将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法和应用与流程

1.本发明涉及分析化学技术领域，进一步地说，是涉及将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法和应用。


背景技术：

[0002] 匹伐他汀钙起始物料的化学名为：[[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]甲基]三苯基溴化膦，cas：154057-58-6，其结构式如下：c
37h30
brfnp618.53。
[0003]
[(2-环丙基-4-苯基-3-喹啉基)甲基]三苯基溴化膦为此起始物料的脱氟杂质（以杂质a代表），[[2-环丙基-4-(3-氟苯基)-3-喹啉基]甲基]三苯基溴化膦（以杂质b代表）及[[2-环丙基-4-(2-氟苯基)-3-喹啉基]甲基]三苯基溴化膦（以杂质c代表）为其氟位置异构体，三者的结构式分别如下：、、。上述三种杂质的存在会影响起始物料含量的检测，目前尚无有效分离和检测他汀类药物起始物料、其脱氟杂质及氟位置异构体的方法。
[0004]
现有技术中，常规思路液相色谱法采用的五氟苯基柱、正相色谱柱及c18色谱柱均未同时实现三个杂质与匹伐他汀钙起始物料的有效分离。
[0005]
因此，目前急需一个能同时快速、准确地分离、检测匹伐他汀类药物起始物料、其脱氟杂质及氟位置异构体的方法。


