供仅约70
°
(或
±
35
°
)的总样本倾斜范围，申请人自己承认这将产生轴向分辨率低到无法接受的层析成像数据。(参见第[00176]段)。美国公开专利申请no.20120120226 a1反而提出了涉及样本快速倾斜的高速数据采集，作为从液体介质中的活体样本采集层析成像倾斜数据的手段。(参见id)。没有报道的定制的或商用封闭式或开放式液体槽装置允许在样本倾斜通过达至且超过120
°
(或
±
60
°
)的高角度范围期间进行数据采集。
[0015]
开发用于在大于120
°
的总角度倾斜范围内从透射电子束仪器中的液体介质中的样本获得可靠的高角度倾斜层析成像数据的装置和方法将是有利的。
[0016]
发明目标
[0017]
本发明的目的是提供制备液体介质中的样本以用于在透射电子束仪器中采集高角度层析成像数据的装置和方法。
[0018]
本发明的目的是提供用于在超过120度的总倾斜范围内从透射电子束仪器的液体介质中的样本采集高角度层析成像数据的装置和方法。
[0019]
本发明的另一个目的是提供现有技术的替代方案。


技术实现要素：

[0020]
因此，上述目的和若干其他目的用于在本发明的第一方面中通过提供一种用于在透射电子束仪器中从液体介质中的样本采集高角度范围层析成像数据的液体槽装置来获得，该液体槽装置包括主体和液体可进入体积，主体包括相对的第一主体表面和第二主体表面以及在第一主体表面和第二主体表面之间提供视线的孔，液体可进入体积由主体包围并且至少部分地包含在孔内。该液体可进入体积包含视线与液体槽装置的基本垂直的旋转轴线的交点，其中基本平行的第一电子透明膜和第二电子透明膜被设置成与旋转轴线基本等距，每个膜跨越孔并且具有形成液体槽装置的外表面的一部分的外部表面和邻接液体可进入体积的相对的内部表面。
[0021]
本发明的第一方面中的装置进一步表征为，第一膜和第二膜、主体第一表面和第二表面以及孔被配置为使得在液体槽装置围绕旋转轴线旋转通过至少120度的角度范围期间，穿过液体可进入体积的一部分的视线保持在至少10平方微米的投影可视区域上，并且该可视区域基本上在角度范围中点处于最大，而在角度范围端点处于最小。
[0022]
液体槽装置是指开放式或封闭式的槽，其中，液体介质中的样本可以与真空环境隔离，同时在透射电子束仪器中从样本采集数据。
[0023]
液体介质中的样本包括浸没在液体介质中的一个或多个样本以及在液体介质中形成悬浮液的一个或多个样本。
[0024]
高角度范围是指至少120度的角度范围。
[0025]
电子束仪器是指可以将电子束对准样本并且由此获得相互作用数据的任何仪器，包括tem、stem、电子衍射仪等。stem包括以stem模式运行的tem。这种仪器通常在60kv以上(通常为100至300kv)并且可能高达约1mv的电压下工作。
[0026]
层析成像数据是指可以在透射电子束仪器中以不同的样本旋转(本文也称为样本倾斜)在一定的角度范围内采集的任何数据，用于在层析成像重建中使用，以揭示样本的内部结构。
[0027]
高角度范围或高角度层析成像数据是指在至少120度的角度范围内采集的层析成像数据。
[0028]
数据是指可以在透射电子束仪器中从样本采集的任何类型的数据，包括并行采集的数据，比如衍射数据或成像数据，无论是明场还是暗场采集的，或者在电子探针扫描样本时顺序采集的数据，无论是否是使用能量分散x射线检测器、电子能量损失光谱仪、明场或暗场检测器等采集的。数据还可以包括借助于电子双棱镜或适于电子全息术的其他装置所采集的全息数据。
[0029]
样本是指适于在透射电子束仪器中研究的任何一个或多个物体，样本可以是生物样本，包括细菌、细胞、病毒、有机物或无机物、晶体或非晶体。样本可以包含浸没或悬浮在液体介质中的多种固体或半固体粒子，包括任何形状的粒子，比如细丝。样本还可以包括纳米尺度的物体或任何尺度的一个或多个物体，其大小可以使其被引入并且容纳在液体槽装置中的液体介质中。
[0030]
液体介质是指可以将样本保持或悬浮在其中的任何合适的有机液体或无机液体。
[0031]
主体是指液体槽装置的本体，其包围将液体介质与仪器真空隔离的膜。主体不是必须形成为单件，并且主体可以分成两个不同的部分，从而当两个部分分开时允许在电子透明膜之间引入液体介质。
[0032]
相对的第一主体表面和第二主体表面是指主体的相对侧上的表面。
[0033]
在第一主体表面和第二主体表面之间提供视线的孔是指这样一种孔，假设孔壁没有反射辐射，并且不考虑膜或膜之间的液体介质/样本对辐射的任何可能的吸收/折射，通过该孔，沿直线传播并且撞击在第一主体表面上的假想的平行辐射束(比如假想的可见光束)的至少一部分面积将穿过该孔并且从第二主体表面离开。
[0034]
液体可进入体积是指可以将包含样本的液体介质引入其中的物理空间或区域。液体可进入体积可以是可密封的，使得其可以与液体槽装置外部的空间隔离，或者可以允许位于液体槽装置外部的液体介质在高角度范围层析成像数据的采集期间循环通过液体可进入体积。该体积可以是通过毛细作用通过通向主体的外表面中的一个或多个开口的一个或多个通道或其它手段(比如将主体暂时分成两个或更多个部分)液体可进入的。
[0035]
由主体包围的液体可进入体积是指由主体围绕和支撑但未完全被主体包围的液体可进入体积，因为液体可进入体积的至少一部分由独立的(本文也称为电子透明的)第一膜和第二膜界定，并且液体可进入体积可以通过通向主体的外表面中的一个或多个开口的一个或多个通道连接到主体的外部。
[0036]
至少部分包含在孔内是指液体可进入体积可以延伸超过孔进入到主体中，通过一个或更多个通道，直至主体表面中的一个或更多个开口。
[0037]
包含视线和基本垂直的旋转轴线的交点是指这种交点位于体积内。
[0038]
旋转轴线是指一旦将液体槽装置安装在试样保持器中并且装载在透射电子束仪器中，该液体槽装置可以围绕其旋转的轴线，在本文中也称为倾斜的轴线。旋转轴线不必与液体槽装置的质心相交。
[0039]
电子透明膜是指对加速到在透射电子束仪器中通常使用的电压范围(60kv达至300kv，或在一些仪器中达至1mv)的电子具有充分的可渗透性，以允许收集可用的高角度层析成像数据。构成充分电子透明的因素不仅会根据仪器工作电压/入射电子能量而变化，还会随着仪器配置、所采集数据的类型以及特定液体介质和样本的特定研究的要求而变化。特定膜的电子透明程度将取决于构成该膜的材料及其厚度。例如，适用于许多层析成像应用的电子透明膜可以由sin构成并且具有大约30nm或10至50nm的厚度。
