一种聚乙二醇修饰的PrRP31及其制备和应用

一种聚乙二醇修饰的prrp31及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于医药用途技术领域，涉及一种聚乙二醇修饰的prrp31及其制备方法，还涉及一种聚乙二醇修饰的prrp31的医药用途，尤其涉及聚乙二醇修饰的prrp31在制备抗炎镇痛药物中的应用。


背景技术：

2.催乳素释放肽，也称为prolactin-releasing peptide或prrp，是一种从牛下丘脑中提取出来的神经肽。prrp属于rf-amide神经肽家族，是唯一已知的g蛋白偶联受体10的内源性配体。在人体内，prrp具有两种生物学活性的异构体，包含prrp20和prrp31。这两种异构体都有一个共同的c-端arg-phe-amide序列，这对它们的生物活性至关重要。prrp31与摄食、能量消耗调节等多种生理功能相关。因此，研究prrp31具有重要的意义。
3.多肽作为新型的药物分子，近年来被广泛应用到癌症治疗、肿瘤成像和免疫治疗等多个领域。作为药物分子，多肽具有毒性低、活性强和容易合成及修饰等优点。但由于多肽容易被多种蛋白酶所降解，导致其体内稳定性差，在实际应用中存在许多局限性。聚乙二醇(peg)是指环氧乙烷聚合物，具有非离子性的、无毒性的、无生物排斥、高亲水性的等特点。通过化学方法将peg偶联到大分子上(抗体、多肽等)能够明显的提高多肽的溶解性及生物药效，而且也可以延长多肽的代谢时间。目前，已有多种修饰过的多肽药物投入市场应用，例如peg修饰、甲基化修饰、同位素修饰以及二硫键修饰等等。其中，peg修饰是目前多肽药物改进的最有效策略之一。目前，尚未见到使用聚乙二醇修饰prrp31进行抗炎镇痛活性研究的报道。


技术实现要素：

4.要解决的技术问题
5.为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种聚乙二醇修饰的prrp31及其制备和应用于抗炎镇痛活性。
6.技术方案
7.一种聚乙二醇修饰的prrp31，其特征在于采用聚乙二醇修饰prrp31的氨基端的ser，分子式是c
166h263n57o45
s1，结构式如下：
[0008][0009]
其中：c
166h263n57o45
s1分子量为3809.55，氨基酸序列为peg2-srthrhsmeirtpd inpawyasrgirpvgrf-nh2。
[0010]
一种所述聚乙二醇修饰的prrp31的制备方法，其特征在于步骤如下：
[0011]
步骤1、树脂溶胀：往反应柱中加入rink-amide-mbha-resin起始树脂，然后再一并浸泡于dcm中20-30min，然后抽干反应柱中的水分；
[0012]
步骤2、脱保护：加入哌啶的dmf溶液，通n2搅拌20-30分钟，滤干溶剂；再用dmf洗涤树脂6-8次，抽干水分：
[0013]
步骤3：用0.27ml的dmf溶解0.34g tbtu和保护氨基酸于烧杯中，充分搅拌直至完全溶解；
[0014]
步骤4：将步骤3的反应液加入到树脂中，再加入diea，通入n2鼓吹1-2小时；
[0015]
步骤5：反应结束后移除溶剂，用dmf洗涤树脂3-5次；
[0016]
步骤6：向树脂中加入20％哌啶的dmf溶液，通入n2继续鼓吹30-40分钟；
[0017]
步骤7：然后移除溶剂，用dmf洗涤树脂6-8次，完成本次氨基酸的偶联；
[0018]
重复步骤1～步骤7，每次重复时，将步骤7得到的物质取代步骤1的起始树脂，直至缩合最后一个氨基酸完成后，按照序列c段到n端残基顺序依次缩合，在反应柱的树脂内得到聚乙二醇修饰的prrp31，为以下序列氨基酸即多肽：
[0019]
peg2-srthrhsmeirtpd inpawyasrgirpvgrf-nh2。
[0020]
所述步骤2dmf溶液的体积分数为20％。
[0021]
