一种提高3’-唾液酸乳糖产量的基因工程菌Z3及其应用的制作方法

一种提高3
’‑
唾液酸乳糖产量的基因工程菌z3及其应用
技术领域
1.本发明属于重组微生物基因工程技术领域，特别是涉及一种提高3
’‑
唾液酸乳糖产量的基因工程菌z3及其应用。


背景技术：

2.母乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)及其类似物由于安全、可靠、不产生抗药性，并且具有部分免疫功能，以母乳寡糖及其类似物为原料开发新型药物成为当前医药领域的一大热点。目前，我国对母乳寡糖的研究开发仍处于初始阶段，且多采用化学合成法获得母乳寡糖及其类似物。由于糖苷供体价格昂贵、合成路径复杂及分离纯化困难，限制了母乳寡糖的工业应用。伴随着相关基因不断解析和微生物代谢路径不断得到阐明，使得利用生物技术的方法获得大量母乳寡糖成为可能。
[0003]3’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sialyllactose，3
’‑
sl)是母乳寡糖的重要组成成分，具有抗感染、提高免疫力、促进双歧杆菌增殖等功能，在食品医药行业具有广阔的前景，近年来受到人们的广泛关注，具有较大的应用价值和市场需求，3
’‑
唾液酸乳糖可以通过α-2,3-唾液酸转移酶，以cmp-唾液酸(cmp-neu5ac)和乳糖为底物合成。由于化学合成法涉及复杂的保护和去保护等步骤，且需要使用大量的有机试剂。人们把目光转向了生物合成法。利用组合生物学技术，人们已经合成壳聚糖、岩藻糖基化寡糖、神经节苷脂等碳水化合物，为合成唾液酸寡糖提供了新思路，解决了难以实现规模合成的难题。
[0004]
枯草芽孢杆菌作为典型的革兰氏阳性菌，由于其良好的生物安全性，较强的分泌能力，无密码子偏好性而被广泛应用于各种食品级产品的生物合成。通过合成生物学和代谢工程对枯草芽孢杆菌进行改造，引入外源3
’‑
唾液酸乳糖合成的相关基因，实现3
’‑
唾液酸乳糖的合成，但外源3
’‑
唾液酸乳糖合成途径的相关限速酶表达量低仍然是3
’‑
唾液酸乳糖合成过程中需要解决的问题。


技术实现要素：

[0005]
鉴于上述原因，本技术通过生物合成方法构建高效合成3
’‑
唾液酸乳糖的菌株，使其更具有产业上的利用价值，为生物合成母乳寡糖产业提供理论与实践参考。
[0006]
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0007]
本发明提供了一种提高3
’‑
唾液酸乳糖产量的基因工程菌z3，所述基因工程菌的构建方法包括如下：
[0008]
(1)以枯草芽孢杆菌3d6.2为出发菌株，将基因片段neua整合到枯草芽孢杆菌3d6.2的基因组中得到基因工程菌z1；
[0009]
(2)将基因片段nst整合到基因工程菌z1中得到基因工程菌z2；
[0010]
(3)敲除基因工程菌z2中的yesz基因得到基因工程菌z3。
[0011]
优选的，所述步骤(1)包括以下操作：
[0012]
1)以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168(b.subtilis 168)为模板，使用引物
neua-u-f和neua-u-r扩增得到基因片段neua-u；
[0013]
以b.subtilis 168为模板，使用引物neua-d-f和neua-d-r扩增得到基因片段neua-d；
[0014]
以质粒p7c6为模板，使用引物neua-c-f和neua-c-r扩增得到基因片段neua-c；
[0015]
将基因片段neua与启动子整合组成q-neua；
[0016]
所述启动子包括sp106、sp173、p43、pm1和tp2；
[0017]
在本发明中，所述q-neua优选包括以下组合：p43-neua和pm1-neua；
[0018]
2)将步骤1)获得的基因片段q-neua、neua-u、neua-d和neua-c进行重叠延伸pcr，得到融合基因片段u-q-neua-c-d；
[0019]
在本发明中，所述pcr的条件为98℃，预变性5min；98℃，变性15s；55℃，退火15s，72℃，延伸2min，共计35个循环，用1％的琼脂糖凝胶经过电泳验证，进行柱回收；
[0020]
3)制备重组枯草芽孢杆菌3d6.2工程菌的感受态，将融合基因片段u-q-neua-c-d转化进重组枯草芽孢杆菌3d6.2工程菌感受态中得到基因工程菌z1。
[0021]
优选的，所述步骤(2)包括以下操作：
[0022]
1)以b.subtilis 168为模板，使用引物nst-u-f和nst-u-r扩增得到基因片段nst-u；