[0040]
具有外部表面和相对的内部表面的膜是指至少包括在其边缘处被支撑的独立的或电子透明的部分的膜。
[0041]
至少基本上是平面的是指至少当内部和外部电子透明膜表面上的压力相等时至少基本上呈平面状。
[0042]
膜的独立的或电子透明的部分可以由膜材料的具有外部表面或内部表面的区域界定，所述外部表面或内部表面邻接或固定到孔壁或主体表面上或延伸到主体本身中，并且在邻接或固定到孔壁或主体表面上或延伸到主体中的地方不一定至少基本上是平面的，而膜的独立的或电子透明的部分保持至少基本上是平面的，所述膜的部分具有形成液体槽装置的外部表面的一部分的外部表面和邻接液体可进入体积的相对的内部表面。
[0043]
跨越并且具有形成液体槽装置的外表面的一部分的外部表面和邻接液体可进入体积的相对的内部表面是指每个电子透明膜跨越整个孔宽，以便防止液体穿过孔，使得一旦根据需要将槽密封并且装载到仪器中，第一电子透明膜和第二电子透明膜一起将液体可进入体积与该透射电子束仪器的真空环境隔离。
[0044]
进行配置是指相对于彼此确定大小、形状和设置。
[0045]
投影可视区域是指沿着穿过液体可进入体积的至少一部分的视线平行投影(即没有放大)的区域。该投影是由如上所述沿直线传播的假想的平行辐射束形成的，而不是在透射电子束仪器中实际投影的区域，该区域可以被显著地放大。
[0046]
投影可视区域保持在至少10平方微米的投影可视区域以上是指当液体槽围绕旋转轴线旋转通过至少120度的角度范围时，投影可视区域保持在10平方微米以上。
[0047]
提供一种在液体槽装置围绕旋转轴线旋转通过至少120度的角度范围时能够保持至少10平方微米以上的投影可视区域的液体槽装置的优点在于，这种装置能够在液体介质中在样本的代表性的和/或统计上显著的区域上采集高角度范围层析成像数据，需要考虑可以在液体介质中引入到液体可进入体积中的样本的典型大小。
[0048]
投影可视区域基本上在角度范围中点处处于最大是指角度范围的中点接近与液体可进入体积相交的视线的长度处于最小的取向。当第一电子透明膜和第二电子透明薄膜平行时，最大投影可视区域对应于沿着第一膜和第二膜的表面法线的视线。如果角度范围关于第一膜和第二膜的表面法线对称设置，则角度范围的端点处的可视区域最小值可以相等。
[0049]
提供一种用于在高角度范围内采集层析成像数据的液体槽装置的优点包括，该液体槽装置适合于通过低对称性结构(如单斜的或其他低对称性结晶相)的衍射获得更可靠的结构确定性，这是在倒晶格空间的增加部分上进行采样的结果，并且一般来说，基于这种高角度范围数据的三维数学重建的准确度和可靠性提高，使得数学重建更紧密地对应于实际的内部样本结构。基于从这种液体槽装置获得的高角度范围数据的数学重建能够更有效
地克服投影伪像。
[0050]
在本发明的另一方面，角度范围至少为140度。
[0051]
提供一种适于在至少140度的角度范围内采集层析成像数据的液体槽装置的优点是提高了通过层析成像重建来解析样本的内部结构的能力。
[0052]
在本发明的另一方面，所保持的投影可视区域至少为100平方微米。
[0053]
提供一种在液体槽装置围绕旋转轴线旋转通过至少120度或至少140度的角度范围时能够保持至少100平方微米以上的投影可视区域的液体槽装置的优点在于，其适于在液体介质中在样本的更具代表性的和/或统计上显著的区域上采集高角度范围层析成像数据，需要考虑可以在液体介质中引入到液体可进入体积中的样本的典型大小。
[0054]
在本发明的另一方面，第一电子透明膜和第二电子透明膜至少基本上彼此平行，具有至少基本上类似的形状和大小，并且当沿着它们的公共表面法线观察时至少基本上重叠，使得它们通过沿着其公共表面法线测量的间隙彼此分开。
[0055]
至少基本上彼此平行是指接近平行或平行。
[0056]
至少基本上类似的形状和大小是指电子透明膜具有接近或相同的形状和大小。
[0057]
电子透明膜在沿着其公共表面法线观察时至少基本上重叠，使得它们通过沿着其公共表面法线测量的间隙彼此分开，这是指电子透明膜是对齐的，使得其内表面以均匀的距离、间隙分开，并且每个电子透明膜内表面的仅很小一部分不面向另一个膜的内表面的一部分。
[0058]
在本发明的另一方面，第一电子透明膜和第二电子透明膜具有沿着垂直于它们与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)相交的方向测量的宽度和沿着平行于它们与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)相交的方向测量的长度，其中宽度小于长度。
[0059]
具有宽度和长度的电子透明膜是指具有至少基本矩形形状的电子透明膜，其包括矩形电子透明膜或基本上限定在矩形内的电子透明膜，比如具有一个或更多个圆角或者一个或更多个向内或向外弯曲的侧边的电子透明膜。
[0060]
使第一电子透明膜和第二电子透明膜沿着平行于它们与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)相交的方向测量的长度大于其宽度的优点在于，对于给定的电子透明膜区域，液体槽装置可以围绕其旋转轴线倾斜到更高的角度并且仍然保持足够大的投影可视区域。
[0061]
使第一电子透明膜和第二电子透明膜沿着平行于它们与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)相交的方向测量的长度大于其宽度的另一个优点在于，对于给定的电子透明膜区域，电子透明膜宽度的相应减小可以足以减少由包含样本的液体介质和透射电子束仪器的真空环境之间的压力差所引起的电子透明膜的过度向外凸出，从而呈现包含样本的接近均匀厚度的液体介质。
[0062]
呈现包含样本的接近均匀厚度的液体介质的液体槽装置的优点包括提高了采集可用的高角度范围层析成像数据的能力以及可靠地选择第一膜和第二膜之间的间隙的能力。
[0063]
在本发明的另一方面，第一电子透明膜和第二电子透明膜具有沿着垂直于它们与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)相交的方向测量的不超过90微米的宽度和沿着平行于它们与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)相交的方向测量的至少350微米的