技术实现要素：

[0006]
为解决现有技术中出现的问题，本发明提出了将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法和应用。本发明通过选择合适的流动相，并控制流动相的缓冲盐比例和流速、色谱柱、柱温、检测波长等条件，特别是通过选择合适的色谱柱、控制流动相的ph值以及梯度洗脱程序，来使得匹伐他汀钙起始物料与其三种杂质，在同一个检测方法下可以进行有效地分离，并且检测灵敏度高、专属性好、准确度高。
[0007]
本发明的目的之一是提供一种将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法，包括以下步骤：采用液相色谱法对溶液中的匹伐他汀钙起始物料和杂质进行分离；所用的色谱柱为c4-t色谱柱，采用以混合酸-三乙胺缓冲液为流动相a，四氢呋喃为流动相b，甲醇为流动相c，进行梯度洗脱，检测波长为228nm~245nm，比如可以为228、230、
232、234、236、238、248、242、245以及任意两个数值之间组成的任意范围。
[0008]
所述流动相a的ph值为 2.9~3.7，比如可以为 2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7以及任意两个数值之间组成的任意范围。
[0009]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，检测波长为228nm~245nm；所述杂质包括脱氟杂质和氟位置异构体杂质；所述脱氟杂质包括杂质a，杂质a的结构式为；氟位置异构体杂质包括杂质b和杂质c；所述杂质b的结构式为；所述杂质c的结构式为；所述匹伐他汀钙起始物料的结构式为。
[0010]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，所述流动相a的混合酸-三乙胺缓冲液中，混合酸为冰乙酸和三氟乙酸的混合酸；所述流动相a的ph值为 2.9~3.0或 3.3~3.7。
[0011]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，所述冰乙酸和三氟乙酸的体积比为1:3-5；比如可以为1:3、1:4、1:5以及任意两个数值之间组成的任意范围。优选地，所述冰乙酸和三氟乙酸的体积比为1:4；或每1000ml的流动相a中包括冰乙酸0.5~0.75ml，三氟乙酸2.25~2.5ml，其余为水；比如冰乙酸可以为0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75ml以及任意两个数值之间组成的任意范围；三氟乙酸可以为2.25、2.3、2.35、2.4、2.45、2.5ml以及任意两个数值之间组成的任意范围。优选地，所述流动相a中的混合酸的酸的总体积浓度为0.3%（v/v）。
[0012]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，色谱柱的柱温为25℃~35℃，比如可以为25、30、35℃以及任意两个数值之间组成的任意范围；和/或，流速为1.1ml/min~1.3ml/min，比如可以为1.1、1.2、1.3ml/min以及任意两个数值之间组成的任意范围；和/或，
进样体积10-20μl，比如可以为10、12、14、16、18、20μl；和/或，检测波长为228nm~232nm。
[0013]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，色谱柱的柱温为30℃；流速为1.2ml/min；检测波长为230nm，进样体积20μl。
[0014]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，梯度洗脱程序为0min～30min，流动相a的体积分数为70-80％，流动相b的体积分数为0％，流动相c的体积分数为20-30％；30min～70min，流动相a的体积分数为60％，流动相b的体积分数为2-3％，流动相c的体积分数为37-38％；70min～80min，流动相a的体积分数为70-80％，流动相b的体积分数为0％，流动相c的体积分数为20-30％。
[0015]
进一步优选地，梯度洗脱程序为：0min～30min，流动相a的体积分数为80％，流动相b的体积分数为0％，流动相c的体积分数为20％ ；30min～70min，流动相a的体积分数为60％，流动相b的体积分数为2％，流动相c的体积分数为38％；70min～80min，流动相a的体积分数为80％，流动相b的体积分数为0％，流动相c的体积分数为20％。
[0016]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，匹伐他汀钙起始物料中，脱氟杂质及氟位置异构杂质的检测限均为1ng。
[0017]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，含匹伐他汀钙起始物料和杂质的溶液中，所用的溶剂为甲醇-水的混合溶剂；溶剂只要能满足各杂质及主成分充分溶解即可，优选地，本发明中选择溶剂为甲醇-水的体积比为20∶80；匹伐他汀钙起始物料溶液的浓度只要能满足检测需求即可，优选地，本发明中匹伐他汀钙起始物料溶液的浓度为0.5~1mg/ml。
[0018]
在本发明所述的将匹伐他汀钙起始物料和其杂质进行分离的方法中，优选地，发明人发现，选择普通c18色谱柱或五氟苯基柱或正相色谱柱，均未实现在一个检测方法下同时分离起始物料及其三种异构体杂质，在本发明选择的c4-t色谱柱下，控制流动相的ph值以及梯度洗脱程序，来使得起始物料与其三种杂质可以进行有效地分离，并且检测灵敏度高、专属性好、准确度高。
[0019]
所述c4-t色谱柱为chromcore 300 c4-t，规格为4.6mm
×
250mm，5μm色谱柱。不同厂家生产的色谱柱具有不同的型号，本领域技术人员可以根据色谱柱型号进行色谱柱筛选。
[0020]
在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在下文中，各个技术方案之间原则上可以相互组合而得到新的技术方案，这也应被视为在本文中具体公开。
[0021]
