一种绿色高效制备人乳替代脂的方法及应用

1.本发明涉及一种绿色高效制备人乳替代脂的方法及应用，属于食品加工技术领域。


背景技术：

2.一直以来，人乳都被认为是婴幼儿最合适的食物，世界卫生组织和联合国儿童基金会都建议对0～6个月的婴幼儿进行纯母乳喂养。作为人乳中含量仅次于乳糖的宏量成分，人乳脂 (3％～5％)不仅为婴幼儿提供生长所需要的超过50％的能量，还为其生长提供必需脂肪酸，脂溶性维生素，同时还有激素和类二十烷酸的前体物质。然而，由于各种社会和现实因素，纯母乳喂养很难完全实现。随着全球人乳喂养率的降低，婴幼儿配方奶粉的发展逐年攀升，市场规模逐渐增大。人乳脂作为人乳中一种主要且重要成分，对婴儿健康具有长期的影响，为了达到和母乳喂养相类似的喂养效果，如何在生产配方奶粉时模拟这一重要成分是科学家和厂家共同关注的问题。
3.近年来，为了模拟人乳中脂质成分，以更好实现婴儿配方奶粉的母乳化，人乳替代脂(婴幼儿配方食品专用脂)常被作为一种重要成分添加到婴配奶粉中。目前，有关人乳替代脂的制备研究有很多，但是人乳脂的复杂，脂肪酸众多，并不是简单的物理混合和酯交换所能完全实现的，比如：有通过数学模型计算对多种动植物油进行物理混合制备人乳替代脂，所得产物脂肪酸组成与人乳相似，但分布却与人乳差异很大；采用酶酯交换制备富含opo的结构酯或富含sn-2位棕榈酸的结构酯，通常是采用酸与油酯交换，油与油酯交换，采用一步、两步、三步法，并对其反应条件进行优化，反应体系采用有机溶剂体系如正己烷以及无溶剂体系，但是酶价格昂贵，有机溶剂有毒，反应时间长。
4.因此，寻求与人乳脂更相似的原料油，更简单的制备方法，更绿色高效的反应体系对于人乳替代脂的制备及实现婴儿配方奶的母乳化有重大意义。


技术实现要素：

5.[技术问题]
[0006]
现有技术已制备出脂肪酸组成与人乳脂高度相似的人乳替代脂，但脂肪酸分布差异较大；且现有人乳替代脂的制备方法所需反应时间较长，对原料油要求较高，制备方法以及后续处理比较复杂，成本较高，部分研究的酶促酯交换反应过程在有机溶剂中进行，不够经济环保。
[0007]
[技术方案]
[0008]
为了解决上述问题，本发明提供了一种新型绿色溶剂体系-低共熔溶剂体系，以富含sn-2 位棕榈酸的油脂和富含油酸的油脂或油酸、油酸甲酯、油酸乙酯为原料油，在1，3位特异性脂肪酶的作用下通过酯交换一步生成富含opo结构酯的混合酯，之后根据混合酯和天然动植物油的脂肪酸组成和分布，将混合酯与天然动植物油进行物理混合来制备与人乳脂高度相似的人乳替代脂。
[0009]
本发明的第一个目的是提供一种用于人乳替代脂的富含opo结构酯的混合酯的方法，包括如下步骤：
[0010]
将油脂混合物和低共熔溶剂溶液混合，得到混合物；之后在混合物中加入固定化酶进行酯交换反应；反应结束后，将反应产物离心，回收固定化酶；之后在上清液中加水进行水化，静置，分离，回收水相，去除油相中的游离脂肪酸后得到富含opo结构酯的混合酯；
[0011]
其中，所述的油脂混合物为富含sn-2位棕榈酸的油脂和富含油酸的油脂、脂肪酸或脂肪酸酯的混合物；富含sn-2位棕榈酸的油脂包括棕榈硬脂、分提棕榈硬脂、猪油中的一种或几种；富含油酸的油脂、脂肪酸或脂肪酸酯包括高油酸花生油、菜籽油、油酸、油酸甲酯、油酸乙酯中的一种或几种；富含sn-2位棕榈酸的油脂和富含油酸的油脂、脂肪酸或脂肪酸酯的质量比为1：1～1：6；
[0012]