长度。
[0064]
具有成形为宽度不超过90微米并且长度至少350微米的这种第一电子透明膜和第二电子透明膜的液体槽装置的优点在于，电子透明膜足够窄以防止在数据采集期间过度凸出，并且电子透明膜足够长以允许在高角度范围内倾斜。
[0065]
在本发明的另一方面，第一电子透明膜和第二电子透明膜、孔和液体可进入体积进一步包括沿着与第一膜和第二膜的长度垂直的方向延伸的相对的延伸部分。
[0066]
具有这种垂直电子透明膜延伸部分(该部分可以延伸为形成具有与相交的膜相同长度的相交的正交电子透明膜)的液体槽装置的优点在于，这种液体槽装置适于从位于电子透明膜和正交延伸部分的相交区域处的液体介质中的样本的相同部分沿着正交旋转轴线采集层析成像数据。
[0067]
在本发明的另一方面，液体槽装置进一步包括可移除的填充部分，该可移除的填充部分从主体延伸并且包括与液体可进入体积液体连接的至少一个开口。
[0068]
可移除的填充部分的优点在于，可以填充液体槽装置，而不存在意外地用包含样本的液体介质将不需要的覆盖物施加到电子透明膜的外部表面上的风险。
[0069]
上述目的和若干其他目的进一步用于在本发明的另一方面中通过提供一种用于制备液体介质中的样本以在透射电子束仪器中采集高角度层析成像数据的方法来获得，该方法包括将液体介质中的样本引入到如上所述的液体槽装置的液体可进入体积中。
[0070]
如上所述将包含样本的液体介质引入液体槽装置中的优点包括能够选择电子透明膜间隙，该间隙确保样本基本上不动，并且在结晶样本的情况下，确保基本上随机的取向分布。基本上不动有利于用于高角度范围电子层析成像的所有类型的数据，而基本上随机的取向有利于衍射分析，特别是对具有低对称性的结构的衍射分析。
[0071]
该方法的另一个方面进一步包括将液体槽装置引入透射电子束仪器中，从而将液体可进入体积中的样本暴露于在透射电子束仪器中产生的入射电子束，并且在使液体槽装置围绕其旋转轴线旋转通过至少120度的角度范围时从样本采集数据。
[0072]
在高角度范围内采集层析成像数据的优点包括通过低对称性结构(如单斜的或其他低对称性结晶相)的衍射的更可靠的结构确定性，这是在倒晶格空间的增加部分上进行采样的结果，并且一般来说，基于这种高角度范围数据的三维数学重建的准确度和可靠性提高，使得数学重建更紧密地对应于实际的内部样本结构。基于高角度范围数据的数学重建更有效地克服了投影伪影。
[0073]
在其他方面，所采集的数据可以是x射线eds数据或者可以从透射穿过样本的电子采集，并且所采集的数据包括衍射、成像或eels数据或者从射束-样本相互作用中导出的任何其他信号，这些数据易于用于层析成像重建。
[0074]
具体而言，从透射穿过样本的电子收集的数据可以包括使用明场(“bf”)检测器、环形暗场(“adf”)检测器或haadf(“高角度环形暗场”)检测器(包括被配置为用作bf、adf或haadf检测器的适当设置的二维检测器)通过对来自二维检测器的区域(该区域对应于分别由bf、adf或haadf检测器收集的散射角度的范围)的信号进行积分所采集的数据。结合使用例如能量过滤器或电子双棱镜，可以从透射穿过样本的电子采集数据。
[0075]
在该方法的另一方面，层析成像重建被应用于数据以揭示样本的至少一部分的三维内部结构。
[0076]
本发明的另一方面进一步包括选择在基本平行的第一电子透明膜和第二电子透明膜之间具有间隙的液体槽装置，该间隙确保样本的大部分在数据采集期间保持充分不动，以允许可靠的层析成像重建。
[0077]
构成保持充分不动以允许可靠的层析成像重建的大部分将取决于特定实验的要求、液体介质和样本的性质以及所采集的数据的类型。
[0078]
选择在基本平行的第一电子透明膜和第二电子透明膜之间具有间隙的液体槽装置是指选择具有单个给定膜间隙的液体槽装置或者从存在于单个液体槽装置中的膜间隙的范围中选择单个给定膜间隙。
[0079]
在另一方面，其中所述样本包括多个晶体并且所述方法进一步包括选择在基本平行的第一电子透明膜和第二电子透明膜之间具有间隙的液体槽装置，该间隙确保多个晶体具有至少基本随机的取向分布。
[0080]
随机取向分布对于低对称性晶体的衍射分析特别有利，因为它允许对倒晶格空间进行更大的采样。
附图说明
[0081]
在一定程度上，附图示出了实现本发明的不同方式，它们不应被解释为局限于落入所附权利要求书的范围内的其他可能实施例。
[0082]
图1是用于在透射电子束仪器中采集高角度层析成像数据的液体槽装置的示意图。
[0083]
图2a、2b和2c是用于在透射电子束仪器中采集高角度层析成像数据的液体槽装置的倾斜的示意图。
[0084]
图3是用于在透射电子束仪器中采集高角度层析成像数据的液体槽装置的制造阶段的示意图。
[0085]
图4a和4b是用于采集高角度层析成像数据的液体槽装置的示意图，该液体槽装置被安装用于装载到透射电子束仪器中。
[0086]
图5a、5b和5c是将液体介质引入到液体槽装置中以采集高角度层析成像数据的阶段的示意图，该液体槽装置准备装载到透射电子束仪器中。
[0087]
图6a、6b、6c和6d是用于在透射电子束仪器中采集高角度层析成像数据的概念验证的液体槽装置的制造阶段的示意图。
[0088]
图7示出了使用概念验证的液体槽装置在近似140
°
倾斜范围内采集的胶束水的一系列tem图像。
[0089]
图8a示出了使用概念验证的液体槽装置在近似140
°
倾斜范围内采集的水中的气泡的一系列tem图像。
[0090]
图8b示出了图8a所示的水中的气泡的图像的层析成像重构图。
[0091]
图9a和9b是用于采集高角度层析成像数据的液体槽装置的示意图。
具体实施方式
[0092]
在下文中，用于在透射电子束仪器中采集高角度层析成像数据的液体槽装置将被称为“层析芯片(tomochip)”，并且从层析芯片中的液体介质中的样本采集高角度层析数据
以及这种数据的层析成像重建的技术将被称为高角度液体电子层析成像或“halet”。
[0093]
