一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及粪污处理领域，具体涉及一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.牛粪再生垫料是以牛粪为原料，通过好氧发酵等技术手段生产的一种牛床垫料，已经成为牛粪资源化利用的一种重要技术手段。相较传统垫料，牛粪再生垫料具有原料获取便利且廉价的先天优势，但与沙子等无机垫料相比，牛粪本身就携带许多致病菌，且作为有机物更容易造成微生物的繁殖，因此杀菌是生产牛粪再生垫料过程中必不可少的步骤。
3.然而，在实际生产过程中，奶牛乳房炎致病菌并不能被彻底杀灭，且在牛粪再生垫料使用过程中，奶牛场为了节约成本，垫料不能做到每天更换，这个过程中通过牛体、空气流动等进入垫料的致病微生物会逐渐随着积累和繁殖而增多，包括链球菌(streptococcus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、大肠杆菌(escherichia coli)等奶牛乳房炎致病菌。奶牛乳房炎会导致牛奶产量下降、品质降低、奶牛死亡和淘汰，被认为是奶制品行业成本最高的疾病之一。因此，一种适用于牛粪再生垫料生产和使用过程中抑制奶牛乳房炎致病菌的微生物菌剂是目前市场需要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
5.第一方面，本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌，保藏编号为cgmccno.24846，可在牛粪环境中快速增殖。
6.本发明从牛粪沼渣中筛选出对奶牛源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌圈最大的菌株，进行16s rrna测序，并建立系统发育树，由16s rrna测序结果及系统发育树结果和形态学分析，确定抑菌圈最大的菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌dn-1。
7.本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌dn-1已在2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名：解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为cgmcc no.24846。
8.第二方面，本发明提供一种菌剂，含上述的解淀粉芽孢杆菌。
9.第三方面，本发明提供一种发酵方法，以上述的解淀粉芽孢杆菌作为发酵菌，以纤维素、蛋白质或淀粉作为碳源进行发酵。
10.第四方面，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌发酵液或发酵上清液，所述解淀粉芽孢杆菌发酵液由上述发酵方法发酵得到；所述解淀粉芽孢杆菌发酵上清液，由解淀粉芽孢
1.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 0.5g，琼脂14.0g，去离子水1000ml，ph值自然，加热融化后，121℃灭菌20min，待冷却至50℃倒平板。
29.0.9％nacl溶液：nacl 9.0g，去离子水1000ml，121℃灭菌20 min。
30.lb肉汤培养基配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，nacl10.0g，1000ml去离子水，溶解后121℃灭菌20min。
31.lb琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl 10.0 g，琼脂15.0g，1000ml去离子水，溶解后121℃灭菌15min，待其冷却至50℃到平板。
32.筛选步骤，具体如下：
33.(1)取50g牛粪沼渣置于锥形瓶中，封口膜封口后放入恒温箱 37℃富集5d。
34.(2)取5g富集后的牛粪沼渣置于锥形瓶中，加入45g的0.9％ nacl溶液，充分震荡，取1ml上清液用0.9％nacl溶液稀释成10-2
～ 10-5
浓度梯度，取100μl不同浓度梯度的稀释液涂布于cmc-na培养基。在生化培养箱中倒置培养24h后，选取不同形态的单一菌落进行数次划线分离，直至纯化成单一菌株。
35.(3)将待测菌株接种在lb平板上培养24h进行活化，然后用接种环挑取待测菌株接种于lb液体培养基，置于恒温震荡培养箱37℃、 150r/min培养至对数生长期，进行抑菌试验。
36.(4)将待测菌株接种在lb平板上培养24h进行活化，然后用接种环挑取待测菌株接种于lb液体培养基，置于恒温震荡培养箱37℃、150r/min培养24h，将发酵液在4℃，4000r/min离心12min，将离心后的上清液用22m的水系滤膜过滤2次，进行抑菌试验。
37.(5)取100μl稀释至107cfu/ml的致病菌菌液涂布在lb平板上，待菌液晾干后用直径6mm的打孔器在平板上打4个孔，其中1个孔内注入30μl的lb液体培养基作为对照组，其余3个孔内注入30μl步骤 (3)的待测菌液或步骤(4)的过滤后的上清液，在超净工作台内放置至菌液扩散完毕，将平板置于37℃条件下培养24h，测量待测菌株中，抑菌效果最好的菌株的抑菌圈，见表1。
38.表1抑菌效果最好的菌株的抑菌圈
[0039] 无乳链球菌/mm金黄色葡萄球菌/mm大肠杆菌/mm菌液抑菌圈直径13.16