[0023]
以b.subtilis 168为模板，使用引物nst-d-f和nst-d-r扩增得到基因片段nst-d；
[0024]
以质粒p7c6为模板，使用引物nst-c-f和nst-c-r扩增得到基因片段nst-c；
[0025]
将基因片段nst与启动子整合组成q-nst；
[0026]
所述启动子包括sp106、sp173、p43、pm1和tp2；
[0027]
在本发明中，所述q-neua优选包括以下组合：p43-nst、pm1-nst和tp2-nst；
[0028]
在实际应用中，p43-neua和pm1-nst的搭配、p43-neua和p43-nst的搭配、pm1-neua和sp173-nst的搭配为最优选，p43-neua和tp2-nst的搭配为次优选；
[0029]
2)将步骤1)获得的基因片段q-nst、nst-u、nst-d和nst-c进行重叠延伸pcr，得到融合基因片段u-q-nst-c-d；
[0030]
在本发明中，所述pcr的条件为98℃，预变性5min；98℃，变性15s；55℃，退火15s，72℃，延伸2min，共计35个循环，用1％的琼脂糖凝胶经过电泳验证，进行柱回收；
[0031]
3)制备基因工程菌z1的感受态，将融合基因片段u-q-nst-c-d转化进感基因工程菌z1受态中得到基因工程菌z2。
[0032]
优选的，所述步骤(3)包括以下操作：
[0033]
1)以b.subtilis 168为模板，使用引物qyesz-u-f和qyesz-u-r扩增得到基因qyesz-u；
[0034]
以b.subtilis 168为模板，使用引物qyesz-d-f和qyesz-d-r扩增得到基因qyesz-d；
[0035]
以质粒p7c6为模板，使用引物qyesz-c-f和qyesz-c-r扩增得到基因qyesz-c基因片段；
[0036]
2)将步骤1)获得的基因片段qyesz-u、qyesz-d和qyesz-c进行重叠延伸pcr，得到融合基因片段u-qyesz-c-d；
[0037]
其中pcr的条件为98℃，预变性5min；98℃，变性15s；55℃，退火15s，72℃，延伸
2min，共计35个循环。用1％的琼脂糖凝胶经过电泳验证，进行柱回收；
[0038]
3)制备基因工程菌z2的感受态，将融合基因片段u-qyesz-c-d转化进基因工程菌z2的感受态中得到重组枯草芽孢杆菌z3。
[0039]
本发明还提供了上述基因工程菌z3在合成3
’‑
唾液酸乳糖中的应用。
[0040]
本发明提供了一种3
’‑
唾液酸乳糖的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：
[0041]
将权利要求1～4任一项所述的基因工程菌z3置于种子培养基中制备得到种子液；将种子液接种于发酵培养基中经过培养获得发酵液。
[0042]
优选的，其特征在于，所述种子培养基包括以下成分：5g/l酵母粉、10g/l蛋白胨和10g/l氯化钠。
[0043]
优选的，所述发酵培养基包括以下成分：12g/l酵母粉、5g/l蛋白胨、6g/l(nh4)2so4、12.5g/lk2hpo4·
4h2o、2.5g/lkh2po4、3g/lmg2so4·
7h2o、10g/l葡萄糖、5g/l乳糖和微量元素10ml/l；
[0044]
所述微量元素包括：4g/lfe2so4·
7h2o、4g/l cacl2、1g/lmnso4·
5h2o、0.4g/lcocl2·
6h2o、0.2g/l namoo4·
2h2o、0.2g/l znso4·
7h2o、0.1g/l alcl3·
6h2o、0.1g/lcucl2·
h2o和0.05g/lh3bo4。
[0045]
优选的，所述制备种子液的条件为：在37℃的环境中，220rpm震荡培养12～15h。
[0046]
优选的，所述培养发酵液的方法为：将种子液按照5％的接种量接种至装有50ml发酵培养基的500ml带锥形瓶中，在37℃的环境中，220rpm条件下培养72h，制备得到发酵液。
[0047]
本发明以高产n-乙酰神经氨酸(neu5ac)菌株3d6.2为出发菌株，将外源基因n-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶neua和α-2,3-唾液酸转移酶nst整合到枯草芽孢杆菌基因组中，在枯草芽孢杆菌中构建3
’‑
唾液酸乳糖合成途径，摇瓶发酵产量达到3.85mg/l，敲除β-半乳糖苷酶基因yesz，使摇瓶发酵产量达到99.98mg/l，本技术通过对3
’‑
