利用AS-SRK46打破大白菜远缘杂交障碍的用法和应用的制作方法

利用as-srk46打破大白菜远缘杂交障碍的用法和应用
技术领域
1.本发明属于十字花科植物育种技术领域，具体涉及克服十字花科植物远缘杂交不亲和的试剂及用法和应用。


背景技术：

2.植物远缘杂交(distant hybridization)指分类学上物种以上分类单位的个体之间交配，包括不同种间、属间植物，甚至更远物种之间的杂交。通过远缘杂交障碍，把两个物种经过长期进化积累起来的有益性状重新组合，以形成新的产量、品质性状和对病、虫、寒、旱、涝等胁迫的抗(耐)性状等，创制新的种质资源。但是，种间生殖隔离是远缘杂交育种的难题，从花粉粒的附着、萌发、花粉管的生长、双受精的完成等，其中任何一个环节发生障碍，都会直接导致杂交失败，主要体现在受精前障碍和受精后障碍。受精前障碍(pro-zygoticbarriers)是指2个可育的物种进行授粉后，其受精过程完全不能进行；受精后障碍(post-zygotic barriers)是指杂种胚败育，远缘杂交能够完成双受精作用，但不能正常发育，花粉管穿过胚珠后，雄配子才释放出来，于是雄配子与雌配子就不能相遇，因此无法融合。
3.而远缘花粉与柱头的不亲和，是远缘杂交的第一个障碍，这在很大程度上限制了远缘杂交育种的进展。因此，探索高效的广泛适用的克服远缘杂交不亲和的方法是远缘杂交育种的重要组成部分之一。
4.在生产上已经尝试过许多克服远缘杂交不亲和的方法，但都存在效率低不适宜推广等问题。因此，急需寻找一种更高效的易推广的克服远缘杂交不亲和性的方法。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供了利用as-srk46打破大白菜远缘杂交障碍的用法和应用，能不同程度地提高远缘杂交指数，获得远缘杂交胚，操作简单方便，易于推广。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种克服十字花科植物远缘杂交不亲和的试剂，所述试剂主要成分是 as-brsrk46。
8.所述试剂中还包含有tween-20。
9.所述as-brsrk46在试剂中的浓度为10μm或20μm。
10.所述试剂中tween-20的体积百分含量为0.0125％。
11.克服十字花科植物远缘杂交不亲和的试剂的用法，包含有如下步骤：上午向十字花科植物的蕾期柱头或花期柱头上滴加两次试剂，第二次滴加后进行授粉。
12.所述试剂的滴加间隔为30min，每次的滴加量为每个柱头1μl。
13.克服十字花科植物远缘杂交不亲和的试剂在抑制brsrk46基因表达上的应用。
14.克服十字花科植物远缘杂交不亲和的试剂在十字花科植物育种中的应用。
15.有益效果：在本发明实施例中，利用as-brsrk46抑制大白菜(brassica rapa
l.ssp.pekinensis)花期柱头srk基因的表达，有效克服了大白菜与甘蓝(b. oleracea var.acephala dc.)的种间杂交不亲和及大白菜与萝卜(raphanus sativusl.)、芝麻菜(eruca sativa mill.)的属间杂交不亲和，促进甘蓝、萝卜与芝麻菜花粉在大白菜花期柱头上萌发、生长、进入柱头并完成受精过程。另一方面，柱头srk的表达量随着花发育而逐步升高并在花期到达顶峰，因此在蕾期柱头中srk表达量比较低的基础上，利用as-brsrk46进一步抑制大白菜蕾期柱头 srk基因的表达，有效克服大白菜与欧洲山芥(barbarea vulgaris r.br)的属间杂交不亲和，促进欧洲花粉在大白菜蕾期柱头上萌发、生长、进入柱头并完成受精过程。本发明适用于芸薹属作物的远缘杂交不亲和。田间实验结果表明，滴加as-brsrk46抑制柱头srk基因表达之后，大白菜与甘蓝远缘杂交的膨大胚珠率58.86％，大白菜与欧洲山芥远缘杂交的膨大胚珠率为3.33％，大白菜与萝卜远缘杂交的膨大胚珠率为17.32％，大白菜与芝麻菜远缘杂交的膨大胚珠率为14.30。本发明抑制所述基因及反义寡核苷酸方法对植物伤害性小，克服远缘杂交不亲和的效果显著，应用范围广，可以应用到大白菜、甘蓝等芸薹属作物、各种萝卜属作物及芝麻菜属作物；而且该方法可以进一步用于克服十字花科其他作物的远缘杂交不亲和，对十字花科作物的育种具有重要的价值。
附图说明
16.图1大白菜、甘蓝与欧洲山芥之间的亲缘关系；
17.图2甘蓝、萝卜、芝麻菜与欧洲山芥花粉在大白菜花期、蕾期柱头上生长情况；
18.图3为brsrk46在不同时期蕾期柱头(开花期3天、2天、1天)和花期柱头(开花前0天)的表达量；
19.图4为反义寡核苷酸处理后柱头中brsrk46表达量；
20.图5为十字花科不同物种srk核苷酸序列对比图；
21.图6为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与甘蓝(
♂
)远缘杂交花粉管的生长；
22.图7为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与甘蓝(
