一种暗场成像的超构显微成像器件及暗场成像方法

1.本发明涉及一种暗场成像的超构显微镜，以及暗场成像方法，属于超构显微成像领域。


背景技术：

2.传统的光学暗场显微镜是放大成像，光学像相较于被观察物体有非常大的放大倍数，往往是显微物镜进行一次放大成像，后续一系列成像系统将显微物镜所成的像进行二次放大，最终被ccd所接收。上述一系列光学元件导致的光传播方向的距离构成了传统显微系统的大像距。基于上述的“大像距”，传统暗场显微镜有足够大的像方空间来安置照明光源，最经典的暗场照明方式是从显微物镜的周围精准发射环形的照明光聚至样品区域，根据光的反射原理，反射角等于入射角，因此这些聚焦的照明光被样品载玻片直接反射的部分会重新指向照明光源所在区域，而不会被处于环形光源中间的显微物镜所接收，而样品将照明光源背向散射，改变了照明光的反射方向，才使得该部分光进入显微物镜从而被观察到，由于观察到的仅仅是由样品调制的光，而照明光源本身不进入显微物镜，不会形成明亮的背景，因此称作暗场成像。
3.然而，上述暗场照明方案并不适用于超构透镜与cmos图像传感器集成的成像系统miid(doi:10.1117/1.ap.2.6.066004)，因为该系统利用超构透镜超轻超薄的优势，通过等大成像(而非上述放大成像)与cmos图像传感器直接贴合，由此带来的高度集成化的同时也使得像距缩短至毫米甚至百微米量级，不再具备上述传统暗场显微镜利用放大成像所带来的大像方空间安置光源的可能性。因此，为了发展基于miid的暗场显微技术，势必要寻找另一种合适的照明方案。现有基于传统显微镜的暗场成像方法除了反射式环形照明外，还有一种基于波导照明的方法，波导照明方法直接利用样品的载玻片的全内反射特性将其作为光传输的媒介，通过从载玻片端面入射照明光，来防止照明光直接被显微物镜所接收，从而实现“暗场”。此方法虽然有效地规避了暗场成像的照明光源利用像方空间的问题，但也只能服务于传统的显微成像系统，并不能直接应用于miid的暗场成像，更不能用于暗场荧光成像。因为miid的工作原理要求照明光具有偏振可调特性，以及在暗场荧光成像时，由于样品本身发射的荧光强度远小于激发光，因此需要使用一定的方法来彻底隔离激发光，而现有的波导照明方式既不能产生偏振光，也不能隔离激发光。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是提供一种消除色差、提升分辨率的暗场成像的超构显微成像器件，本发明的第二目的是提供一种暗场成像的方法。
5.技术方案：本发明所述的暗场成像的超构显微成像器件，包括照明模块和miid成像模块，所述照明模块包括装片和置于装片一端的led灯条，所述装片中的样品将入射光散射；所述装片上方由下至上分别设有线偏振膜、四分之一波片膜和复合介质滤光膜，所述线偏振膜和四分之一波片膜用于调制向上散射的入射光的偏振态，所述复合介质滤光膜用于
压缩入射光的带宽。
6.进一步地，所述四分之一波片膜包括左四分之一波片膜和右四分之一波片膜，所述左四分之一波片膜的快轴与所述线偏振膜成 45
°
，所述右四分之一波片膜的快轴与所述线偏振膜成-45
°
，分别用于调制左旋圆偏振态和右旋圆偏振态；左四分之一波片膜和右四分之一波片膜上分别粘贴所述复合介质滤光膜。
7.进一步地，所述照明模块还包括用于夹持所述装片和放置所述led灯条的载物板与夹板，所述载物板与所述夹板通过两块侧板连接，所述夹板下方设有使线偏振片(3)有滑动空间的沟槽。
8.进一步地，所述线偏振片靠近所述led灯条的一侧设有把手，两个所述把手分别从所述侧板上的缝隙伸出，用于滑动所述线偏振片。
9.进一步地，本发明的器件还包括用于移动所述miid成像模块的二轴位移台，夹板与l形板通过第一调节螺丝连接，转动所述第一调节螺丝带动所述l形板沿夹板(9)水平移动；所述l形板上还设有导轨，顶板通过滑块与导轨连接并沿导轨(23)竖直移动，所述顶板底部连接所述miid成像模块。