sl合成途径中的关键酶n-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶neua和α-2,3-唾液酸转移酶nst进行了启动子优化，获得了最优表达量，使摇瓶发酵产量最高达到110.9mg/l。最后，本技术还对对发酵培养基中的碳源进行了优化，寻找对3
’‑
sl合成最优的碳源，使摇瓶发酵产量达到185.2mg/l。
附图说明
[0048]
图1为3
’‑
唾液酸乳糖的合成示意图。
具体实施方式
[0049]
下文中涉及使用的试剂或器械未注明具体技术或条件者，则按照常规实验条件进行，未明确说明有试剂公司说明书的，则按照说明书所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0050]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明作进一步详细的描述。
[0051]
实施例1生产3
’‑
唾液酸乳糖基因工程菌基因工程菌z3的构建
[0052]
1、基因工程菌z1的构建
[0053]
基于枯草芽孢杆菌的密码子偏好性，人工合成基因片段n-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶neua和α-2，3-唾液酸转移酶nst，其中n-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶neua和α-2，3-唾液酸转移酶nst均来源于脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis 406y)。
[0054]
具体构建过程如下：
[0055]
(1)人工合成基因片段neua，根据national center for biotechnology information(ncbi)上公布的枯草芽孢杆菌168的基因组信息确定整合neua基因的上、下游序列。
[0056]
以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168(b.subtilis 168)为模板，采用引物neua-u-f、neua-u-r扩增得到基因neua-u；
[0057]
以b.subtilis 168为模板，采用引物neua-d-f、neua-d-r扩增得到基因neua-d；
[0058]
以质粒p7c6为模板，使用引物neua-c-f、neua-c-r扩增得到基因neua-c基因片段；
[0059]
以质粒pp43nmk为模板，利用引物hp-p43nmk-f和hp-p43nmk-r，扩增得到线性化质粒pp43nmk；
[0060]
以人工合成基因片段neua为模板，利用引物neua-f和neua-r，扩增得到neua片段；
[0061]
将线性化质粒pp43nmk和neua片段连接，利用一步克隆酶在37℃连接1h，之后转入jm109感受态中，涂布在氨苄抗性平板上，37℃培养12～14h，使用验证引物yz-pneua-f和yz-pneua-r进行菌落pcr验证，挑选阳性单菌落测序，确认得到正确质粒(即质粒pp43nm-neua)；
[0062]
以质粒pp43nm-neua为模板，使用引物p43-neua-f、p43-neua-r扩增得到基因片段p43-neua；
[0063]
(2)将步骤(1)中获得的四个基因片段p43-neua、neua-u、neua-d、neua-c进行重叠延伸pcr，其中pcr的条件为98℃，预变性5min；98℃，变性15s；55℃，退火15s，72℃，延伸2min，共计35个循环。用1％的琼脂糖凝胶经过电泳验证，进行柱回收，得到融合基因片段u-p43-neua-c-d；
[0064]
(3)制备枯草芽孢杆菌3d6.2的感受态，并将构建好的融合基因片段u-p43-neua-c-d转化进3d6.2菌株的感受态中，涂布在氯霉素抗性的平板上，37℃培养1-2天，通过使用验证引物yz-neua-f、yz-neua-r进行菌落pcr验证，确认得到基因工程菌；
[0065]
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，将质粒pdg-cre转化进重组菌中，涂布在卡那霉素抗性的平板上，37℃培养1-2天，将阳性克隆单菌落接种至带有0.5mmol/liptg和50ug/ml的液体lb培养基中，37℃，220rpm震荡培养12-15h，再接种至无抗液体lb培养基中，50℃，220rpm震荡培养12-15h，划线于无抗lb固体平板，37℃培养1-2天，挑选单菌落，点板筛选能在无抗lb固体平板上生长，同时不能在卡那霉素和氯霉素抗性平板上生长的单菌落，对单菌落进行dna测序验证得到已完成neua基因整合的基因工程菌z1。