所述在反应柱的树脂内得到的聚乙二醇修饰的prrp31，先采用裂解液提取得到粗品肽，再纯化处理得到精品纯度的多肽。
[0022]
所述提纯得到粗品肽是：将裂解液加入到缩合后的反应柱树脂中，搅拌2-3小时；
然后将树脂和裂解液抽离，加入乙醚使反应柱树脂中的多肽充分析出，过滤后用乙醚充分洗涤6-8次，最后得到粗品肽。
[0023]
所述纯化处理：通过分析粗品5-95％确定主峰时间，采用乙腈与水溶液进行溶解，进行澄清和过滤；再根据主峰时间进行梯度提取，得到液体加入茄形瓶中，旋转蒸发冻干3-4天，得到精品纯度的多肽。
[0024]
一种所述聚乙二醇修饰的prrp31的应用方法，其特征在于：所述聚乙二醇修饰prrp31用于制备抗炎镇痛药物。
[0025]
所述聚乙二醇修饰prrp31用于制备片剂1000片时的配方：聚乙二醇修饰prrp3145.0g、填充剂170.0g、崩解剂15.0g、黏合剂10.0g和润滑剂5.0g，按照制备片剂的常规工艺制成片剂。
[0026]
所述聚乙二醇修饰prrp31用于制备软胶囊1000粒的配方：聚乙二醇修饰prrp3190.0g、黏合剂10.0g、填充剂80.0g和润滑剂20.0g，按制备胶囊剂的常规工艺制成。
[0027]
所述聚乙二醇修饰prrp31用于制备注射液1ml的注射剂1000支的配方：聚乙二醇修饰prrp31 100.0g、枸橼酸2.0g、枸橼酸钠1.0g、氯化钠15.0g和注射用水2000ml，按制备注射剂的常规工艺操作。
[0028]
有益效果
[0029]
本发明提出的一种聚乙二醇修饰的prrp31及其制备和应用，针对prrp31进行聚乙二醇修饰，并检测聚乙二醇修饰prrp31作用于小鼠足肿炎症模型的抗炎活性和小鼠水浴甩尾的镇痛活性。采用聚乙二醇修饰prrp31，小鼠足肿炎症模型和水浴甩尾实验检测聚乙二醇修饰prrp31的抗炎镇痛活性，实验证明，聚乙二醇修饰prrp31具有良好的抗炎镇痛活性。在小鼠足肿炎症模型上，聚乙二醇修饰prrp31在5mg/kg抑制炎症37.09％(5h)。在小鼠水浴甩尾实验中，聚乙二醇修饰prrp31在5mg/kg可产生最大镇痛效果。本发明提供了一种聚乙二醇修饰prrp31作为抗炎镇痛药物的应用，为治疗相关疾病提供有益帮助，在医药领域方面具有十分重要的意义。
附图说明
[0030]
图1是本发明聚乙二醇修饰prrp31的高压液相色谱图
[0031]
图2是本发明聚乙二醇修饰prrp31的质谱鉴定图
[0032]
图3是小鼠足肿炎症模型评价聚乙二醇修饰prrp31抗炎活性。*，p《0.05，两组之间t检验。聚乙二醇修饰prrp31具有显著的抗炎活性。
[0033]
图4是小鼠水浴甩尾实验评价聚乙二醇修饰prrp31镇痛活性。*，p《0.05，两组之间t检验。聚乙二醇修饰prrp31具有显著的镇痛活性。
具体实施方式
[0034]
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
[0035]
本发明所采用的技术方案是：针对聚乙二醇修饰prrp31，聚乙二醇修饰prrp31在小鼠足肿炎症模型和水浴甩尾实验上具有显著的抗炎活性和镇痛活性，所述化合物分子式是c
166h263n57o45
s1，分子量是3809.55，其结构式是：
[0036][0037]
其特点是包括以下步骤：
[0038]
采用小鼠足肿炎症模型进行动物抗炎活性评价，其原理是：卡拉胶又名角叉菜胶，为国内外常用的良好致炎剂。以角叉莱胶致小鼠足跖肿胀为实验模型，测定小鼠的足肿胀度，即可检测炎症的程度和抗炎药的作用。
[0039]
抑制率＝(给药组足肿值-空白组足肿值)/(空白组足肿值)
×
100％
[0040]
采用小鼠水浴甩尾实验对药物在急性痛中的镇痛活性进行检测。首先测定小鼠的基础痛阈值，将甩尾不在3-5秒的小鼠淘汰掉。然后进行腹腔给药并测量甩尾痛阈值。将测出的痛阈值利用下面的公式进行转换为最大可能效应(mpe)表示：
[0041]