图1是层析芯片的实施例的示意图。尽管主体101被示出为具有整体直线形状，但是一般来说，它可以采用一系列不同的形状，如下文更详细解释的。为了便于表示，图1中所示的尺寸，包括主体101的尺寸，已经沿着标记105的方向放大，其被称为视线。本领域的技术人员将理解，与视线105垂直的主体101的侧向尺寸的上限将取决于透射电子束仪器的试样保持器的内部尺寸。例如，tem和stem试样保持器通常定尺寸为接纳直径为3mm的圆盘，而电子衍射仪可以容纳更大的样本。在tem或stem仪器的情况下，主体101将通常定尺寸为安装在3mm环形或孔状支撑件上，但是通常不一定由铜制成，如在这种仪器中通常使用的那样。相对的主体第一表面102和主体第二表面103将可以分开大约100微米，如下文所述的概念验证的层析芯片所示。然而，如下文进一步讨论的，这些表面之间的间隔可以小于或大于100微米。
[0094]
相对的第一主体表面102和第二主体表面103被示出为矩形、平面的且平行的，这种配置可能有助于将主体制造并且安装在支撑件上以及装载到电子束仪器中，但是通常不需要为矩形、平面的或平行的。例如，主体101可以使用下文概述的“mems”技术进行制造，以具有近似3mm直径圆的外部形状，从而允许将其直接装配到tem和stem试样保持器中，而无需使用3mm环形或孔状的支撑件。在第一主体表面102和第二主体表面103之间延伸的孔104被示出为对称的，在第一主体表面和第二主体表面处具有相同的矩形形状，所述孔具有对称轮廓，其中对称轮廓包括尺寸相同、角度相同、向内倾斜的平面壁，比如可以通过蚀刻单晶硅来制造，但是通常可以采用不同的形式。孔104提供视线105，即相对的第一主体表面102和第二主体表面103之间的假想的直线视图，其与液体可进入体积106相交。因此，体积106由主体包围，至少部分包含在孔104内，并且由第一和第二两个至少基本上平面状的电子透明膜109和110界定，所述每个电子透明膜横跨孔并且因此具有形成液体槽装置的外表面的一部分的外部表面和邻接液体可进入体积的相对的内部表面。虽然在图1中未示出，但是液体可进入体积106可以延伸到主体101中，远超过电子透明膜区域109和110的边缘，直到主体101的一个或更多个表面中的一个或更多个开口(未示出)。
[0095]
虽然第一电子透明膜109和第二电子透明膜110被示出为完全的矩形且平行，但是可以使用其他膜形状，膜可以基本上呈矩形形状，并且膜不必完全平行。第一电子透明膜109和第二电子透明膜110的纵横比和相对间隔不是按比例绘制的。例如，如下所述，基本平行且基本重叠的膜可以允许在高角度范围内倾斜，同时保持足够的投影可视区域，所述基本平行且基本重叠的膜具有沿着平行于它们与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)相交的方向测量的至少350微米的长度、垂直于它们的长度测量的不超过90微米的宽度，其足以在数据采集期间抑制过多的向外凸出，并且由小于100nm或大于5000nm的间隙112隔开，具有适当尺寸的主体101。一般来说，相对于液体槽装置的旋转轴线如此配置的矩形或接近矩形的膜可以具有与其宽度成甚至更大比例(达至100倍)的长度。例如，达至2000微米长的矩形或接近矩形的膜可以被容纳在主体中，并且容纳在tem或stem仪器中常用的3mm直径的试样保持器中，并且还具有小至20微米的宽度。
[0096]
如已经提到的，电子透明膜109和110可以具有最大宽度，该最大宽度抑制膜的过多向外凸出，该最大宽度达至90微米，并且因此在透射电子束仪器中保持包含样本的液体介质的接近均匀厚度的区域，从而允许在高角度范围内采集可用的层析成像数据。膜宽度
可以小于10、20、30、40、50、60、70、80或90微米并且足以抑制过度向外凸出。本领域的技术人员将理解，构成可用的高角度范围层析成像数据可以取决于所采用的特定实验条件，比如液体介质和样本的成分、膜的厚度和成分以及所采集的数据的类型。例如，从悬浮在液体介质中的样本采集的eels数据可能对向外的电子透明膜凸出更敏感，这与eds或低放大率图像数据相比增加了透射的电子路径长度。
[0097]
本领域的技术人员将进一步理解，能够充分抑制向外凸出的电子透明膜可以由合适的低原子量、低密度材料构成。这种材料的示例包括但不限于氧化硅、氮化硅和石墨烯。本领域的技术人员将进一步理解，特定的电子透明膜是否能够充分抑制向外凸出将取决于附加因素，包括膜厚度、形状和大小。例如，这种膜可以由厚度约为30nm或约为10至50nm的sin构成。例如，这种电子透明膜可以具有矩形或大致呈矩形的形状，并且这种电子透明膜具有不大于90微米的宽度，该宽度是沿着垂直于膜与平面(该平面垂直于液体槽装置旋转轴线)的相交处的方向测量的。在下文讨论的概念验证的层析芯片中，演示了在层析成像重建中使用的高角度范围层析成像数据的采集，sin电子透明膜具有大约30nm的厚度并且是25
×
300微米的矩形。可以使用其他电子透明薄膜的形状和大小。
[0098]
相反，karakulina等人在2018年的nano lett第18卷第10期第6286-6291页中使用了50nm厚的sin膜，当填充液体介质时，其最窄点处明显宽于90微米，向外凸出，足以使膜之间的间隙加倍。这种严重的向外凸出妨碍了可用的高角度范围数据的采集。参见karakulina等人在第6287页右侧栏至第6288页左侧栏中所述。此外，即使可以从这种液体槽装置中采集可用的高角度范围层析成像数据，膜严重的向外凸出也将有效地妨碍本文讨论的间隙选择的类型。
[0099]
虽然在图1中未示出，但是液体可进入体积106可以通过至少一个通道液体连接到主体的表面处的至少一个可密封开口，所述通道允许所述体积填充有包含样本的液体介质，该液体介质通常但不一定通过毛细作用进入。例如，液体可进入体积106可以形成平行侧直通道(未示出)的一部分，该通道在主体101的相对表面上的两个可密封开口之间延伸。在其他实施例中，可以通过包含电子透明膜109的主体101的可移动部分进入液体可进入体积106，从而允许引入液体，然后将电子透明膜109固定在电子透明膜110上方的适当位置。在这种布置中，可能需要包括通向主体101的表面的通道(未示出)，以从液体可进入体积106中的液体介质中释放电子透明膜109和110上的内部压力。
[0100]
液体可进入体积106包含视线105和液体槽装置的基本垂直的旋转轴线108之间的相交点107，旋转轴线108被设置成与第一电子透明膜109和第二电子透明膜110基本等距。如图1所示，旋转轴线108也可以被设置成与第一主体表面102和第二主体表面103基本等距。