低共熔溶剂为氯化胆碱和尿素的混合物、氯化胆碱和甘油的混合物、氯化胆碱和葡萄糖的混合物、氯化胆碱和柠檬酸的混合物中的一种或几种。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，所述的氯化胆碱和尿素(甘油、葡萄糖或柠檬酸)的摩尔比为1：1～1：4。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，所述的油脂混合物的制备方法为将富含sn-2位棕榈酸的油脂和富含油酸的油脂、脂肪酸或脂肪酸酯水浴融化后混合。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，所述的低共熔溶剂溶液为低共熔溶剂水溶液，具体制备方法为将低共熔溶剂加入水中，60～100℃、300～800rpm搅拌至得到澄清溶液；其中，低共熔溶剂和水的质量比为85～95：5～15。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，所述的固定化酶包括novozyme 435、lipozyme tlim、 lipozyme rmim中的一种。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，所述的固定化酶的添加量相对于混合物的质量为2％～10％。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，所述的酯交换反应是50～80℃、200～500rpm下反应0.5～10h。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，所述的离心是室温下5000～10000rpm离心10～20min。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，所述离心得到的沉淀是固定化酶，固定化酶可以循环利用2～15次。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，所述水的添加量为上清液质量的0.5～4倍；静置是常温静置10～20min。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，所述水相为低共熔溶剂，可循坏利用4～6次。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，所述去除油相中的游离脂肪酸是先测试油相的酸价，之后加入碱液去除游离脂肪酸；测试酸价的方法是：在油相中加入乙醚/异丙醇混合液和酚酞指示剂，充分振荡溶解，之后采用标准滴定液滴定，当初现微红色，且15s内无明显褪色时，为滴定的终点，立刻停止滴定，记录滴定所消耗的标准滴定液的体积，计算游离脂肪酸的含量；其中油相和乙醚/异丙醇混合液的用量比为1～5g：30～50ml，乙醚/异丙醇混合液中乙醚、异丙醇的体积比为1：1；酚酞指示剂2～3滴；标准滴定液为0.1mol/l koh溶液，溶剂为水；碱液为0.5mol/l koh溶液，溶剂为体积分数为30％的乙醇水溶液。
[0024]
在本发明的一种实施方式中，所述的用于人乳替代脂的富含opo结构酯的混合酯的方法，包括如下步骤：
[0025]
(1)低共熔溶剂溶液：
[0026]
将低共熔溶剂(的)和水按照质量比9：1，磁力搅拌直至液体澄清透明得到低共熔溶剂溶液；其中，氯化胆碱和尿素的摩尔比为1：2；
[0027]
(2)油脂混合物：
[0028]
将油酸和棕榈硬脂按照质量比为4：1融化后混匀，得到油脂混合物；
[0029]
(3)酯交换：
[0030]
将油脂混合物和低共熔溶剂溶液按照质量比1：2混合，得到混合物；之后将混合物混合均匀，之后再加入lipozyme rmim进行酯交换反应，继续反应；
[0031]
(4)回收固定化酶：
[0032]
反应结束后，将反应产物离心，回收固定化酶；
[0033]
(5)回收低共熔溶剂：
[0034]
