一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法与流程

1.本发明属于生物分析技术领域，涉及一种血浆中牡荆素(vitexin)和异牡荆素(isovitexin)的液相色谱串联质谱检测方法。


背景技术：

2.牡荆素和异牡荆素是两种天然植物黄酮碳苷类化合物，广泛分布于自然界的金莲花、布渣叶、山楂叶、木豆叶、夜关门、绿豆、乌蕨、柳豆叶、檀香叶及光果甘草等几十种植物中。以往一项药理学研究显示，牡荆素和异牡荆素具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗炎镇痛、抗氧化、保护心脑血管、骨保护、降低血糖、降低血压及改善神经功能等多种作用,对上述方面进行深入研究有利于肿瘤性疾病、糖尿病、心脑血管疾病、高血压病及神经疾病等疾病天然治疗药物的研究发展。考虑到牡荆素和异牡荆素具有多种的生理作用，因此有必要对牡荆素和异牡荆素的体内浓度进行检测。
3.由于以往牡荆素和异牡荆素药物检测具有前处理复杂、灵敏度低、分析时间长等缺点，因此需要开发一种同时测定血浆中牡荆素和异牡荆素浓度的简单高效检测方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法，该方法通过简单有效的前处理方法提取血浆中的牡荆素和异牡荆素，并在较短的测定时间内准确的检测血浆样品中的牡荆素和异牡荆素。本发明方法极大地缩短了牡荆素和异牡荆素分析时间，整个分析过程用时只需8min；分离所需样品量极少，只需100μl左右。
5.本发明采用如下技术方案实现：
6.一种血浆中牡荆素和异牡荆素药物液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用三倍含内标葛根素的乙腈溶液沉淀蛋白前处理样品，后取上清液干燥后加入复溶溶液，混匀离心取上清，采用液相色谱串联质谱检测牡荆素和异牡荆素的浓度。
7.本发明中，液相色谱条件为：色谱柱：agilent eclipse plus c18 column(2.1
×
100mm,3.5μm)；流动相：流动相a：含0.1％甲酸fa的水，流动相b：甲醇，梯度洗脱：0-0.5min：b＝10％；0.5-7.0min：b从10％升至50％；7.0-7.01min：b从50％升至90％；7.01-7.5min：b＝90％；7.5-7.51min：b从90％降至10％；7.51-8.0min：b＝10％；流速：0.3ml/min；柱温：40℃；进样量：5μl。
8.质谱参数为：离子源：电喷雾离子源(esi)；离子模式：正离子模式；监测模式：多反应监测(mrm)。质谱检测器灵敏度高，分析时间短，进样量少，具有对牡荆素、异牡荆素和内标物特征离子分离和鉴定同时进行等优点，可实现体内微量牡荆素和异牡荆素药物浓度定量。
9.具体地，一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法，包括：精密移取100μl大鼠血浆，加入5μl甲醇-水(1:1,v:v)，从而平行制备若干份样品；每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min
后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl；采用液相色谱串联质谱，分别获得牡荆素和异牡荆素峰面积与内标物峰面积的比值，根据标准曲线计算血浆中牡荆素和异牡荆素的浓度。
10.标准曲线的获取方法，包括：精密移取若干份100μl大鼠空白血浆，分别平行精密加入5μl浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、2、3、4μg/ml的牡荆素和异牡荆素工作溶液，制得浓度为0.5、1.5、5、15、50、100、150、200ng/ml的标准曲线样品，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液在本实验条件下进样5μl，进行分析。所得结果以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，用加权(w＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线，牡荆素和异牡荆素线性范围为0.5-200ng/ml。
11.本发明的有益效果为：
12.(1)本发明利用液相色谱串联质谱技术建立了复杂生物基质血浆中目标化合物牡荆素和异牡荆素的定量检测方法，能够有效测定给予受试制剂后大鼠体内牡荆素和异牡荆素的浓度。血浆样品中牡荆素和异牡荆素样本前处理过程简单，便于操作，所用试剂常规且成本低。测定分析时间短，单次进样检测仅需8min，提高检测效率。具有前处理方法简单，检测灵敏度高，检测时间短等优点。
13.(2)本发明方法对生物样本的需求样量少，只需100μl体积样本即可完成检测。
14.(3)生物样品分析方法测定结果，线性回归方程为：牡荆素：y＝0.134447*x 0.003726(r＝0.998)，异牡荆素：y＝0.085611*x-0.000907(r＝0.999)；牡荆素和异牡荆素在0.5-200ng/ml浓度范围内呈线性，且线性良好；定量下限0.5ng/ml(信噪比s/n》10)；日内精密度和准确度、日间精密度和准确度、基质效应和提取回收率均符合药典中生物样品定量分析方法验证指导原则。具有线性良好，精密度高，准确度好，重现性好等特点。
附图说明
15.图1是牡荆素和异牡荆素的碎片离子图，其中a为牡荆素，b为异牡荆素，c为内标葛根素；
16.图2是大鼠血浆选择性典型色谱图；其中(a)代表空白血浆样品色谱图，(b)代表加标分析物和内标的空白血浆样品色谱图，此点配制过程为：加入5μl 0.3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl空白血浆中，配制成血浆终浓度为15ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，(c)代表给予受试制剂后大鼠血浆样品色谱图；峰i-iii分别指牡荆素、异牡荆素和内标葛根素；
17.图3是牡荆素和异牡荆素内标法测定标准曲线。
具体实施方式
18.大鼠血浆来源：spf级sd大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可