[0101]
在视线105布置成与平行的第一电子透明膜109和第二电子透明膜110的表面法线垂直的情形下，沿视线的平行投影限定了投影可视区域111，当膜与视线105法向对齐并且以该视线105为中心时，可密封体积106的平行投影具有与电子透明膜109和110相同的面积，如图1所示。膜之间的间隙112将对应于以垂直入射方式撞击电子透明膜109和110的电子通过液体可进入体积106的路径长度。
[0102]
图2b示出了具有孔204的层析芯片主体，该孔例如与图1中的孔104相对应，电子透明膜209和210与图1所示的电子透明膜109和110相对应，其中平行视线221、231、241和251
穿过矩形电子透明膜209和210的拐角，从而形成与例如图1所示的投影可视区域111相对应的投影可视区域211，其具有与电子透明膜209和210相同的面积。如图2a所示，围绕旋转轴线208的旋转导致投影可视区域从211减小到218，其中拐角被示为沿着视线228、238、248和258投影，并且如图2c所示，沿相反方向旋转相等的量导致投影可视区域从211对应地减小到219，其中拐角被示为沿着视线229、239、249和259投影。如图2a和2c所示，一旦电子透明膜209和210的短边(对应于与视线241和221以及251和221的交点)开始被孔204的边缘遮蔽，减小就不仅仅是几何投影的减小。本领域的技术人员将理解，在液体槽装置围绕旋转轴线208旋转时，投影可视区域218和219作为几何形状将会连续地减小。例如，将电子透明膜209和210之间的间隙视为可忽略不计，并且将面积211乘以cos(倾斜角)，在倾斜60度时，投影可视区域218和219将比投影可视区域211小约两倍，并且在倾斜70度时，小约三倍。技术人员将进一步理解，随着倾斜角度增加，与这种几何形状的减小无关，投影可视区域218和219最终将被从电子透明膜109和110的短边侵入的主体201的一部分的阴影完全遮蔽。
[0103]
回到图1，可以配置第一电子透明膜109和第二电子透明膜110、主体第一表面102和第二表面103以及孔104，即相对于彼此设定大小、形状和布置，使得在液体槽装置围绕旋转轴线108旋转通过至少120度的角度范围期间，穿过液体可进入体积106的一部分的视线105保持在至少10平方微米的投影可视区域111的上方。一般来说，考虑到上文结合图2提到的阴影效应，对于给定的孔106的轮廓和给定的第一主体表面102和第二主体表面103之间的间隔，增加电子透明膜109和110的长度将倾向于增加远离法线入射的旋转角度，在该角度处，可以保持10平方微米或100平方微米的投影可视区域。允许在高角度范围内倾斜的另一种方法是减小第一主体表面102和第二主体表面103之间的间隔，以减少主体的遮蔽，如上文结合图2所提到的。实际上，考虑到保持刚性和机械完整性所需的电子透明膜的最大期望宽度以及在tem和stem中典型的3mm直径试样保持器中可获得的最大长度，电子透明膜的宽度和长度的比值通常不能超过1比100。
[0104]
在下文中结合概念验证的层析芯片描述第一电子透明膜109和第二电子透明膜110、主体第一表面102和主体第二表面103以及孔104的配置的示例，其中当液体槽装置围绕旋转轴线旋转通过至少140度的角度范围时，保持至少100平方微米的最小投影可视区域111。技术人员将理解，除了下文详细讨论的配置之外，许多其他配置也是可能的。
[0105]
就几何形状而言，随着层析芯片远离法线入射旋转，穿过液体可进入体积106的电子的路径长度将从膜109和110之间的最小间隙112开始连续增加。本领域的技术人员将理解，依据包括所收集的层析成像数据的类型、液体介质的成分、样本的成分和分布以及透射电子束仪器的工作电压等的因素，可用的最大路径长度将发生变化。例如，eels数据的采集可能比eds或低放大率图像数据的采集需要更短的路径长度。依据要进行的实验，膜之间的间隙(在图1中示为相对于膜109和110的间隙112)可以尽可能小，以允许携带小于100nm的样本的液体介质进入，也可以尽可能大，以提供可用数据，200、500、1000、2000、3000、4000、5000nm或更大。
[0106]
图3示出了使用通常应用于微电子或用于制造通常称为“mems”的微机电系统的各种技术来制造层析芯片的示例性过程中的一个阶段。示出了独立膜309和310，以及由主体部分321和331以及附加材料层327和337封装的膜材料区域319和390。未示出与主体的表面中的一个或更多个开口液体连接的一个或更多个通道。
[0107]
在示例性过程中，主体部分321通常由厚度略小于图1所示的第一主体表面102和第二主体表面103之间的距离的一半的硅晶圆的一部分形成。膜材料的连续层309和319可以沉积到主体部分321的前表面上，并且孔324从主体部分的后表面322敞开以暴露独立膜309的区域。然后，膜材料区域319可以用通常由氧化硅构成的附加材料层327覆盖，该附加材料层包围邻接独立膜309的区域的空间306。同样，主体部分331通常由厚度略小于图1所示的第一主体表面102和第二主体表面103之间的距离的一半的硅晶圆的一部分形成。膜材料的连续层310和390可以沉积到主体部分331的前表面上，然后孔334可以从主体部分的后表面333敞开以暴露独立膜310的区域。然后，膜材料区域390可以用通常由氧化硅构成的附加材料层337覆盖，该附加材料层包围邻接独立膜310的区域的空间306。然后，例如与图1中的101相对应的层析芯片主体可以通过结合氧化硅部分327和337来组装，如虚线箭头所示，并且因此还将包括独立膜部分309和310的主体部分321和331连接在一起，从而从空间306形成液体可进入体积，例如与图1所示的106相对应。本领域技术人员将理解，主体部分321和331可以由相同硅晶圆的不同区域形成并且可以并行处理。
[0108]
本领域技术人员将进一步理解，mems处理可能涉及厚度约为100微米的超薄晶圆或者在处理期间减小到该厚度的晶圆。本领域技术人员将进一步理解，mems处理不需要在不同晶圆上或在同一晶圆的不同区域上形成的膜的键合，比如图3中示意性示出并且在上文讨论的键合工艺，可以使用单个晶圆处理来生产如本文所述的液体槽装置，包括图9a和9b中所示的。