±
0.0911.69
±
0.048.22
±
0.04上清液抑菌圈直径14.14
±
0.99
‑‑
[0040]
选择抑菌圈最大的菌株进行16s rrna测序，并建立系统发育树，系统发育树见图1。由16s rrna测序结果及系统发育树结果和形态学分析，确定抑菌圈最大的菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌dn-1。解淀粉芽孢杆菌dn-1的菌落形态及显微镜镜检形态，见图2和图3。
[0041]
实施例2解淀粉芽孢杆菌dn-1具有多种物质分解能力
[0042]
本实施例提供解淀粉芽孢杆菌dn-1的多种物质分解能力测试，测试所用培养基及步骤如下。
[0043]
蛋白质培养基的配方为：牛肉膏3g，酪蛋白10g，nacl 5g， k2hpo
4 2g，溴百里香酚蓝0.05g，琼脂粉15g，去离子水1000ml， ph值为7.3～7.5，121℃灭菌20min，待冷却至50℃倒平板。
[0044]
刚果红染色液：刚果红1g，去离子水1000ml。
[0045]
脱色液：nacl 58.5g，去离子水1000ml。
[0046]
淀粉培养基的配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，nacl 5.0 g，可溶性淀粉30.0g，琼脂15.0g，ph 7.8。
[0047]
测试方法的步骤如下：
[0048]
将实施例1筛选出的解淀粉芽孢杆菌dn-1接种于lb平板上， 37℃活化24h，用接种环挑取接种于lb液体培养基，37℃条件下150 r/min培养3h至浑浊，然后用0.9％的nacl溶液以10倍为梯度进行稀释，取10-4
～10-6
的稀释液100μl涂布于cmc-na平板、蛋白质培养基平板或淀粉培养基平板上，37℃培养48h。
[0049]
在具有蛋白质分解能力或淀粉分解能力的细菌菌落周围会形成明显的透明圈见图4，用游标卡尺测量菌落直径和透明圈直径并记录，结果见表2。
[0050]
纤维素分解能力的测定方法为：选取形成清晰单菌落的平板注入 10ml刚果红染液，静置15min倒掉染液，再注入10ml脱色液，静置15min倒掉脱色液，在具有纤维素分解能力的细菌菌落周围会形成明显的透明圈，用游标卡尺测量菌落直径d和透明圈直径d并记录，一般用d/d判断纤维素分解能力，见表2。
[0051]
表2解淀粉芽孢杆菌dn-1的多种物质分解能力
[0052]
营养源种类菌落直径d/mm分解圈直径d/mmd/d纤维素6.02
±
0.2214.11
±
0.322.34蛋白质11.81
±
0.4923.77
±
0.582.01淀粉6.36
±
0.119.47
±
0.351.44
[0053]
实施例3解淀粉芽孢杆菌dn-1的最适抑菌温度
[0054]
本实施例提供解淀粉芽孢杆菌dn-1的最适抑菌温度，具体探究步骤如下：
[0055]
取100l稀释至107cfu/ml的致病菌菌液涂布在lb平板上，待菌液晾干后用直径6mm的打孔器在平板上打5个孔，其中1个孔内注入30 l的lb液体培养基作为对照组，其余4个孔内注入解淀粉芽孢杆菌 dn-1菌液，在超净工作台内放置至菌液扩散完毕，将平板分别置于 20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下培养24h，测量抑菌圈，见表3。
[0056]
需要说明的是，由于在温度为20℃、25℃、40℃、45℃时，不是无乳链球菌的适宜生长温度，无乳链球菌出现生长过慢或者停止生长或被杀死的现象，导致无乳链球菌的抑菌圈不能读数。
[0057]
表3解淀粉芽孢杆菌dn-1的不同温度下抑菌圈
[0058]
温度/℃无乳链球菌/mm大肠杆菌/mm金黄色葡萄球菌/mm20-8.999.4925-10.6513.313015.1610.7813.143513.5410.2411.8240-8.4212.4845
‑‑
13.14
[0059]
实施例4解淀粉芽孢杆菌dn-1与致病菌于液体共培养
[0060]
本实施例提供解淀粉芽孢杆菌dn-1于lb肉汤培养基中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
[0061]
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、dn-1在lb营养琼脂培养基进行活化，然后分别接种于lb肉汤培养基，37℃、160rpm 进行培养，约3h培养至浑浊，将4种菌在4℃、4000rpm条件下离心6 min，并用lb肉汤培养基进行重悬，该重悬过程进行2次，其中3种致病菌用lb肉汤培养基稀释至107cfu/g备用。
[0062]
进行致病菌和目标菌混合培养的试验，实验组为1支50ml离心管中添加2.5ml的lb肉汤培养基，25μl金黄色葡萄球菌菌液、25μl 大肠杆菌菌液、25μl无乳链球菌菌液，2.5ml的dn-1菌液。其对照组为1支50ml离心管中添加5ml的lb肉汤培养基，25μl金黄色葡萄球菌菌液、25μl大肠杆菌菌液、25μl无乳链球菌菌液，培养3～5h，当菌液浑浊停止。
[0063]
每个处理组设置三个平行。第3d检测其致病菌数量，检测方法为：取待测样品适量，用0.9％nacl溶液进行10倍为梯度的稀释，选择合适梯度的菌液100μl分别涂布于麦康凯琼脂培养基(大肠杆菌呈桃红色菌落)、改良爱德华培养基(链球菌呈蓝绿色菌落)、 baird-parker琼脂培养基(金黄色葡萄球菌呈黑色菌落)，37℃倒置培养18～24h，选取菌落数适合的平板进行计数，并计算致病菌数量，解淀粉芽孢杆菌对致病菌的抑制率，见表4。