证及动物质量合格证号：(scxk(沪)2017-0005、20170005066418)，重量180-220g，大鼠采血并用edta-2k抗凝，采完后用灭菌干棉球轻压采血部位止血，4,000rpm/min离心10min，取上清，获得大鼠空白血浆。
19.牡荆素和异牡荆素工作液的配制：分别精密称取10mg牡荆素和10mg异牡荆素，用dmso配制为分别10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液a和储备液b。储备液a用于标准曲线样品的配制；储备液b用于精密度与准确度、稳定性、回收率和基质效应等样品的配制。将储备液a用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释成浓度为0.01、0.03、0.1、0.3、1、2、3、4μg/ml的牡荆素和异牡荆素标曲工作溶液；终浓度为10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液b用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释成浓度为0.01、0.03、2、3μg/ml工作液，用于精密度和准确度测定；终浓度为10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液b用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释成终度为0.03、2、3μg/ml工作液，用于考察提取回收率和基质效应；终浓度为10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液b用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释成浓度为0.03、3μg/ml工作液，用于稳定性测定；终浓度为10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液b用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释成终度为10μg/ml工作液，用于考察稀释稳定性。
20.内标葛根素溶液的配制：精密称取10mg葛根素，用dmso配制为10mg/ml的葛根素储备液，置低温保存备用。精密量取900μl稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)和100μl葛根素储备液，混合后制得1mg/ml的葛根素溶液。分别精密量取1l乙腈和5μl 1mg/ml的葛根素溶液，混合后制得5ng/ml的葛根素溶液。
21.水相配制：加一定量的fa到一定体积的蒸馏水中，配制为终浓度为0.1％fa水溶液作为水相。
22.液相色谱仪型号：agilent 1290超高效液相色谱仪。
23.质谱仪型号：agilent 6470质谱仪。质谱仪参数设定为：电喷雾离子源(esi)；离子模式：正离子模式；监测模式：多反应监测(mrm)。设定原参数分别为：gas temp:300℃；gas flow:5l/min；sheath gas temp:400℃；sheath gas flow:12l/min；capillary:3500v；牡荆素、异牡荆素和葛根素采用mrm方式检测，检测参数离子对(m/z)分别为433.1
→
313.1(牡荆素)、433.1
→
283.2(异牡荆素)、417.1
→
297.2(葛根素)；fragmentor:150(牡荆素)、150(异牡荆素)、150(葛根素)；collision energy:5(牡荆素)、5(异牡荆素)、5(葛根素)。
24.实施例1
25.精密移取100μl大鼠血浆，加入5μl工作液，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，采用上述的色谱条件和质谱条件，对以上所建样品提取和检测方式进行方法学验证。
26.(1)检测离子对：分别精密称取10mg牡荆素和异牡荆素，用dmso配制为10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液。储备液用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释至牡荆素和异牡荆素浓度为100ng/ml的溶液，通过质谱全扫描和满足实际样品选择性要求选择离子分别为：牡荆素(q1:433.1,q3:313.1)、异牡荆素(q1；433.1,q3:283.2)、葛根素(q1:417.1,q3；297.2)，牡荆素和异牡荆素的碎片离子图见图1。
27.(2)专属性考察：用5μl稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)替代牡荆素和异牡荆素工作
液，取6份不同大鼠来源的100μl空白血浆，每份样品加入300μl乙腈溶液沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，得到色谱图(见图2-a)。结果表明，空白血浆中牡荆素、异牡荆素和内标检测响应值均较低，证明所建色谱串联质谱检测方法能够排除血浆基质中其他内源性组分对目标分析物(牡荆素、异牡荆素)和内标物(葛根素)检测的干扰。本发明对于测定牡荆素、异牡荆素和内标葛根素专属性良好。
28.(3)检测线性范围和检测限测定：分别精密称取10mg牡荆素和异牡荆素，用dmso配制为10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液。用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释成0.01、0.03、0.1、0.3、1、2、3、4μg/ml的牡荆素和异牡荆素系列工作溶液，分别取上述工作液5μl，加入到100μl空白血浆中，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，以每一个浓度所测定血浆中牡荆素和异牡荆素和内标物葛根素的峰面积比值(y)为因变量，对应的牡荆素和异牡荆素终浓度为自变量(x)，进行最小二乘法(权重系数为1/x2)回归运算，得牡荆素和异牡荆素在血浆中的标准曲线线性回归方程为：牡荆素：y＝0.134447*x 0.003726(r＝0.998)，异牡荆素：y＝0.085611*x-0.000907(r＝0.999)；牡荆素和异牡荆素在0.5-200ng/ml浓度范围内呈线性，且线性良好；标准曲线见图3，标准曲线中15ng/ml的点对应的色谱图见图2；定量下限0.5ng/ml(s/n》10)。