[0066]
上文涉及到的引物的核苷酸序列如表1所示。
[0067]
表1引物序列
[0068]
名称序列编号neua-u-ftatgacctgccgccgtatattagagseq id no.1neua-u-rcgtgactgggaaaaccctttctgttactgttacgaaaggaaaggcseq id no.2neua-d-fgcagtcagcccgcctaatgagcgggcttttttcacgactgcgcttttttatgseq id no.3neua-d-rtgaatcgatcggacgtccseq id no.4neua-c-ftcgtaacagtaacagaaagggttttcccagtcacgacseq id no.5neua-c-rtcacgcccatttctgagcggataacaatttcacacaggseq id no.6p43-neua-fgaaattgttatccgctcagaaatgggcgtgaaaaaaagseq id no.7
p43-neua-rcgctcattaggcgggctgactgcgcttttagctttctttatggttcagaatattttcseq id no.8yz-neua-fcgctgcagattatatggcggcseq id no.9yz-neua-rcgatgattctatcaaagcatttgcttgagatcseq id no.10hp-p43nmk-fctgaaccataaagaaagctaatgatgaaagcttggcgtaatcseq id no.11hp-p43nmk-rccataaaataaacctccttttttagggcggtacccttatattttacataatcgcgcgctseq id no.12neua-fagggtaccgccctaaaaaaggaggtttattttatggaaaaacaaaacatcgctgseq id no.13neua-rcgccaagctttcatcattagctttctttatggttcagaatattttccseq id no.14yz-pneua-ftattttacatttttagaaatgggcgtgseq id no.15yz-pneua-rgttattcgcaatcagagatgctgseq id no.16
[0069]
2、基因工程菌z2的构建
[0070]
具体构建过程如下：
[0071]
(1)人工合成基因片段nst，根据national center for biotechnology information(ncbi)上公布的枯草芽孢杆菌168的基因组信息确定整合nst基因的上、下游序列。
[0072]
以b.subtilis 168为模板，采用引物nst-u-f、nst-u-r扩增得到基因nst-u；
[0073]
以b.subtilis 168为模板，采用引物nst-d-f、nst-d-r扩增得到基因nst-d；
[0074]
以质粒p7c6为模板，使用引物nst-c-f、nst-c-r扩增得到基因nst-c基因片段；
[0075]
以质粒pp43nmk为模板，利用引物hp-p43nmk-f和hp-p43nmk-r，扩增得到线性化质粒pp43nmk；
[0076]
以人工合成基因片段nst为模板，利用引物nst-f和nst-r，扩增得到nst片段；
[0077]
将线性化质粒pp43nmk和nst片段连接，利用一步克隆酶在37℃连接1h，之后转入jm109感受态中，涂布在氨苄抗性平板上，37℃培养12～14h，使用验证引物yz-pnst-f和yz-pnst-r进行菌落pcr验证，挑选阳性单菌落测序，确认得到正确质粒(即质粒pp43nm-nst)；
[0078]
以质粒pp43nm-nst为模板，使用引物p43-nst-f、p43-nst-r扩增得到基因片段p43-nst；
[0079]
(2)将步骤(1)中获得的四个基因片段p43-nst、nst-u、nst-d、nst-c进行重叠延伸pcr，其中pcr的条件为98℃，预变性5min；98℃，变性15s；55℃，退火15s，72℃，延伸2min，共计35个循环。用1％的琼脂糖凝胶经过电泳验证，进行柱回收，得到融合基因片段u-p43-nst-c-d；
[0080]
(3)制备基因工程菌z1工程菌的感受态，并将构建好的融合基因片段u-p43-nst-c-d转化进z1菌株的感受态中，涂布在氯霉素抗性的平板上，37℃培养1-2天，通过使用验证引物yz-nst-f、yz-nst-r进行菌落pcr验证，确认得到基因工程菌；
[0081]