[0109]
优点源于mems技术固有的高精度，其允许第一膜和第二膜的精确相对对齐，从而使投影可视区域最大化。mems处理的另一个优点在于，可以形成这样一种层析芯片，其包括主体和具有各种形状的一个或多个液体可进入体积，并且其中，多于一对的矩形电子透明膜限定单个矩形观察窗口，如图1和2所示。
[0110]
图4a示出了包括正方形主体401的层析芯片，该正方形主体具有与等长正交矩形窗口412相交的矩形窗口402，从而使其适于在所谓的倾斜旋转tem试样保持器中使用，该试样保持器允许围绕正交旋转轴线的相等地倾斜，术语窗口用于指一对电子透明膜，该对电子透明膜是对齐的，以允许电子束穿过液体可进入体积的至少一部分，例如，与图1所示的电子透明薄膜109和110相对应。然而，矩形窗口402和412的长度不需要相等，从而使得层析芯片适于在更标准类型的tem试样保持器中使用，该试样保持器允许围绕一个特定旋转轴线的大的倾斜范围和围绕正交轴线的小得多的倾斜范围。如图4a所示的层析芯片可以围绕平行于窗口402和412的方向延伸的两个正交轴线在相等的倾斜范围内旋转，并且因此用于从设置在窗口402和412的相交处的液体介质中的样本获得围绕两个正交旋转轴线的层析成像数据。主体401被示出为安装在环状支撑件405上，这简化了易碎的层析芯片的处理并且牢固地装配到在大多数tem和stem仪器中使用的标准类型的3mm直径的试样保持器中。考虑到在这种仪器中使用的3mm直径的试样保持器的限制，可以将窗口402和412的长度限制为不超过约2mm。大约2000微米的最大窗口长度将允许主体厚度大到约200微米，并且仍然适应在总共超过120、130或140度的高角度范围内的倾斜，同时保持至少10或100平方微米的投影可视区域，最大可进入的倾斜范围在某种程度上取决于精确的孔轮廓。
[0111]
图4b示出了具有主体401的层析芯片，由于下文结合图5解释的原因，该主体的形状不规则，其具有矩形窗口402和三个等长的正交相交的窗口412、422和432。这种配置允许
对液体介质中的样本的三个单独区域进行正交轴线层析成像。主体再次示出为安装在支撑环405上。特征471、472、473和474可以密封主体401的表面中的开口(未示出)，该开口与窗口402、412、422和432的液体可进入体积液体连接。如下文结合图5所讨论的，每个开口分别由特征471和473密封的一对开口(未示出)可以由具有足够宽度的单个通道连接，以形成与所有三个窗口412、422和432相关联的单个液体可进入体积，并且分别由特征472和474密封的一对开口(未示出)可以由比窗口402的宽度显著地更宽的单个通道连接。
[0112]
图5示出了具有主体501的层析芯片，该主体包括三个平行的矩形窗口512、522和532，术语窗口再次用于指代一对电子透明膜。可移除的填充部分565和585分别容纳储存器569和589，该储存器适于接收包含样本的液体介质。储存器569和589经由通向通道的开口(未示出)连接，液体可以通过该通道从储存器流向窗口512、522和532。当将液体介质引入到一个或两个储存器中时，可以通过毛细作用将液体介质拉入到容纳液体可进入体积的窗口区域中，如上文详细所述，可以从其获得层析成像数据。图5b示出了已经被机械移除的可移除填充部分，该可移除的填充部分在其与主体501的相交处变窄有助于这种移除。图5c示出了特征571和572，当移除延伸部分时，所述特征571和572密封暴露的通道的开口端。虽然在图5中未示出，但是三个通道(可以是笔直的)中的每一个可以与由密封特征571堵塞的开口和由密封特征572堵塞的开口液体连接，总共给出六个开口，每个通道的每一端各一个，三个通道中的每一个都部分地形成与三个窗口512、522和532中的每一个相关联的液体可进入体积。作为替代方案，如下文结合具有可变的电子透明膜间隙的实施例所讨论的，由密封特征571堵塞的单个开口和由密封特征572堵塞的单个开口，每个开口液体连接到通道，该通道分为三个通道，这三个通道部分地形成与三个窗口512、522和532相关联的每个液体可进入体积。作为另一种替代方案，单个通道可以在571和572处的开口之间延伸，但具有足够的宽度以形成与所有三个窗口512、522和532相关联的单个液体可进入体积。本领域的技术人员将理解，通道和开口的其他配置可能具有三个平行窗口，如具有多于三个平行窗口的实施例。尽管也没有在图5中示出，但如果可填充部分包括两个储存器，每个储存器包括与每个液体可进入体积的不同端部液体连接的开口，或者甚至如果可填充部分包括单个储存器，该单个储存器包括一对开口，每个开口与每个液体可进入体积的不同端部液体连接，则可以使用具有仅一个可移除填充部分的层析芯片。
[0113]
使用这种可移除的填充部分的优点在于，它避免了包含样本的液体介质意外地从穿过主体的开口流出，并且避免了通过液体介质和样本污染电子透明膜外表面。
[0114]
图9a和9b示出了通过mems工艺(特别是单晶圆mems工艺)制造的多窗口液体槽装置的示意性顶部表面和斜视图。当从透射电子束仪器中的液体槽装置采集数据时，该“顶部”表面不需要面向上。如上所述，结合图1、2、4和5，主体901可以定尺寸为直接装配到标准3mm直径的试样保持器中，该类型的试样保持器通常用于透射电子束仪器中。虽然主体901被示出为具有八边形形状，但是也可以使用包括圆形和接近圆形的其他形状。主体901通常由硅构成，但不是必须地由硅构成。
[0115]
主体901包括边缘部分912和中心部分922以及顶部表面，边缘部分具有大约150微米的典型的均匀厚度，中心部分具有典型的均匀厚度(除了下文所讨论的)，并且顶部表面通常在边缘部分912的顶部表面下方凹陷大约50至75微米。中心部分922的底部表面(不可见)也可以是凹陷的。中心部分922在其顶部表面上包括轨道931和932，其通常但不一定由
氮化硅构成，每个轨道在其厚度内包含四个平行细长窗口中的两个，即轨道931中的905和909以及轨道932中的903和907。轨道931和932的顶部表面可以在中心部分922的表面下方凹陷、在该中心部分的表面上方凸起或者平行于该中心部分的表面。术语“窗口”再次用于指一对至少基本平行且平面的电子透明膜，该电子透明膜跨越并且密封主体中的孔，由间隙隔开并且包围液体可进入体积的至少一部分。如上所述，结合图1，中心部分922的顶部表面和底部表面之间的孔可以使用各向异性蚀刻技术在单晶硅中形成，因此可以具有从每个表面延伸的四个平面的的、可能倾斜的壁。