29.(4)精密度和准确度实验：选取定量下限(0.01μg/ml)，低(0.03μg/ml)、中(2μg/ml)、高(3μg/ml)4个浓度质控样品验证所建分析方法的精密度和准确度。分别加入5μl 0.01μg/ml、0.03μg/ml、2μg/ml、3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl空白血浆中，配制成血浆终浓度为0.5ng/ml、1.5ng/ml、100ng/ml、150ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定5个样品，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，连续进3个分析批，根据每批随行标准曲线，回算每批每份质控血浆样品中牡荆素和异牡荆素的实测浓度，根据牡荆素和异牡荆素实测浓度与加入已知标准浓度相比，计算精密度和准确度。检测结果见表1，批内和批间精密度均小于10.0％(n＝5)，准确度在95.1％～116.8％。
30.表1大鼠血浆中牡荆素和异牡荆素的定量下限、精密度与准确度分析结果
[0031][0032]
(5)基质效应和提取回收率：取六份不同大鼠的空白血浆样品。第一组：分别加入5μl0.03μg/ml、2μg/ml、3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl大鼠空白血浆中，配制成血浆终浓度为1.5ng/ml、100ng/ml、150ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定5个样品，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。第二组：100μl大鼠空白血浆中加入300μl乙腈溶液，涡旋3min，13,000rpm离心10min后，制得空白基质(不含内标)。吸出上清液5μl，舍弃，在剩余的液体中分别平行精密加入5μl浓度为0.03μg/ml、2μg/ml、3μg/ml的牡荆素和异牡荆素工作溶液和5μl浓度为300ng/ml的葛根素溶液，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，每个浓度平行测定6个样品。第三组：100μl纯水中加入300μl乙腈溶液，涡旋3min，13,000rpm离心10min后，制得空白基质(不含内标)。吸出上清液5μl，舍弃，在剩余的液体中分别平行精密加入5μl浓度为0.03μg/ml、3μg/ml的牡荆素和异牡荆素工作溶液和5μl浓度为300ng/ml的葛根素溶液，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，每个浓度平行测定6个样品。将第一组处理后所测得的牡荆素和异牡荆素平均峰面积，与第二组处理后所测得的平均峰面积相比，求算不同生物基质中牡荆素和异牡荆素的提取回收率；同时，将第二组处理后测得的牡荆素和异牡荆素峰面积，与第三组处理后测得的平均峰面积相比，计算分析物和内标的基质因子，进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，求算生物基质中牡荆素和异牡荆素的基质效应，结果见表2，牡荆素和异牡荆素基质效应值变异系数cv为1.2％～2.3％之间，符合生物样品定量分析方法验证指导原则所规定
±
15％范围，可认为血浆中内源性物质在本发明的样品前处理过程和色谱分离过程中不干扰牡荆素和异牡荆素测定，结果见表2。
[0033]
表2大鼠血浆中牡荆素和异牡荆素提取回收率和基质效应试验
[0034][0035]
(6)稳定性：
[0036]
a：处理前稳定性(室温放置6h)：分别加入5μl 0.03μg/ml、3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl大鼠空白血浆中，配制成血浆终浓度为1.5ng/ml、150ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定3个样品，室温放置6h后，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。
[0037]
b:处理后稳定性(室温放置6h)：分别加入5μl 0.03μg/ml、3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl大鼠空白血浆中，配制成血浆终浓度为1.5ng/ml、150ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定3个样品，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液,室温放置6h后，用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。
[0038]
c:自动进样器稳定性：分别加入5μl 0.03μg/ml、3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl大鼠空白血浆中，配制成血浆终浓度为1.5ng/ml、150ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定3个样品，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液,自动进样器放置24h后，用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。
[0039]
d:样品冻融稳定性：分别加入5μl 0.03μg/ml、3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl大鼠空白血浆中，配制成血浆终浓度为1.5ng/ml、150ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定3个样品，置-80℃冰箱保存，反复冻融三次，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液，用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。