mpe(％)＝(给药组痛阈值-基础痛阈值)/(10秒-基础痛阈值)
×
100％
[0042]
以下实施例参照图1-4。
[0043]
实施例1.聚乙二醇化prrp31的制备。
[0044]
缩合方法：tbtu diea，修饰在n端ser的氨基上。
[0045]
下面将结合附图，对本发明的实施例进行描述。实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照制造厂商或常规条件。
[0046]
固相多肽合成法制备prrp31的聚乙二醇化衍生物，步骤如下：
[0047]
1)树脂处理
[0048]
①
树脂溶胀：往500ml反应柱中加入起始树脂(rink-amide-mbha-resin)，然后再将树脂浸泡于dcm，最后抽干。
[0049]
②
脱保护：加入哌啶的dmf溶液(体积分数20％)，通n2搅拌30分钟，滤干溶剂。再用dmf洗涤树脂6次，抽干。
[0050]
2)氨基酸偶联反应
[0051]
①
用0.27ml的dmf溶解0.34g tbtu和保护氨基酸于烧杯中，充分搅拌直至完全溶解。
[0052]
②
将上述反应液加入到树脂中，再加入diea，通入n2鼓吹90分钟左右。
[0053]
③
反应结束后移除溶剂，用dmf洗涤树脂3次。
[0054]
④
向树脂中加入20％哌啶的dmf溶液，通入n2继续鼓吹30分钟。
[0055]
⑤
然后移除溶剂，用dmf洗涤树脂6次，即完成本次氨基酸的偶联。
[0056]
⑥
重复以上步骤。
[0057]
⑦
缩合最后一个氨基酸完成后对多肽进行收缩，dmf/dcm/甲醇依次洗3遍，抽干后称取重量。
[0058]
最后按照序列c段到n端残基顺序依次缩合以下序列氨基酸
[0059]
peg2-srthrhsmeirtpd inpawyasrgirpvgrf-nh2
[0060]
3)tfa裂解
[0061]
①
首先将树脂加入配置好的86％tfa/5％edt/5％苯甲硫醚/3％苯酚/2％纯水的裂解液中，搅拌150min。
[0062]
②
然后将树脂和裂解液抽离，加入乙醚使多肽充分析出。
[0063]
③
接着，用布氏漏斗将多肽过滤，并用乙醚充分洗涤6次，最后得到粗品肽。
[0064]
4)纯化处理
[0065]
①
首先通过分析粗品5-95％来确定主峰时间。提前制备仪器，平衡。
[0066]
②
称适量的粗品用(乙腈 水)进行溶解，之后进行澄清和过滤。
[0067]
③
根据分析粗品确定制备梯度
[0068]
④
上样走梯度
[0069]
⑤
收峰，确定液体分子量是否正确
[0070]
⑥
分析液体
[0071]
⑦
根据要求转盐
[0072]
⑧
液体加入茄形瓶中，旋转蒸发仪把acn旋掉，待体积小了，放入包盘上冷冻干燥机上，冻干3天。
[0073]
⑨
下样称量，送精品ms，反打精品纯度
[0074]
5)制备干粉装多肽粗制品：高效液相色谱法纯化，即获得prrp31的聚乙二醇化衍生物纯品，结构式如下：
[0075]
参照图1，prrp31-peg的高压液谱色相图表明纯化后的样品纯度为98％，无其他杂质的干扰。
[0076]
参照图2，prrp31-peg质谱分子量为3809.55，与理论计算的分子量一致，说明prrp31-peg鉴定无误。
[0077]
实施例2.聚乙二醇化prrp31的制备。
[0078]
缩合方法：tbtu diea，修饰在n端ser的氨基上。
[0079]
下面将结合附图，对本发明的实施例进行描述。实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照制造厂商或常规条件。
[0080]
固相多肽合成法制备prrp31的聚乙二醇化衍生物，步骤如下：
[0081]
1)树脂处理
[0082]
①
树脂溶胀：往500ml反应柱中加入起始树脂(rink-amide-mbha-resin)，使树脂浸泡于dcm后充分溶胀，然后减压抽干试剂。