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，将质粒pdg-cre转化进重组菌中，涂布在卡那霉素抗性的平板上，37℃培养1-2天，将阳性克隆单菌落接种至带有0.5mmol/liptg和50ug/ml的液体lb培养基中，37℃，220rpm震荡培养12-15h，再接种至无抗液体lb培养基中，50℃，220rpm震荡培养12-15h，划线于无抗lb固体平板，37℃培养1-2天，挑选单菌落，点板筛选能在无抗lb固体平板上生长，同时不能在卡那霉素和氯霉素抗性平板上生长的单菌落，对单菌落进行dna测序验证得到已完成nst基因整合的基因工程菌z2。
[0082]
上文涉及到的引物的核苷酸序列如表2所示。
[0083]
表2引物序列
[0084]
名称序列编号nst-u-ftcaacaaagcgggaagctatgcseq id no.17nst-u-rgactgggaaaaccctgacacaagaacgtttttttattgcttaatatggtaagseq id no.18nst-d-fggcgtaatcatggtcatagctgataacaagaacgttttttgtacaagaaatgseq id no.19nst-d-rttcagctttttgctggatcttttgseq id no.20nst-c-faacgttcttgtgtcagggttttcccagtcacgacseq id no.21nst-c-rtcacgcccatttctgagcggataacaatttcacacaggaaacseq id no.22p43-nst-fgtgaaattgttatccgctcagaaatgggcgtgaaaaaaagcgseq id no.23p43-nst-rcaaaaaacgttcttgttatcagctatgaccatgattacgccaagseq id no.24yz-nst-fgacgtccggttgaattaatttttgccseq id no.25yz-nst-rcagattaaccggttcgccttcttcseq id no.26hp-p43nmk-ftgaaagcccgcctaatgagcgggcttttagcttggcgtaatcatggseq id no.27hp-p43nmk-rgcccataaaaaaaacctccttggtacagaccaggttatattttacataatcgcgcgctttseq id no.28nst-fcctggtctgtaccaaggaggttttttttatgggcctgaaaaaagcatseq id no.29nst-rcccgctcattaggcgggctttcatcattaattcttatcatcaaatgtcagaatcgseq id no.30yz-pnst-ftattttacatttttagaaatgggcgtgseq id no.31yz-pnst-rtcctcaatcacgtacggtgseq id no.32
[0085]
3、基因工程菌z3的构建
[0086]
具体构建过程如下：
[0087]
(1)根据national center forbiotechnology information(ncbi)上公布的枯草芽孢杆菌168的基因组信息确定敲除yesz基因的上、下游序列。以b.subtilis168为模板，采用引物qyesz-u-f、qyesz-u-r扩增得到基因qyesz-u，以b.subtilis 168为模板，采用引物qyesz-d-f、qyesz-d-r扩增得到基因qyesz-d，以质粒p7c6为模板，使用引物qyesz-c-f、qyesz-c-r扩增得到基因qyesz-c基因片段；
[0088]
(2)将步骤(1)中获得的三个基因片段qyesz-u、qyesz-d、qyesz-c进行重叠延伸pcr，其中pcr的条件为98℃，预变性5min；98℃，变性15s；55℃，退火15s，72℃，延伸2min，共计35个循环。用1％的琼脂糖凝胶经过电泳验证，进行柱回收，得到融合基因片段u-qyesz-c-d；
[0089]
(3)制备基因工程菌z2工程菌的感受态，并将构建好的融合基因片段u-qyesz-c-d转化进z2菌株的感受态中，涂布在氯霉素抗性的平板上，37℃培养1～2天，通过使用验证引物yz-qyesz-f、yz-qyesz-r进行菌落pcr验证，确认得到基因工程菌；
[0090]