10.进一步地，所述miid成像模块包括cis芯片和其上集成的超构透镜。
11.进一步地，所述装片的样品含有荧光染料，所述样品将所述入射光散射并被其被激发出荧光；所述线偏振膜和四分之一波片膜用于调制所述荧光和向上散射的入射光的偏振态，所述复合介质滤光膜用于滤除向上散射的入射光，并压缩所述荧光的带宽。
12.本发明所述的超构显微成像器件的暗场成像方法包括如下步骤：
13.(1)所述装片中的样品将入射光散射；
14.(2)向上散射的入射光经过线偏振模和四分之一波片膜，进行偏振调制转化为圆偏振光；
15.(3)所述圆偏振光经过复合介质滤光膜转化为窄带圆偏振光；
16.(4)所述窄带圆偏振光被miid接收进行暗场成像。
17.进一步地，所述四分之一波片膜包括左四分之一波片膜和右四分之一波片膜，分别将所述向上散射的入射光调制为左旋圆偏振态和右旋圆偏振态，所述miid接收两种偏振态的窄带圆偏振光合成完整的暗场像。
18.进一步地，步骤(1)中所述样品含有荧光染料，所述样品将入射光散射并被所述入射光激发出荧光；步骤(2)中所述向上散射的入射光和所述荧光经过线偏振模和四分之一波片膜后转化为圆偏振光，所述复合介质滤光膜将所述圆偏振光中的入射光部分截止，然后转化为窄带圆偏振荧光。
19.有益效果：本发明与现有技术相比的优点在于：(1)通过在装片上方设置线偏振膜、四分之一波片膜和复合介质滤光膜，在装片一端放置光源，令装片充当平面波导，不增加额外的光源空间，实现了在等大成像的显微成像系统中的暗场成像；(2)相较于对透射式明场照明方案，本发明由于只有样品的散射光进入成像模块，而照明光并不进入成像模块形成背景干扰，因此更小的样品细节可以更容易被观察到，提高了分辨率；(3)本发明的复合介质滤光膜使较宽带的照明光带宽变窄，从而减小超构透镜成像带来的色差；(4)当样品被荧光染色后，本发明的复合介质滤光膜还起到隔离样品所散射的照明光的作用，仅让样品被光源所激发的自发射荧光通过，实现了暗场荧光成像。
附图说明
20.图1为本发明的超构显微成像器件结构图。
21.图2为本发明的超构显微成像器件的照明模块结构图。
22.图3为本发明的超构显微成像器件的二轴位移台结构图。
23.图4为本发明的超构显微成像器件的miid成像模块结构图。
24.图5为本发明的超构显微成像器件的暗场成像方法流程图。
具体实施方式
25.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
26.如图1所示，所述，包括暗场成像的超构显微成像器件包括照明模块、二轴位移台和miid成像模块。
27.如图2所示，照明模块包括led灯条1、装片2、线偏振膜3、左四分之一波片膜4、右四分之一波片膜5、复合介质滤光膜6、海绵条7、载物板8、夹板9和两块侧板11。本实施例中的光源为led灯条1，单颗led灯珠的尺寸为3.2mm
×
2.8mm
×
0.7mm，两极施加3.5v直流电压可以发出中心波长为470nm带宽在20nm左右的自然光，将若干led以并联的形式排成一排形成led灯条1，led光源满足亮度、波长、均匀性等的要求，同时体积较小，而传统显微镜的光源体积较大，无法满足miid小型化的要求。led灯条1斜靠在柱形的海绵条7上，一并被固定在载物板8与夹板9之间预留的空间中，海绵条的弹性同时用作led灯条的缓冲和紧定，led灯条两极用引线引出用于供电。
28.装片2插入载物板8和夹板9之间，线偏振膜3位于装片2上方，线偏振膜3上粘贴四分之一波片膜和复合介质滤光膜6，四分之一波片膜包括左四分之一波片膜4和右四分之一波片膜5，其上分别粘贴复合介质滤光膜6，本实施例中左四分之一波片膜4、右四分之一波片膜5和复合介质滤光膜6均为边长1cm的薄片，装片2的盖玻片厚度为170μm，线偏振膜3的厚度为170μm，左四分之一波片膜4和右四分之一波片膜5的厚度为50μm，复合介质滤光膜6的厚度为4.73μm，成像物距为800μm；左四分之一波片膜4的快轴与线偏振膜3的取向成 45