[0083]
②
脱保护：加入哌啶的dmf溶液(体积分数25％)，通n2搅拌45分钟，滤干溶剂。再用dmf洗涤树脂3次，抽干。
[0084]
2)氨基酸偶联反应
[0085]
①
用0.41ml的dmf溶解0.51g tbtu和保护氨基酸于烧杯中，充分搅拌直至完全溶解。
[0086]
②
将上述反应液加入到树脂中，再加入diea，通入n2鼓吹70分钟左右。
[0087]
③
反应结束后移除溶剂，用dmf洗涤树脂3次。
[0088]
④
向树脂中加入30％哌啶的dmf溶液，通入n2继续鼓吹70分钟。
[0089]
⑤
然后移除溶剂，用dmf洗涤树脂3次，即完成本次氨基酸的偶联。
[0090]
⑥
重复以上步骤。
[0091]
⑦
缩合最后一个氨基酸完成后对多肽进行收缩，dmf/dcm/甲醇依次洗4遍，抽干后称取重量。
[0092]
最后按照序列c段到n端残基顺序依次缩合以下序列氨基酸
[0093]
peg2-srthrhsmeirtpd inpawyasrgirpvgrf-nh2
[0094]
3)tfa裂解
[0095]
①
首先将树脂加入配置好的86％tfa/5％edt/5％苯甲硫醚/3％苯酚/2％纯水的裂解液中，搅拌120min。
[0096]
②
然后将树脂和裂解液抽离，加入乙醚使多肽充分析出。
[0097]
③
接着，用布氏漏斗将多肽过滤，并用乙醚充分洗涤6次，最后得到粗品肽。
[0098]
4)纯化处理
[0099]
①
首先通过分析粗品5-95％来确定主峰时间。提前制备仪器，平衡。
[0100]
②
称适量的粗品用(乙腈 水)进行溶解，之后进行澄清和过滤。
[0101]
③
根据分析粗品确定制备梯度
[0102]
④
上样走梯度
[0103]
⑤
收峰，确定液体分子量是否正确
[0104]
⑥
分析液体
[0105]
⑦
根据要求转盐
[0106]
⑧
液体加入茄形瓶中，旋转蒸发仪把acn旋掉，待体积小了，放入包盘上冷冻干燥机上，冻干3天。
[0107]
⑨
下样称量，送精品ms，反打精品纯度
[0108]
5)制备干粉装多肽粗制品：高效液相色谱法纯化，即获得prrp31的聚乙二醇化衍生物纯品。
[0109]
实施例3.聚乙二醇化prrp31的制备。
[0110]
固相多肽合成法制备prrp31的聚乙二醇化衍生物，步骤如下：
[0111]
1)树脂预处理
[0112]
①
树脂溶胀：rink-amide-mbha-resin树脂在二氯甲烷中搅拌，然后再将树脂浸泡
于dcm，最后抽干。
[0113]
②
脱保护：在溶胀、抽干的树脂中加入哌啶的dmf溶液(体积分数30％)，通n2搅拌45分钟，滤干溶剂。再用dmf洗涤树脂5次，茚检、抽干。
[0114]
2)氨基酸偶联反应
[0115]
①
用0.35ml的dmf溶解0.44g tbtu和保护氨基酸于烧杯中，充分搅拌直至完全溶解得到混合溶液。
[0116]
②
将上述反应液加入到脱保护的树脂中，再加入diea，通入n2鼓吹60分钟左右。
[0117]
③
反应结束后移除溶剂，用dmf洗涤树脂反复洗涤3次。
[0118]
④
向树脂中加入30％哌啶的dmf溶液，通入n2继续鼓吹45分钟。
[0119]
⑤
然后移除溶剂，用dmf洗涤树脂5次，即完成本次氨基酸的偶联。
[0120]
⑥
重复以上步骤。
[0121]
⑦
缩合最后一个氨基酸完成后对多肽进行收缩，dmf/dcm/甲醇依次洗3遍，抽干后称取重量。
[0122]
最后按照序列c段到n端残基顺序依次缩合以下序列氨基酸
[0123]
peg2-srthrhsmeirtpd inpawyasrgirpvgrf-nh2
[0124]
3)tfa裂解
[0125]
①
首先将树脂加入配置好的86％tfa/5％edt/5％苯甲硫醚/3％苯酚/2％纯水的裂解液中，搅拌130min。
[0126]
②
然后将树脂和裂解液抽离，加入乙醚使多肽充分析出。
[0127]
③