♂
)远缘杂交的果荚长度；
23.图8为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与甘蓝(
♂
)远缘杂交果荚内的膨大胚珠数；
24.图9为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与甘蓝(
♂
)远缘杂交胚12天的发育时期；
25.图10为滴加试剂后大白菜蕾期柱头(
♀
)与欧洲山芥(
♂
)远缘杂交花粉管的生长；
26.图11为滴加试剂后大白菜蕾期柱头(
♀
)与欧洲山芥(
♂
)远缘杂交的果荚长度；
27.图12为滴加试剂后大白菜蕾期柱头(
♀
)与欧洲山芥(
♂
)远缘杂交果荚内的膨大胚珠数；
28.图13为滴加试剂后大白菜蕾期柱头(
♀
)与欧洲山芥(
♂
)远缘杂交胚12 天的发育时期；
29.图14为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与萝卜(
♂
)远缘杂交花粉管的生长；
30.图15为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与萝卜(
♂
)远缘杂交的果荚长度；
31.图16为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与萝卜(
♂
)远缘杂交果荚内的膨大胚珠数；
32.图17为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与萝卜(
♂
)远缘杂交胚12天的发育时期。
33.图18为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与芝麻菜(
♂
)远缘杂交花粉管的生长；
34.图19为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与芝麻菜(
♂
)远缘杂交的果荚长度；
35.图20为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与芝麻菜(
♂
)远缘杂交果荚内的膨大胚珠数；
36.图21为滴加试剂后大白菜花期柱头(
♀
)与芝麻菜(
♂
)远缘杂交胚12 天的发育时期。
具体实施方式
37.本发明所称选择受精(selective fertilization)，经《现代生态学》记载，为具有特定遗传基础的精核与卵细胞优先受精的现象，选择受精主要表现为生理生化和遗传上的特性，包括远缘杂交不亲和性、多个花粉精核间的竞争等现象。在本发明中，所述植物选择受精优选包括远缘杂交不亲和性。在本发明实施例中，以大白菜与甘蓝远缘杂交，及大白菜与欧洲山芥的远缘杂交为例进行说明，可以进一步用于克服十字花科植物的远缘杂交不亲和性，对十字花科作物的育种具有重要的价值。
38.一种克服十字花科植物远缘杂交不亲和的试剂，所述试剂主要成分是针对 brsrk46的反义寡核苷酸as-brsrk46及其相应的正义寡核苷酸对照 s-brsrk46，通过化学合成而来，碱基序列见表1
39.表1 s-brsrk46和as-brsrk46碱基序列
[0040][0041]
在本发明所述十字花科植物中，克服十字花科植物的种间和属间远缘杂交不亲和，促进柱头上萌发、生长、进入柱头并完成受精过程。在本发明中，针对不同种属的十字花科植物，其所用的as-brsrk46浓度略有不同，如大白菜与甘蓝所需的浓度为30μm；大白菜与欧洲山芥所需的浓度为40μm等。上述浓度的as-brsrk46，需要tween-20增加柱头对花粉的粘附性和渗透性，试剂中tween-20的体积百分含量为0.0125％。
[0042]
上述试剂的使用方法是：上午向十字花科植物的蕾期柱头或花期柱头上滴加两次试剂，第二次滴加后进行授粉。
[0043]
滴加时，优选于晴天上午8:00-10:00时间段滴加所述试剂，所述试剂的滴加间隔为30min，每次的滴加量为每个柱头1μl。
[0044]
下面结合实施例对本发明提供的抑制brsrk46在克服十字花科植物选择受精中的应用及试剂和方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0045]
实施例1
[0046]
如图1所示，大白菜与甘蓝亲缘关系较近，属于种间杂交，而大白菜与欧洲山芥亲缘关系较远，属于属间杂交；如图2所示，甘蓝和欧洲山芥花粉在大白菜花期柱头均不萌发，而甘蓝、萝卜和芝麻菜花粉在大白菜蕾期柱头可以萌发；且brsrk46的表达量在大白菜蕾期到花期的发育过程中呈上升趋势(详情见图3)，但欧洲山芥花粉在大白菜蕾期柱头上也不萌发(详情见图2)。我们猜测大白菜与甘蓝和大白菜与欧洲山芥远缘杂交不亲和与大白菜柱头中brsrk46 基因相关，因此我们利用反义寡核苷酸技术瞬时沉默大白菜柱头中