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，将质粒pdg-cre转化进重组菌中，涂布在卡那霉素抗性的平板上，37℃培养1-2天，将阳性克隆单菌落接种至带有0.5mmol/liptg和50ug/ml的液体lb培养基中，37℃，220rpm震荡培养12-15h，再接种至无抗液体lb培养基中，50℃，220rpm震荡培养12-15h，划线于无抗lb固体平板，37℃培养1-2天，挑选单菌落，点板筛选能在无抗lb固体平板上生长，同时不能在卡那霉素和氯霉素抗性平板上生长的单菌落，对单菌落进行dna测序验证得到已完成敲除yesz基因的基因工程菌z3。
[0091]
上文涉及到的引物的核苷酸序列如表3所示。
[0092]
表3引物序列
[0093]
名称序列编号qyesz-u-fgcagaataccgcctacaaccaseq id no.33
qyesz-u-rtgaaattgttatccgctctagcaagcgccatgatacagttttcseq id no.34qyesz-d-fcgtgactgggaaaaccctccgcatgaataccgtgtgattcseq id no.35qyesz-d-rctcttcatctggagacagcatttcgseq id no.36qyesz-c-fggcgcttgctagagcggataacaatttcacacaggseq id no.37qyesz-c-rtattcatgcggagggttttcccagtcacgacseq id no.38yz-qyesz-fgccattgacagaatcgatcaseq id no.39yz-qyesz-rcacctttggctgtcctgataseq id no.40
[0094]
应用例1基因工程菌摇瓶发酵生产3
’‑
唾液酸乳糖
[0095]
具体步骤如下：
[0096]
(1)培养基的配置
[0097]
种子培养基的成分包括：5g/l酵母粉，10g/l蛋白胨，10g/l氯化钠。
[0098]
发酵培养基的成分：12g/l酵母粉，5g/l蛋白胨，6g/l(nh4)2so4，12.5g/l k2hpo4·
4h2o，2.5g/lkh2po4，3g/lmg2so4·
7h2o，20g/l葡萄糖，5g/l乳糖，微量元素10ml/l；
[0099]
微量元素：4g/l fe2so4·
7h2o，4g/l cacl2，1g/l mnso4·
5h2o，0.4g/lcocl2·
6h2o，0.2g/lnamoo4·
2h2o，0.2g/lznso4·
7h2o，0.1g/lalcl3·
6h2o，0.1g/lcucl2·
h2o，0.05g/lh3bo4。
[0100]
(2)菌株发酵参数
[0101]
培养条件：37℃，220rpm震荡培养12-15h，制备得到种子液。将种子液按照5％的接种量接种至装有50ml发酵培养基的500ml带锥形瓶中，在37℃，220rpm条件下培养72h，制备得到发酵液。
[0102]
(3)3
’‑
唾液酸乳糖产量测定
[0103]
将发酵72h的枯草芽孢杆菌发酵液(z2和z3)在12000r/min条件下离心10min，吸取500ul发酵液上清，与纯乙腈1：1混合均匀，震荡5min后，12000r/min条件下离心10min，lc/ms进行胞外产物的测定，检测结果如表4所示。
[0104]
表4z2和z3提供的菌株的检测数据
[0105][0106]
由表4可知，敲除半乳糖苷酶基因yesz，3
’‑
唾液酸乳糖的产量达到99.98mg/l，od
600
为24.518，表示敲除半乳糖苷酶基因yesz能够有效提高3
’‑
唾液酸乳糖的产量。
[0107]
实施例2启动子优化选取最优表达量的启动子
[0108]
(1)选取五个强度不同的启动子，其序列如下表所示，根据实施例1，构建五株重组菌z1(3d6.2-p43-neua)，z1.1(3d6.2-sp106-neua)，z1.2(3d6.2-sp173-neua)，z1.3(3d6.2-pm1-neua)和z1.4(3d6.2-tp2-neua)。
[0109]
(2)根据实施例2，构建五个融合基因片段p43-nst，sp106-nst，sp173-nst，pm1-nst，tp2-nst。制备步骤(1)中五个基因工程菌z1，z1.1，z1.2，z1.3和z1.4工程菌的感受态，
并将构建好的五个融合基因片段p43-nst，sp106-nst，sp173-nst，pm1-nst，tp2-nst分别转入上述感受态中，获得25株重组工程菌
[0110]