在上清液中加水轻轻摇晃进行水化，常温静置30min，分离水相和油相，回收水相(低共熔溶剂)；
[0035]
(6)油相的酸价测定：
[0036]
取1g油相加入10ml乙醚/异丙醇(1：1，v/v)混合液和2滴酚酞指示剂，充分振荡溶解，再用标准滴定液对溶液进行手工滴定，当溶液初现微红色，且15s内无明显褪色时，为滴定的终点，立刻停止滴定，记录滴定所消耗的标准滴定液的体积，计算游离脂肪酸的含量；
[0037]
(7)纯化：
[0038]
根据测得的酸价，向油相加入1.5倍游离脂肪酸含量的0.5mol/l koh溶液，溶剂为体积分数为30％的乙醇水溶液；得到富含opo结构酯的混合酯。
[0039]
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的富含opo结构酯的混合酯的方法。
[0040]
本发明的第三个目的是提供一种绿色高效制备人乳替代脂的方法，包括如下步骤：
[0041]
将富含opo结构酯的混合酯和天然动植物油按照合适比例混合，得到所述的人乳替代脂。
[0042]
在本发明的一种实施方式中，所述富含opo结构酯的混合酯和天然动植物油的混合比例是通过数学模型规划求解，具体是以原料成本最低为目标函数，主要脂肪酸和sn-2位脂肪酸组成为约束条件，由excel加载项的规划求解实现。
[0043]
在本发明的一种实施方式中，所述天然动植物油包括椰子油、猪油、红花籽油、棕榈仁硬脂、葵花籽油中的一种或几种。
[0044]
在本发明的一种实施方式中，所述的绿色高效制备人乳替代脂的方法，包括如下步骤：
[0045]
将富含opo结构酯的混合酯、椰子油、猪油、红花籽油按照质量比0.31：0.17：0.40： 0.12混合；
[0046]
或，将富含opo结构酯的混合酯、棕榈仁硬脂、葵花籽油、红花籽油和猪油按照质量比为0.5：0.16：0.05：0.08：0.21混合，得到所述的人乳替代脂。
[0047]
本发明的第四个目的是本发明所述的方法制备得到的人乳替代脂。
[0048]
本发明的第五个目的是本发明所述的人乳替代脂在食品领域的应用。
[0049]
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是用于制备婴幼儿奶粉。
[0050]
[有益效果]
[0051]
(1)低共熔溶剂是一种由两种或多种固体组分在一定温度下按一定比例制备成的新型绿色溶剂，与传统有机溶剂相比，具有低成本、环保、安全等显著优势。
[0052]
(2)本发明以富含sn-2位棕榈酸的油脂及油酸或油酸甲酯为原料油，在sn-1,3位专一性脂肪固定化酶的催化作用下酯交换得到富含opo结构酯的混合酯，整个反应一步完成，操作简单，且反应所需要的固定化酶可以回收并循环利用2～15次而不显著降低产物得率。
[0053]
(3)本发明采用低共熔溶剂作为反应体系制备人乳替代脂，该新型溶剂能够显著加快酯交换反应的进程，大大缩短反应时间，降低成本，且该溶剂经济环保，能够循环使用4～6次而不显著降低产物得率；
[0054]
(4)本发明通过酯交换和物理混合制备出的人乳替代脂与人乳脂高度相似，且具有更低的经济成本。
附图说明
[0055]
图1为基于低共熔溶剂体系制备人乳替代脂的工艺流程图。
[0056]
图2为实施例1和对比例1的混合酯的薄层色谱图(右边对应实施例1，左边对应对比例1)。
具体实施方式
[0057]
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
[0058]
测试方法：
[0059]
脂肪酸组成：采用气相和52种脂肪酸甲酯混合物标准品对脂肪酸定性和定量，具体如下：
[0060]