[0040]
e:样品冻存稳定性：分别加入5μl 0.03μg/ml、3μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl大鼠空白血浆中，配制成血浆终浓度为1.5ng/ml、150ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定3个样品，置-80℃冰箱保存15天，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液，用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。
[0041]
牡荆素和异牡荆素大鼠血浆稳定性数据见表3，结果表明牡荆素和异牡荆素大鼠血浆稳定性良好。
[0042]
表3牡荆素和异牡荆素大鼠血浆稳定性
[0043][0044]
(7)稀释可靠性：加入5μl 10μg/ml牡荆素和异牡荆素工作液到100μl大鼠空白血浆中，配制成血浆终浓度为500ng/ml牡荆素和异牡荆素血浆样品，每个浓度平行测定6个样品，精密移取500ng/ml样品10μl加入到90μl大鼠空白血浆中，加入5μl的稀释液，制得浓度为50ng/ml的稀释10倍可靠性样品，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液，用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。
[0045]
精密移取500ng/ml样品5μl加入到495μl大鼠空白血浆中，混匀后移取100μl上述样品，加入5μl的稀释液，制得浓度为5ng/ml的稀释100倍可靠性样品，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液，用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl。
[0046]
牡荆素和异牡荆素大鼠血浆稀释可靠性数据见表4，结果符合生物样品定量分析方法验证指导原则所规定
±
15％范围，认为血浆中牡荆素和异牡荆素稀释10倍，100倍可靠性良好。
[0047]
表4牡荆素和异牡荆素大鼠血浆稀释可靠性
[0048][0049]
实施例2牡荆素和异牡荆素定量检测：
[0050]
标准曲线制备：分别精密称取10mg牡荆素和异牡荆素，用dmso配制为10mg/ml的牡荆素和异牡荆素储备液。用稀释液(甲醇:水＝1:1，v/v)稀释成0.01、0.03、0.1、0.3、1、2、3、4μg/ml的牡荆素和异牡荆素系列工作溶液，分别取上述工作液5μl，加入到100μl大鼠空白
血浆中，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl，以每一个浓度所测定血浆中牡荆素和异牡荆素和内标物葛根素的峰面积比值(y)为因变量，对应的牡荆素和异牡荆素终浓度为自变量(x)，进行最小二乘法(权重系数为1/x2)回归运算，得牡荆素和异牡荆素在血浆中的标准曲线。
[0051]
大鼠灌胃或静脉给予受试制剂后，在给药后不同时间点采血，获得给药后血浆样品。精密移取100μl大鼠血浆，加入5μl甲醇-水(1:1,v:v)，每份样品加入300μl含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/ml)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μl复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μl；采用液相色谱串联质谱，分别获得牡荆素和异牡荆素峰面积与内标物峰面积的比值，根据标准曲线计算血浆中牡荆素和异牡荆素的浓度。
[0052]
液相色谱仪型号：agilent 1290超高效液相色谱仪。色谱柱：agilent eclipse plus c18column(2.1
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100mm,3.5μm)；流动相：流动相a：水(含0.1％fa的水)，流动相b：甲醇，梯度洗脱：0-0.5min：b＝10％；0.5-7.0min：b从10％升至50％；7.0-7.01min：b从50％升至90％；7.01-7.5min：b＝90％；7.5-7.51min：b从90％降至10％；7.51-8.0min：b＝10％；流速：0.3ml/min；柱温：40℃；进样量：5μl。
[0053]
质谱仪型号：agilent 6470质谱仪。质谱仪参数设定为：电喷雾离子源(esi)；离子模式：正离子模式；监测模式：多反应监测(mrm)。设定原参数分比为：gas temp:300℃；gas flow:5l/min；sheath gas temp:400℃；sheath gas flow:12l/min；capillary:3500v；牡荆素、异牡荆素和葛根素采用mrm方式检测，检测参数离子对(m/z)分别为433.1
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313.1(牡荆素)、433.1
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283.2(异牡荆素)、417.1
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297.2(葛根素)；fragmentor:150(牡荆素)、150(异牡荆素)、150(葛根素)；collision energy:5(牡荆素)、5(异牡荆素)、5(葛根素)。
[0054]
本实施例方法能够准确定量0.5-200ng/ml浓度，且高浓度样品按照实施例1(7)稀释10倍、100倍后测定范围0.5-200ng/ml浓度范围内仍可准确定量，稀释后实测浓度乘以10、100为样品最终浓度。
[0055]
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。