(3)将步骤(2)得到的菌株制备成感受态，将质粒pdg-cre转化进重组菌中，涂布在卡那霉素抗性的平板上，37℃培养1-2天，将阳性克隆单菌落接种至带有0.5mmol/liptg和50ug/ml的液体lb培养基中，37℃，220rpm震荡培养12-15h，再接种至无抗液体lb培养基中，50℃，220rpm震荡培养12-15h，划线于无抗lb固体平板，37℃培养1-2天，挑选单菌落，点板筛选能在无抗lb固体平板上生长，同时不能在卡那霉素和氯霉素抗性平板上生长的单菌落，对单菌落进行dna测序验证得到25株基因工程菌。根据基因工程菌z3的操作步骤，敲除半乳糖苷酶基因yesz。
[0111]
上文涉及到的启动子的核苷酸序列如表5所示。
[0112]
表5启动子序列
[0113][0114]
上文涉及到的启动子的引物的核苷酸序列如表6所示。
[0115]
表6启动子的引物序列
[0116][0117][0118]
应用例225株基因工程菌摇瓶发酵生产3
’‑
唾液酸乳糖
[0119]
具体步骤如下：
[0120]
(1)培养基的配置
[0121]
种子培养基的成分包括：5g/l酵母粉，10g/l蛋白胨，10g/l氯化钠。
[0122]
发酵培养基的成分：12g/l酵母粉，5g/l蛋白胨，6g/l(nh4)2so4，12.5g/l k2hpo4·
4h2o，2.5g/lkh2po4，3g/lmg2so4·
7h2o，20g/l葡萄糖，5g/l乳糖，微量元素10ml/l。微量元素：4g/lfe2so4·
7h2o，4g/l cacl2，1g/lmnso4·
5h2o，0.4g/lcocl2·
6h2o，0.2g/lnamoo4·
2h2o，0.2g/lznso4·
7h2o，0.1g/lalcl3·
6h2o，0.1g/lcucl2·
h2o，0.05g/lh3bo4。
[0123]
(2)菌株发酵参数
[0124]
培养条件：37℃，220rpm震荡培养12-15h，制备得到种子液。将种子液按照5％的接种量接种至装有50ml发酵培养基的500ml带锥形瓶中，在37℃，220rpm条件下培养72h，制备得到发酵液。
[0125]
(3)3
’‑
唾液酸乳糖产量测定
[0126]
将实施例2提供的25株基因工程菌发酵72h的发酵液分别在12000r/min条件下离心10min，吸取500ul发酵液上清，与纯乙腈1：1混合均匀，震荡5min后，12000r/min条件下离心10min，利用lc/ms进行胞外产物的测定，检测结果如表7所示。
[0127]
表7 3
’‑
唾液酸乳糖的产量统计
[0128][0129][0130]
由表7可知，25株基因工程菌中3
’‑
唾液酸乳糖的产最高量达到110.9mg/l。应用例3基因工程菌选取最优碳源摇瓶发酵生产3
’‑
唾液酸乳糖
[0131]
具体步骤如下：
[0132]
(1)培养基的配置
[0133]
种子培养基的成分包括：5g/l酵母粉，10g/l蛋白胨，10g/l氯化钠。
[0134]
发酵培养基的成分：12g/l酵母粉，5g/l蛋白胨，6g/l(nh4)2so4，12.5g/l k2hpo4·
4h2o，2.5g/lkh2po4，3g/lmg2so4·
7h2o，5g/l乳糖，微量元素10ml/l，其中碳源分别为10g/l、20g/l，30g/l、40g/l和60g/l葡萄糖。
[0135]
微量元素：4g/l fe2so4·
7h2o，4g/l cacl2，1g/l mnso4·
5h2o，0.4g/lcocl2·
6h2o，0.2g/lnamoo4·
2h2o，0.2g/lznso4·
7h2o，0.1g/lalcl3·
6h2o，0.1g/lcucl2·
h2o，0.05g/lh3bo4。
[0136]
(2)菌株发酵参数
[0137]
培养条件：37℃，220rpm震荡培养12-15h，制备得到种子液。将种子液按照5％的接
种量接种至装有50ml发酵培养基的500ml带锥形瓶中，在37℃，220rpm条件下培养72h，制备得到发酵液。
[0138]
(3)3
’‑
唾液酸乳糖产量测定
[0139]
将实施例2中3
’‑
唾液酸乳糖产量最高的基因工程菌(p43-neua-pm1-nst
‑△
yesz)发酵72h的发酵液在12000r/min条件下离心10min，吸取500ul发酵液上清，与纯乙腈1：1混合均匀，震荡5min后，12000r/min条件下离心10min，lc/ms进行胞外产物的测定，测定结果如表8所示。
[0140]
表8不同碳源下3
’‑
唾液酸乳糖产量统计
[0141][0142]
由表8可知，重组工程菌中3
’‑
唾液酸乳糖的产最高量达到185.2mg/l，其中最优碳源为添加10g/l葡萄糖。
[0143]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本发明的发明人来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。