(1)称取熔融状态下40～60mg油脂于玻璃具塞试管中，加入2ml0.5mol/lkoh-ch3oh溶液，置于65℃恒温振荡水浴锅中皂化30min；
[0061]
(2)加入2mlbf
3-ch3oh(1:3,v/v)溶液，置于70℃恒温振荡水浴锅中甲酯化10min，冷却至室温；
[0062]
(3)加入2ml正己烷并剧烈振荡1～2min，待其静置分层后，吸取上层有机相，并加入无水硫酸钠吸取少量水分，过0.22μm有机滤膜后进行气相分析。
[0063]
sn-2位脂肪酸组成：采用气相和52种脂肪酸甲酯混合物对脂肪酸定性和定量，具体如下：
[0064]
(1)称取熔融状态下100～200mg油脂于具塞试管中，加入30～40mg猪胰脂酶，tris(ph8.0)2ml，胆酸钠(1g/l)0.5ml，cacl2(220g/l)0.2ml，涡旋混匀，在37℃水浴振荡3～5min；
[0065]
(2)加入hcl(6mol/l)1ml，乙醚2ml剧烈振荡终止酶解反应，5000rpm离心5min取
上层有机相于离心管中真空浓缩至50～100微升；
[0066]
(3)经tlc分离，刮下单甘酯条带，用2ml乙醚萃取两次，取上层有机相于离心管中真空浓缩蒸干；
[0067]
(4)向蒸干产物中加入2ml 0.5mol/l koh-ch3oh溶液，置于65℃恒温振荡水浴锅中皂化30min；
[0068]
(5)加入2ml bf
3-ch3oh(1:3,v/v)溶液，置于70℃恒温振荡水浴锅中甲酯化10min，冷却至室温；
[0069]
(6)加入2ml正己烷并剧烈振荡1～2min，待其静置分层后，取上层有机相真空浓缩蒸干；
[0070]
(7)加入150μl正己烷复溶，并在14000rpm离心15min，气相分析。
[0071]
实施例1
[0072]
一种制备富含opo结构酯的混合酯的方法，包括如下步骤：
[0073]
(1)低共熔溶剂溶液：
[0074]
将低共熔溶剂(摩尔比为1：2的氯化胆碱和尿素)和水按照质量比9：1，在80℃、500rpm 下磁力搅拌2h，直至液体澄清透明得到低共熔溶剂溶液；
[0075]
(2)油脂混合物：
[0076]
将放在-20℃的猪油和油酸拿出并水浴融化，待其完全融化后混匀，得到油脂混合物；其中油酸和猪油的质量比为4：1；
[0077]
(3)酯交换：
[0078]
将油脂混合物和低共熔溶剂溶液按照质量比1：2混合，得到混合物；之后将混合物在 65℃、350rpm下先搅拌孵育10min混合均匀，之后再加入混合物质量6％的novozyme 435 进行酯交换反应，继续反应时间为1h；
[0079]
(4)回收固定化酶：
[0080]
反应结束后，将反应产物室温、5000rpm离心10min，分离沉淀(回收固定化酶)；
[0081]
(5)回收低共熔溶剂：
[0082]
在上清液中加水(上清液质量的2倍)轻轻摇晃进行水化，常温静置30min，分离水相和油相，回收水相(低共熔溶剂)；
[0083]
(6)油相的酸价测定：
[0084]
取1g(精确到0.001)油相于烧杯中，加入10ml乙醚：异丙醇(1：1)混合液和2滴酚酞指示剂，充分振荡溶解，再用装有标准滴定液(0.1mol/l koh溶液，溶剂为水)的刻度滴定管对溶液进行手工滴定，当溶液初现微红色，且15s内无明显褪色时，为滴定的终点，立刻停止滴定，记录滴定所消耗的标准滴定液的体积，计算游离脂肪酸的含量；
[0085]
(7)纯化：
[0086]
根据测得的酸价，向油相加入1.5倍游离脂肪酸含量的0.5mol/l koh溶液，溶剂为体积分数为30％的乙醇水溶液；得到富含opo结构酯的混合酯。
[0087]
将得到的富含opo结构酯的混合酯进行脂肪酸组成和分布的测试，测试结果见表1：
[0088]