接着，用布氏漏斗将多肽过滤，并用乙醚充分洗涤5次，最后得到粗品肽。
[0128]
4)纯化处理
[0129]
①
首先通过分析粗品5-95％来确定主峰时间。提前制备仪器，平衡。
[0130]
②
称适量的粗品用(乙腈 水)进行溶解，之后进行澄清和过滤。
[0131]
③
根据分析粗品确定制备梯度
[0132]
④
上样走梯度
[0133]
⑤
收峰，确定液体分子量是否正确
[0134]
⑥
分析液体
[0135]
⑦
根据要求转盐
[0136]
⑧
液体加入茄形瓶中，旋转蒸发仪把acn旋掉，待体积小了，放入包盘上冷冻干燥机上，冻干3天。
[0137]
⑨
下样称量，送精品ms，反打精品纯度
[0138]
5)制备干粉装多肽粗制品：高效液相色谱法纯化，即获得prrp31的聚乙二醇化衍生物纯品，结构式如下：
[0139]
实施例4.小鼠足肿炎症模型评价prrp31-peg抗炎活性。
[0140]
1)实验动物：实验小鼠饲养环境为spf级，环境温度20-26℃，湿度40％-60％，白昼和黑夜保持12小时交替循环。小鼠每笼5-6只饲养，可自由摄食饮水。
[0141]
2)实验分组：实验分为vehicle组、5mg/kg prrp31-peg组，共2组。各组小鼠数量一致(10只/组)。
[0142]
3)小鼠足肿炎症模型：
[0143]
①
取6-8周龄健康c57bl/6小鼠随机分组为阴性对照组和药物组。
[0144]
②
给小鼠腹腔注射5mg/kg prrp31-peg和生理盐水。于给药后30min时在每鼠右后足跖出注射1％(w/v)角叉菜胶30μl致炎。用游标卡尺分别测量注射角叉菜胶后1,2,3,4,5,6,24小时小鼠左右足的厚度。
[0145]
肿胀厚度(mm)＝右足厚度(mm)-左足厚度(mm)。
[0146]
参照图3，在小鼠足肿炎症模型上，prrp31-peg在5mg/kg抑制炎症37.09％(5小时)。
[0147]
实施例5.小鼠水浴甩尾实验模型评价prrp31-peg镇痛活性。
[0148]
1)实验动物：实验小鼠饲养环境为spf级，环境温度20-26℃，湿度40％-60％，白昼和黑夜保持12小时交替循环。小鼠每笼5-6只饲养，可自由摄食饮水。
[0149]
2)实验分组：实验分为vehicle组、5mg/kg prrp31-peg组，共2组。各组小鼠数量一致(10只/组)。
[0150]
3)小鼠水浴甩尾实验模型：
[0151]
①
同样，取6-8周龄健康c57bl/6小鼠随机分组为阴性对照组和药物组。
[0152]
②
实验前，首先测定小鼠的基础痛阈值，将甩尾不在3-5秒的小鼠淘汰掉。然后给小鼠腹腔分别注射5mg/kg prrp31-peg和生理盐水，并测量甩尾痛阈值。
[0153]
参照图4，在小鼠水浴甩尾实验模型上，prrp31-peg在5mg/kg可产生最大镇痛mpe％值。
[0154]
下面具体实施例对聚乙二醇修饰的prrp31为活性成分，在制备抗炎镇痛药物中的应用作进一步说明。
[0155]
实施例6.片剂的制备
[0156][0157]
工艺：按制备片剂的常规工艺制成片剂1000片，每片含prrp31-peg 35mg。
[0158]
用法用量：一日两次，每次1～2片。
[0159]
实施例7.软胶囊的制备
[0160][0161]
工艺：按制备胶囊剂的常规工艺制成1000粒，每粒胶囊含prrp31-peg 90mg。
[0162]
用法用量：一日两次，每次1～2粒。
[0163]
实施例8.注射液的制备
[0164][0165][0166]
工艺：按制备注射剂的常规工艺操作，共制成2ml的注射剂1000支，每支含prrp31-peg 100mg。
[0167]
用法用量：一日两次，每次1～2支。
[0168]
上述各实施例中的填充剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂等辅料均为药剂学上最常规的辅料。