[0116]
中心部分922以及轨道931和932可以但不一定被配置为在边缘部分921的顶部表面和底部表面之间的中点处设置细长窗口903、905、907和909。除了在中心部分922的顶部表面和底部表面之间延伸的孔，每个孔允许视线穿过主体901，对应于窗口903、905、907和909，中心部分922也可以在轨道931和932下方或附近被减小厚度。在任何情况下，细长窗口903、905、907和909中的每一个都可以被设置为通常沿着它们的长度的每一个的大约一半包含旋转轴线908。细长窗口903、905、907和909中的电子透明膜通常由氮化硅构成，并且厚度约为25nm或30nm，尽管也可以使用厚度在大约10至100nm之间的膜厚度。细长窗口903和905中的电子透明膜之间的间隙通常可以约为1微米，而细长窗口907和909中的间隙通常可以约为0.12微米。如已经提到的，可以采用其他间隙，细长窗口907和909中的间隙可以彼此不同，并且细长窗口903和905中的间隙也可以彼此不同。
[0117]
在轨道931内，第一液体可进入通道或体积(不可见)在可密封开口943和945之间延伸，包括窗口905内的第一液体可进入体积的一部分，而第二液体可进入体积(也不可见)在可密封开口941和947之间延伸，包括窗口909内的第二液体可进入体积的一部分。类似地，在轨道932内，第三液体可进入通道或体积(不可见)在可密封开口944和946之间延伸，包括窗口903内的第三液体可进入体积的一部分，而第四液体可进入体积(也不可见)在可密封开口942和948之间延伸，包括窗口907内的第四液体可进入体积的一部分。
[0118]
虽然在图9a和9b中未示出，但是可以提供凸起的阻挡部分，以将包围每对液体可进入开口941和943、945和947、942和944以及946和948的中心部分922的顶部表面的区域与包含细长窗口903、905、907和909和参考窗口999(下文所述)的较薄中心部分922的顶部表面的其余区域分开。当相应的液体可进入体积被填充时并且在可密封开口被密封之前，凸起的阻挡部分适于防止液体溢出到电子透明膜上并且污染电子透明膜。图9a和9b中所示的液体槽装置可以适于包括独立可填充的液体可进入体积、可密封的开口和窗口的其他配置。虽然在图9a和9b中也未示出，但是可密封的开口和任何可选的凸起的阻挡部分不需要位于较薄的中心部分922的相同表面上(在该表面上，轨道931和932可见)，但是可以位于相对的表面上。在这种情况下，中心部分922的“底部”表面(图9a和9b中未示出)将成为可密封开口的位置，每个可密封开口经由穿过通常为硅的中心部分922的通道连接到对应的液体可进入体积。本领域的技术人员将理解，独立于每对可密封开口在主体901的表面上的实际位置，每对可密封开口可以定尺寸为适于引入单个液滴。
[0119]
轨道931内的第一液体可进入通道和第二液体可进入通道可以结合以形成包括窗口905和909的单个液体可进入通道。类似地，轨道931内的第二液体可进入通道和第三液体可进入通道可以结合以形成包括窗口903和907的单个液体可进入通道。在这种情况下，成对的可密封开口(941和943、945和947、942和944以及946和948)可以各自结合以形成总共
四个可密封开口，两个可密封开口位于轨道931和932的每一个中或者位于中心部分922的底部表面上，如上所述。
[0120]
窗口907和909可以各自为大约10微米宽乘2000微米长。本领域的技术人员将理解，结合厚度约为150微米的边缘部分912和定位成至少相对靠近边缘部分912的厚度的中点的窗口，这导致在液体槽装置围绕旋转轴线908远离法向入射旋转
±
80
°
(总共160
°
)的角度范围期间，液体槽装置能够在窗口907和909中保持至少10平方微米的投影可视区域。窗口903和905各自可以为20微米宽乘800微米长，这类似地导致在液体槽装置围绕旋转轴线908远离法向入射旋转
±
70
°
(总共140
°
)的角度范围期间，液体槽装置能够在窗口903和905中保持至少10平方微米的投影可视区域。可以使用较厚的边缘部分912，但是其效果是减小液体槽装置可以旋转的角度范围，并且保持至少10平方微米的投影可视区域，而不会被主体901遮蔽。
[0121]
出于校准透射电子束仪器的目的，可以包括参考窗口999，该参考窗口不与液体可进入体积相关联，但是该参考窗口可选地与旋转轴线908相交。参考窗口999不需要是矩形的，例如，它可以是具有大约150微米长边的正方形，并且不需要存在一个或两个电子透明膜。
[0122]
本文所述的液体槽装置可以用于使用可以在透射电子束仪器中在高角度倾斜范围内采集的任何类型的数据来执行高角度液体电子层析成像(“halet”)。可以根据特定实验的要求选择数据类型，这仅受特定仪器的数据采集能力和可用操作模式的限制。例如，层析成像数据可以包括x射线eds数据或者可以从透射穿过样本的电子采集，比如eels、衍射(包括进动电子衍射)或成像数据，包括显示电力的全息数据。
[0123]
这种高角度范围数据可以用于层析成像重建，这种高角度范围数据在液体槽装置围绕其旋转轴线倾斜通过高角度范围(通常从范围的一端到另一端)时通常以倾斜序列的形式获得。这种层析成像重建可以使用一系列专有/商业软件包(imod、tomoj、em3d amira、image pro discovery等)来完成，以揭示液体介质中的样本的至少一部分的三维内部结构。如下面的示例所示，内部结构包括液体介质中的样本对象的三维分布和那些样本对象的内部结构。可以使用层析芯片研究的样本的尺寸范围可以从纳米尺度变化到可以使用液体介质引入并且容纳在给定电子透明膜间隙中的大尺寸。
[0124]
层析芯片的一个令人惊讶的优点是，它能够选择电子透明膜间隙，以确保液体介质中的大部分样本在高角度范围内的数据采集期间保持充分固定，从而允许进行可靠的层析成像重建。这种能力对于采用纳米至微米大小的物体形式的样本可能特别有用，包括通常预计会呈现布朗运动或在高角度倾斜期间移动的大小范围，从而削弱高角度层析成像数据的采集。下文将进一步描述和说明这些能力。