从表1可以看出：由于novozyme 435是非特异性脂肪酶，能够将三个位置的脂肪酸同时水解下来，油酸在体系中占比更多，更容易结合到甘油三酯的骨架上，所以导致其棕榈
酸和 sn-2棕榈酸较低，油酸和sn-2位油酸含量较高，但其相对sn-2位棕榈酸含量为72.09％(其中)，与人乳脂相似。
[0089]
表1猪油与油酸酯交换产物的脂肪酸组成和分布
[0090][0091]
注：c16:0为棕榈酸；c18:1(n-9)为油酸；c18:2(n-6)为亚油酸。
[0092]
实施例2
[0093]
调整实施例1中novozyme 435为lipozyme tlim，其他和实施例1保持一致，得到富含 opo结构酯的混合酯。
[0094]
将得到的富含opo结构酯的混合酯进行脂肪酸组成和分布的测试，结果见表2：
[0095]
从表2可以看出：lipozyme tlim是特异性脂肪酶，能够水解1，3位脂肪酸，之后油酸酯化到甘油骨架的1，3位上，部分1，3位上的棕榈酸被水解，而sn-2位不变，导致其相对 sn-2位棕榈酸升高。
[0096]
表2实施例2的测试结果
[0097][0098]
注：c16:0为棕榈酸；c18:1(n-9)为油酸；c18:2(n-6)为亚油酸。
[0099]
实施例3
[0100]
调整实施例1中novozyme 435为lipozyme rmim，其他和实施例1保持一致，得到富含opo结构酯的混合酯。
[0101]
将得到的富含opo结构酯的混合酯进行脂肪酸组成和分布的测试，结果见表3：
[0102]
从表3可以看出：lipozyme rmim也是特异性脂肪酶，能够水解1，3位脂肪酸，之后油酸酯化到甘油骨架的1，3位上，部分1，3位上的棕榈酸被水解，而sn-2位不变，导致其相对sn-2位棕榈酸升高，相比于lipozyme tlim，lipozyme rmim更适合催化油与酸的酯交换反应。
[0103]
表3实施例3的测试结果
[0104][0105]
注：c16:0为棕榈酸；c18:1(n-9)为油酸；c18:2(n-6)为亚油酸。
[0106]
实施例4
[0107]
调整实施例1中油酸为油酸甲酯，其他和实施例1保持一致，得到富含opo结构酯的混合酯。
[0108]
将得到的富含opo结构酯的混合酯进行脂肪酸组成和分布的测试，结果如表4：
[0109]
从表4可以看出：根据油酸酯化到甘油骨架上的程度，即油酸的含量来看，69.22％(实施例1)vs 61.92％(实施例4)，可见，在低共溶溶剂体系中，油酸比油酸甲酯更容易发生酯交换反应。
[0110]
表4猪油与油酸甲酯酯交换产物的脂肪酸组成和分布
[0111][0112]
注：c16:0为棕榈酸；c18:1(n-9)为油酸；c18:2(n-6)为亚油酸。
[0113]
实施例5
[0114]
调整实施例3中猪油改为棕榈硬脂，其他和实施例3保持一致，得到富含opo结构酯的混合酯。
[0115]
将得到的富含opo结构酯的混合酯进行脂肪酸组成和分布的测试，结果如表5：
[0116]
从表3可以看出：相比于实施例1，制备得到的结构酯含有更高的sn-2位棕榈酸，但油酸，sn-2位油酸偏高，亚油酸，sn-2位亚油酸偏低。
[0117]
表5棕榈硬脂与油酸酯交换产物的脂肪酸组成和分布
[0118][0119]
注：c16:0为棕榈酸；c18:1(n-9)为油酸；c18:2(n-6)为亚油酸。
[0120]
对比例1
[0121]
省略实施例1中的低共熔溶剂，其他和实施例1保持一致，得到富含opo结构酯的混合酯。
[0122]
将得到的富含opo结构酯的混合酯进行脂肪酸组成和分布的测试，结果如下：
[0123]
棕榈酸，sn-2位棕榈酸，相对sn-2位棕榈酸的含量分别为19.44％，45.95％，78.79％；
[0124]