[0064]
表4 lb肉汤培养基中解淀粉芽孢杆菌对致病菌的抑制率
[0065] 无乳链球菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌抑制率99％以上95％以上-[0066]
实施例5解淀粉芽孢杆菌dn-1用于牛粪生产牛粪再生垫料
[0067]
本实施例提供解淀粉芽孢杆菌dn-1在牛粪中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
[0068]
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、dn-1在lb营养琼脂培养基进行活化，然后分别接种于lb肉汤培养基，37℃、160rpm 进行培养，约3h培养至浑浊，将4种菌分别在4℃、4000rpm条件下离心6min，并用0.9％nacl溶液进行重悬，该重悬过程进行2次，其中致病菌用0.9％nacl溶液稀释至103cfu/g备用，将dn-1再次进行离心，弃上清液将20ml的菌液浓缩至3ml。
[0069]
将20g牛粪装入锥形瓶于121℃灭菌20min，放凉后加入3ml浓缩后的dn-1菌液，三种致病菌分别添加0.2ml，对照组将dn-1菌液换成0.9％nacl溶液，其他条件保持不变，每个处理设置3个平行，培养3d。取待测样品适量，用0.9％nacl溶液进行10倍为梯度的稀释，选择合适梯度的菌液100μl分别涂布于麦康凯琼脂培养基(大肠杆菌呈桃红色菌落)、改良爱德华培养基(链球菌呈蓝绿色菌落)、 baird-parker琼脂培养基(金黄色葡萄球菌呈黑色菌落)，37℃倒置培养18～24h，选取菌落数适合的平板进行计数，并基于对照组计算致病菌抑制率，见表5。
[0070]
表5解淀粉芽孢杆菌对牛粪中致病菌的抑制率
[0071] 无乳链球菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌抑制率99％以上85％以上-[0072]
实施例6解淀粉芽孢杆菌dn-1用于牛粪生产牛粪再生垫料的潜力
[0073]
本实施例提供解淀粉芽孢杆菌dn-1在牛粪中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
[0074]
将金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、dn-1在lb营养琼脂培养基进行活化，然后分别接种于lb肉汤培养基，37℃、160rpm进行培养，约3h培养至浑浊，调节金黄色葡萄球菌、无乳链球菌浓度并添加入 60g灭菌后的牛粪中，使金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的浓度分别为 108cfu/g和107cfu/g，dn-1的菌液取30ml于4℃、4000rpm条件下离心 6min，弃去上清液，将
30ml菌液浓缩至6ml后与致病菌菌液一起添加入牛粪中，对照组用6ml的lb肉汤培养基代替dn-1菌液，其他条件保持一致，每个处理组设置三个平行，2d后检测其无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的数量，并基于对照组计算抑菌率，见图5。
[0075]
处理组牛粪中的无乳链球菌和金黄色葡萄球菌均低于对照组，分别降低了83.2％和28.6％。
[0076]
实施例7解淀粉芽孢杆菌dn-1用于牛粪生产牛粪再生垫料
[0077]
1、本实施例提供解淀粉芽孢杆菌dn-1在牛粪中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
[0078]
将400g鲜牛粪放入有效容积1l容器中，试验组按照3％v/w的接种量接入对数生长期的微生物菌液，对照组按照3％v/w加入无菌水，具体试验方案见表6，30℃恒温培养，第0，4，8，12d取样检测其三种致病菌数量，并基于第0天计算致病菌残留率，结果如表7、表8、表9所示。
[0079]
表6接种物及体积
[0080][0081]
表7金黄色葡萄球菌残留率
[0082][0083]
表8大肠杆菌残留率
[0084][0085]
表9无乳链球菌残留率
[0086][0087]
2、本实施例提供解淀粉芽孢杆菌与其他菌株在牛粪中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
[0088]
将400g鲜牛粪放入有效容积1l容器中，将解淀粉芽孢杆菌dn-1 与芽孢杆菌(保藏编号为：cgmcc no.24847)进行复配，实验组按照3％v/w的接种量接入对数生长期的微生物菌液，对照组按照3％ v/w加入无菌水，具体试验方案见表10，30℃恒温培养，第0，4，8d 取样检测其三种致病菌数量，并基于第0天计算致病菌残留率，结果如表11、表12和表13所示。
[0089]
本发明所提供的芽孢杆菌已在2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，分类命名：芽孢杆菌bacillus sp.，保藏编号为cgmccno.24847。
[0090]
表10接种物及体积
[0091][0092]
表11金黄色葡萄球菌残留率
[0093][0094]
表12大肠杆菌残留率
[0095][0096]
表13无乳链球菌残留率
[0097][0098]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。