[0125]
层析芯片的另一个优点在于，可以选择电子透明膜间隙，以允许对具有至少基本上随机取向分布的多个晶体样本进行衍射研究。无论是否需要液体介质保持样本的完整性，这种基本上随机的取向分布对于有机或无机晶体样本的研究都是有益的，并且对于使用固体支撑件进行样本制备来说可能是优选的，所述固体支撑件可以固有地产生优选的晶体取向或纹理。结合高角度范围的数据采集，这种基本上随机的取向分布对于低对称性晶体的研究可能特别有益，对于这些晶体，可能需要在很大一部分倒晶格空间上进行数据采集，例如在至少120度的范围内倾斜样本，以便获得可靠的结构分析。使用层析芯片，可以从
与液体介质相容的任何大小合适的晶体样本获得基本上随机的取向分布。因此，对于在电子衍射仪中研究的样本的取向随机化，与最近提出的聚合物包埋技术相比，层析芯片具有一定优势。wennemacher等人，《自然通讯》第10卷，文章编号：3316(2019)。
[0126]
图5a、5b和5c以及图9中示意性示出的这种类型的多窗口层析芯片可以被配置为便于选择用于特定样本的膜间隙，以确保基本固定或基本随机取向分布。例如，多窗口层析芯片可以被配置为具有用于将样本引入液体介质中的单个开口，该开口与多个平行的矩形窗口液体连接，每个窗口具有不同的膜间隙。这种配置将允许快速选择最适合特定样本研究的间隙。
[0127]
概念验证的层析芯片和halet
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作为概念验证，对从中国台湾ma-tek获得的商业k-kit槽进行机械改性，以创建层析芯片并且对液体介质中的样本进行halet研究。这种槽包括一对sin矩形膜，每个膜为25
×
300微米，由100到5000nm之间的固定间隙隔开。这对电子透明膜位于硅本体的中心。如上所述，当这种k-kit在tem中倾斜到大约
±
40
°
时，硅本体完全阻挡了电子穿过位于电子透明膜之间的液体介质和样本的传输，使得无法在更高的倾斜角度下采集数据。
[0129]
本领域的技术人员将理解，大约30nm厚的sin膜的易碎性使得对k-kit硅本体的任何机械改性都是精细且困难的过程。所得到的层析芯片也是固有地易碎的，该层析芯片具有仅约为100微米厚的硅本体，该硅本体包含与硅本体表面处的开口液体连接的液体可进入体积。
[0130]
图6a、b、c和c是对k-kit进行改性以形成层析芯片的各阶段的示意图。图6a到d中的每个图中的截面沿着k-kit槽的长度延伸，具有电子透明膜609和610，每个膜的长度约为300微米。电子透明膜609和610之间的竖直间隙(未标出)是介于100和5000纳米之间的固定距离，不是按比例绘制的。
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图6a示出了穿过k-kit硅本体601的截面，该硅本体安装在热蜡614或等同物中并且固定到表面616，以便为从本体601机械去除硅材料做准备。本领域的技术人员将理解，热蜡或等同物必须能够使用既不与硅、氧化硅也不与氮化硅相互作用的溶剂进行去除。这种蜡的一个示例是由aremco products制造的crystalbond
tm
509，它可溶于丙酮。图6a所示的未改性的k-kit的竖直高度640约为800微米。
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本领域的技术人员将理解，可以使用各种不同的精密研磨/抛光系统以各种方式进行微去除。图6b示出了在对大约350微米的k-kit硅本体601和周围的热蜡614进行精密的微机械去除之后的k-kit，留下的k-kit硅本体601的竖直厚度620约为450微米，电子透明膜609和610被封装在热蜡614内。暴露的硅表面602将形成层析芯片的表面的一部分，其对应于例如图1所示的表面102。
[0133]
在图6b和图6c之间，从表面616分离部分改性的k-kit，并且通过溶解在丙酮中去除热蜡614，可选地使用koh溶液(例如按重量算为30％的koh水溶液，室温下6-9分钟)去除粘附到电子透明薄膜609和610的表面上的任何残余硅碎片。然后改性的k-kit被倒置并且在热蜡615中安装在表面616上，使电子透明膜609面朝下。在这个阶段，使用在电子透明膜609正下方的表面616中具有匹配凹陷的表面(未示出)以使应力最小化可能是有利的。图6d示出了对另一个近似350微米的k-kit硅本体601和周围的热蜡614进行精确的微机械去除的结果，留下的k-kit硅本体601的竖直厚度630小于100微米。暴露的硅表面603将形成层析
芯片的表面的一部分，其对应于例如图1所示的表面103。然后可以从表面616分离层析芯片，并且通过溶解在丙酮中去除热蜡615，可选地使用koh溶液去除粘附到电子透明膜609和610的表面上的任何残余硅碎片。然后可以将清洁后的层析芯片安装在上文图4和图5所示类型的环形或孔状的支撑件上。
[0134]
图7示出了从如上所述制备的并且膜间隙为2000nm的层析芯片中的胶束水采集的一系列八个图像。这些图像是在100kv下运行的jeol 1400plus tem中获得的。图7a示出了在近似140
°
的总倾斜范围内的较低放大率视图，而图7b示出了在近似140
°
的总倾斜范围内的较高放大率视图，每个图像被近似20
°
的倾斜分开。可以看到结构细节在旋转过程中发生了变化，在范围的中心重叠的特征在倾斜范围的两端分离。图像特征在整个倾斜范围内也显得稳定。这种在140
°
倾斜范围内拍摄的图像适用于高分辨率层析成像重建。
[0135]
图8示出了从液态水中的气泡阵列获取的图像数据的示例，该图像数据是通过使用如上所述制备的并且膜间隙为200nm的层析芯片用高聚焦电子束照射样本而原位形成的。显微镜电压为100kv，并且倾斜范围也近似140
°
。图8a示出了在近似140
°
的总倾斜范围内采集的图像系列i至viii，每个图像被近似20
°
的倾斜分开。图8b示出了根据数据进行层析成像重建的示例，其中成像气泡的透视图示出了结构细节，包括各个气泡的形状及它们在层析芯片间隙的深度内的分布，这些信息在单个图像投影视图中是无法获取的。
[0136]
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