brsrk46基因，降低大白菜花期和蕾期柱头中brsrk46表达量(详情见图4)，且 as-brsrk46核苷酸序列选择区域为srk基因的保守区，可以降低不同s-单元型的大白菜柱头中srk的表达。基于不同十字花科植物srk的保守区序列的相似性(详情见图5)，推测as-brsrk46也可以降低不同十字花科植物srk的表达，因此也适用于克服十字花科其他作物的远缘杂交不亲和性。
[0047]
实施例2
[0048]
大白菜在滴加as-brsrk46前一天摘除已经开放的花，套收种袋。第二天上午对新开的花去雄，进行2次as-brsrk46滴加(as-brsrk46溶液含有 0.0125％的tween20)，as-brsrk46浓度为30μm，每次间隔30min，第二次滴加后授甘蓝花粉，套收种带防止污染其他花粉，6天之后摘掉收种袋，12天后进行果荚解剖，统计果荚内膨大胚珠情况。
[0049]
结果如图6～图9和表2所示滴加as-brsrk46后，使穿过每个大白菜柱头的平均粉管数由原来的0增加到99.55(详情见图6)；使大白菜与甘蓝远缘杂交后12天的果荚长度从原来的6.68mm提高到16.79mm(详情见图7)；使大白菜与甘蓝远缘杂交后的每个果荚内膨大胚珠由原来的0增加到18.70；使大白菜与甘蓝远缘杂交后的膨大胚珠率由原来的0.00提高到58.86％(详情见图8和表2)；使大白菜与甘蓝远缘杂交12天后胚发育到球形胚(详情见图9)。
[0050]
表2滴加as-brsrk46后大白菜花期柱头(
♀
)与甘蓝(
♂
)种间杂交后果荚内胚珠情况统计
[0051][0052]
实施例3
[0053]
大白菜在滴加as-brsrk46前一天摘除已经开放的花，套收种袋。第二天上午对花蕾去雄，进行2次滴加as-brsrk46(as-brsrk46溶液含有0.0125％的tween20，as-brsrk46浓度为40μm)，每次间隔30min，第二次滴加后授欧洲山芥花粉，套收种带防止污染其他花粉，6天后摘掉收种袋，12天后进行果荚解剖，统计果荚内胚珠情况。
[0054]
结果如图10～图13和表3所示，滴加as-brsrk46后，使穿过每个大白菜柱头的花粉管数由原来的0增加到44.50(详情见图10)；使大白菜与欧洲山芥远缘杂交后12天的果荚长度从原来的8.61mm提高到13.68mm(详情见图11)；使大白菜与欧洲山芥远缘杂交后的每个果荚内膨大胚珠由原来的0增加到1.1；使大白菜与欧洲山芥远缘杂交后的膨大胚珠率由原来的0.00提高到3.33％(详情见图12和表3)；使大白菜与欧洲山芥远缘杂交12天后胚发育到球形胚(详情见图13)。
[0055]
表3滴加as-brsrk46后大白菜蕾期柱头(
♀
)与欧洲山芥(
♂
)属间杂交后果荚内胚珠情况统计
[0056][0057]
实施例4
[0058]
大白菜在滴加as-brsrk46前一天摘除已经开放的花，套收种袋。第二天上午对新开花序去雄，进行2次as-brsrk46滴加(as-brsrk46溶液含有 0.0125％的tween20，as-brsrk46浓度为30μm，每次间隔30min，第二次滴加后授萝卜花粉，套收种带防止污染其他花粉，6天之后摘掉收种袋，12天后进行果荚解剖，统计果荚内膨大胚珠情况。
[0059]
结果如图14～图17和表4所示滴加as-brsrk46后，使穿过每个大白菜柱头的平均粉管数由原来的0增加到118.8(详情见图14)；使大白菜与萝卜远缘杂交后12天的果荚长度从原来的7.61mm提高到27.20mm(详情见图15)；使大白菜与萝卜远缘杂交后的每个果荚内膨大胚珠由原来的0增加到5.40；使大白菜与萝卜远缘杂交后的膨大胚珠率由原来的0.00提高到17.32％(详情见图16 和表4)；使大白菜与萝卜远缘杂交12天后胚发育到球形胚(详情见图17)。
[0060]
表4滴加as-brsrk46后大白菜花期柱头(
♀
)与萝卜(
♂
)属间杂交后果荚内胚珠情况统计
[0061][0062]
实施例5
[0063]
大白菜在滴加as-brsrk46前一天摘除已经开放的花，套收种袋。第二天上午对新开花序去雄，进行2次as-brsrk46滴加(as-brsrk46溶液含有 0.0125％的tween20，as-brsrk46浓度为40μm，每次间隔30min，第二次滴加后授芝麻菜花粉，套收种带防止污染其他花粉，6天之后摘掉收种袋，12天后进行果荚解剖，统计果荚内膨大胚珠情况。
[0064]
结果如图18～图21和表5所示滴加as-brsrk46后，使穿过每个大白菜柱头的平均粉管数由原来的0增加到75.40(详情见图18)；使大白菜与芝麻菜远缘杂交后12天的果荚长度从原来的7.67mm提高到27.67mm(详情见图19)；使大白菜与芝麻菜远缘杂交后的每个果荚内膨大胚珠由原来的0增加到4.7；使大白菜与芝麻菜远缘杂交后的膨大胚珠率由原来的0.00提高到14.30％(详情见图20和表5)；使大白菜与芝麻菜远缘杂交12天后胚发育到球形胚(详情见图21)。
[0065]
表5滴加as-brsrk46后大白菜花期柱头(
♀
)与芝麻菜(
♂
)属间杂交后果荚内胚珠情况统计
[0066][0067]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。