°
，右四分之一波片膜5的快轴与线偏振膜3的取向成-45
°
；线偏振膜3靠近led灯条1的一端还设有把手17，两块侧板11上分别设有缝隙18用于容纳把手17，拨动把手17时可调整左四分之一波片膜4和右四分之一波片膜5分别与miid成像模块的超构透镜32对齐。
29.两块侧板11分别通过侧板固定螺丝12固定在载物板8上与装片2垂直的两侧，侧板紧定螺丝13穿过侧板11上的侧板螺孔14，嵌入夹板9上的凹槽15中，通过旋转侧板紧定螺丝13可以使得夹板9向下方夹紧装片2，由于夹板9朝向装片2的一侧预留沟槽16，因此夹板9夹紧装片2时，处于两者之间的线偏振片3依旧可以活动。
30.如图3所示，二轴位移台包括l形板21、导轨23、滑块25和顶板26。第一调节螺丝19穿过夹板9上方的夹板通孔20，旋入l形板21底部的l形板螺孔22中，转动第一调节螺丝19可以带动l形板21在夹板9上水平滑动，超透透镜32与样品区域10的位置发生水平相对移动，调整感兴趣的待观测区域。两根导轨23通过顶板固定螺丝27固定在滑块25上，第二调节螺丝28穿过l形板21顶部的l形板通孔29，旋入顶板26靠近导轨23一侧的顶板螺孔30中，转动第二调节螺丝28可以带动顶板26沿导轨23竖直滑动，实现miid成像模块的对焦。
31.如图4所示，miid成像模块包括cis芯片31和超构透镜32。cis芯片31同时具有可被
开发利用的其他接口，利用该接口引出排线，可以为led灯条1供电。cis芯片31尺寸大小为30mm
×
30mm，通过四角上的通孔被四颗m2的沉头螺丝33固定在四个螺丝柱34上，确保了超构透镜32与装片2的相对平行。使用沉头螺丝的原因是防止螺丝与超构透镜衬底表面的高度差大于成像的物距，从而限制对焦。顶板26上预留开口35用于cis芯片31的usb数据线接入。
32.当装片2的一端伸入到靠近led灯条1的位置时，装片2本身充当一个平板波导将led灯条发出的光向样品区域10传导，当光遇到样品时被样品散射，这部分夹带样品信息的光将改变传播方向，向上依次通过左四分之一波片膜4(或右四分之一波片膜5)与复合介质滤光膜6，而后被上方的miid成像模块接收，进行暗场成像。复合介质滤光膜6的作用是使较宽带的照明光带宽变窄，从而减小超构透镜成像带来的色差，当装片2中的样品经过荧光染料染色，样品不仅将led灯条发出的光散射，还会被激发出荧光，复合介质滤光膜6的作用除了上述减小色差之外，还起到隔离上述样品所散射的照明光的作用，而仅让样品被光源所激发的自发射荧光通过，从而实现暗场荧光成像。
33.如图5所示，本发明所述的暗场成像方法包括如下步骤：
34.(1)安装装片2，打开led灯条1，led灯条1发出的光进入装片2中，并在其上下内表面发生全反射持续向前传播，光传播至样品区域10后被样品散射而改变了原来的传播方向。
35.(2)向上方散射的光通过线偏振膜3后被调制为线偏振光，再向上通过快轴与线偏振膜3成 45
°
的左四分之一波片膜4后被调制为左旋圆偏振光；
36.(3)再向上通过复合介质滤光膜6后被调制为窄带左旋圆偏振光；
37.(4)最后被miid接收得到窄带左旋圆偏振光照明的样品暗场像；
38.(5)重复步骤(2)～(4)，将左四分之一波片膜4换为快轴与线偏振膜3成-45
°
的右四分之一波片膜5，得到窄带右旋圆偏振光照明的样品暗场像；
39.(6)将窄带左旋圆偏振光照明的样品暗场像和窄带右旋圆偏振光照明的样品暗场像进行图像处理合成完整的暗场像。
40.当装片2中为经过荧光染料染色处理后的样本，此时led灯条1发出的光，其作用是激发，称为激发光，样品被激发光激发而发射出荧光，步骤(3)中复合介质滤光膜6将激发光部分截止，只让荧光的部分通过，最后得到激发光截止的暗场荧光像。