通过薄层色谱比较实施例1和对比例1得到的混合酯(图2)，结果表明：在低共熔溶剂体系下，酯交换反应进行的更快，得到甘油三酯产物更多，油酸酯化到甘油上的量最多，剩余未反应的脂肪酸更少(图2)，说明相比于无溶剂体系，低共熔溶剂能够促进酯交换反应的进行，缩短反应时间。
[0125]
对比例2
[0126]
省略实施例5中的novozyme 435，其他和实施例5保持一致，得到富含opo结构酯的混合酯。
[0127]
将得到的富含opo结构酯的混合酯进行脂肪酸组成和分布的测试，结果如下：
[0128]
富含opo结构酯的混合酯中棕榈酸含量，sn-2位棕榈酸含量，相对sn-2位棕榈酸含量分别为21.78％，10.12％和15.49％。
[0129]
实施例6
[0130]
一种绿色高效制备人乳替代脂的方法，包括如下步骤：
[0131]
将实施例5制备得到的富含opo结构酯的混合酯和椰子油、猪油、红花籽油进行物理混合，混合的比例按照以原料油价格成本为目标函数，人乳脂主要脂肪酸组成和分布为约束条件，求解满足约束条件的天然动植物油的混合比例；其中目标函数和约束条件如下：
[0132]
目标函数：
[0133][0134]
p为成本，pi为单价，单位元/千克；
[0135]
xi为原料油比例，范围为0～1。
[0136]
约束条件：
[0137]
∑xi＝1
[0138][0139]
pi第i种油第j种脂肪酸的相对百分含量；
[0140]
min,max分别为人乳中某脂肪酸的相对百分含量范围；
[0141]
人乳常量脂肪酸含量范围、人乳常量sn-2位脂肪酸含量见表6、表7：
[0142]
表6人乳常量脂肪酸含量范围
[0143][0144]
表7人乳常量sn-2位脂肪酸含量范围
[0145][0146]
通过计算得到的：混合酯、椰子油、猪油、红花籽油的质量比为0.31：0.17：0.40：0.12；混合之后得到所述的人乳替代脂。
[0147]
将得到的人乳替代脂进行性能测试，测试结果如下表8：
[0148]
表8人乳替代物的脂肪酸组成
[0149][0150]
从表8可以看出：人乳替代物的脂肪酸组成和分布与人乳高度相似。
[0151]
实施例7
[0152]
替换实施例6中的椰子油、猪油、红花籽油为棕榈仁硬脂、葵花籽油、红花籽油和猪油，计算得到混合酯、棕榈仁硬脂、葵花籽油、红花籽油和猪油的质量比为0.5：0.16：0.05：0.08：0.21；
[0153]
混合之后得到所述的人乳替代脂。
[0154]
将得到的人乳替代脂进行性能测试，测试结果如下表9：
[0155]
表9人乳替代物的脂肪酸组成
[0156][0157]
从表9可以看出：人乳替代物的脂肪酸组成和分布与人乳高度相似。
[0158]
对比例3
[0159]
省略实施例6中的富含opo结构酯的混合酯，将椰子油、猪油、红花籽油按照质量比0.17：0.73：0.1进行物理混合，得到人乳替代脂。
[0160]
将得到的人乳替代脂进行性能测试，测试结果如下表10：
[0161]
表10天然动植物油物理混合产物脂肪酸组成
[0162][0163]
对比例4
[0164]
省略实施例6中的数学模型规划求解步骤，直接将实施例5得到的富含opo结构酯的混合酯等比例与天然动植物油混合，即混合酯、椰子油、猪油、红花籽油的质量比为0.25：0.25： 0.25：0.25，得到人乳替代脂。
[0165]
将得到的人乳替代脂进行性能测试，测试结果见表11：
[0166]
表11对比例4的测试结果
[0167][0168]
从表11可以看出，对比例4得到的产物脂肪酸组成与人乳相似，但脂肪酸分布与人乳差异较大。
[0169]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。