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：本发明提出一种具有较好分离度和检测灵敏度的匹伐他汀钙起始物料中脱氟杂质及氟位置异构体的分析方法。可以实现一个方法中同时使脱氟杂质及氟位置异构体与起始物料达到有效分离，方法灵敏度高、专属性好、准确度高、耐用性好，能准确有效地监控其质量水平。
附图说明
[0022]
图1为本发明对比例1提供的系统适用性溶液的hplc图谱；图2为本发明对比例2提供的系统适用性溶液及定位溶液的hplc叠加图谱的hplc图谱；图3为本发明实施例11提供的混合溶液的hplc图谱；图4为本发明对比例3提供的系统适用性溶液及定位溶液的hplc叠加图谱的hplc图谱；图5为本发明对比例4提供的系统适用性溶液及定位溶液的hplc叠加图谱的hplc图谱。
[0023]
图1-图5中横坐标为时间，单位为min，纵坐标为电信号，单位为mau，本领域通常仅以mau作为纵坐标即可。
具体实施方式
[0024]
下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。
[0025]
另外需要说明的是，在以下具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0026]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，由此而形成的技术方案属于本说明书原始公开内容的一部分，同时也落入本发明的保护范围。
[0027]
实施例与对比例中采用的原料，如果没有特别限定，那么均是现有技术公开的，例如可直接购买获得或者根据现有技术公开的制备方法制得。
[0028]
在本发明实施例中，未特殊说明，其配比均按照体积比进行。
[0029]
在本发明实施例中，未特殊说明，起始物料指的均是纯的[[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]甲基]三苯基溴化膦物料。
[0030]
实施例1系统适用性溶液的制备：用甲醇-水（20∶80）作为溶剂溶解起始物料（即纯的[[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]甲基]三苯基溴化膦）及杂质a、杂质b、杂质c得到混合溶液，其中，所述混合溶液中起始物料浓度为1mg/ml，杂质浓度均为1μg/ml。将所述系统适用性溶液注入液相色谱仪，其中，色谱条件为：色谱柱：chromcore 300 c4-t，4.6mm
×
250mm，5μm；
流动相a：混合酸-三乙胺缓冲液（取冰乙酸0.6ml，三氟乙酸2.4ml，加水稀释至1000ml，三乙胺调节ph 3.0）；流动相b：四氢呋喃；流动相c：甲醇；柱温：30℃；流速：1.2ml/min；检测波长：230nm；进样体积：20μl;梯度洗脱程序：实施例2与实施例1基本相同，不同之处仅在于，用三乙胺将流动相a的ph值调节为2.9。
[0031]
实施例3与实施例1基本相同，不同之处仅在于，用三乙胺将流动相a的ph值调节为3.1。
[0032]
实施例4与实施例1基本相同，不同之处仅在于流速为1.1ml/min。
[0033]
实施例5与实施例1基本相同，不同之处仅在于流速为1.3 ml/min。
[0034]
实施例6与实施例1基本相同，不同之处仅在于柱温为25℃。
[0035]
实施例7与实施例1基本相同，不同之处仅在于柱温为35℃。
[0036]
实施例8与实施例1基本相同，不同之处仅在于混合酸中冰乙酸和三氟乙酸的体积比为1∶3。
[0037]
实施例9与实施例1基本相同，不同之处仅在于混合酸中冰乙酸和三氟乙酸的体积比为1∶5。
[0038]
实施例1至实施例9条件下各杂质分离情况如表1所示：表1
从表1的结果可以看出，在实施例3下，系统适用性溶液中杂质a/杂质c与相邻异构体杂质b的分离度小于1.2。其它实施例中系统适用性溶液中主峰（即起始物料的特征峰）与杂质a/杂质c分离度均不低于1.5；杂质a/杂质c与相邻异构体杂质b的分离度均大于1.2。还可以看出当流动相a的ph值大于3.0后，杂质a/杂质c与杂质b之间的分离度变差。
[0039]
实施例10与实施例1基本相同，不同之处仅在于，用三乙胺将流动相a的ph值调节为3.3、3.7、4.0。
[0040]
实施例10条件下各杂质分离情况如表2所示：表2
从表2中看出，在ph为3.3~3.7时，三个杂质及起始物料共四个成分均有分离趋势，分离度均大于1.0，但在ph为4.0时，四个成分之间的分离度均较差。
[0041]
对比例1系统适用性溶液的制备：用甲醇-水（20∶80）作为溶剂溶解起始物料、杂质a、杂质b、杂质c及起始物料的其它杂质1得到的混合溶液，其中，所述混合溶液中起始物料浓度为1mg/ml，杂质a、杂质b、杂质c浓度均为100μg/ml，其它杂质1浓度为10μg/ml。
[0042]
各杂质定位溶液：用甲醇-水（20∶80）作为溶剂溶解各杂质a、杂质b、杂质c得到其定位溶液，其中，所述杂质浓度均为10μg/ml。
[0043]
将所述系统适用性溶液及定位溶液注入液相色谱仪，其中，色谱条件为：色谱柱：daicel chiralpak if柱 4.6*250mm，5
µ
m流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使溶解，用三氟乙酸调ph值至2.5）-乙腈（50:50）柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：244nm；进样体积：10μl；此色谱柱下最优条件时，杂质a可以与起始物料达到有效分离，分离度为4.34，而杂质b与杂质c与主成分完全重合，具体结果见图1。
[0044]
对比例2系统适用性溶液的制备：用甲醇-水（20∶80）作为溶剂溶解起始物料、杂质a、杂质b、杂质c及起始物料的其它杂质1得到的混合溶液，其中，所述混合溶液中起始物料浓度为0.5mg/ml，杂质a、杂质b、杂质c浓度均为0.5μg/ml，其它杂质1浓度为0.05μg/ml。
[0045]
各杂质定位溶液：用甲醇-水（20∶80）作为溶剂溶解各杂质a、杂质b、杂质c得到其定位溶液，其中，所述杂质浓度均为10μg/ml。
[0046]
将所述系统适用性溶液及定位溶液注入液相色谱仪，其中，色谱条件为：色谱柱：nano chromcore pfp 4.6*250mm，5
µ
m流动相a：缓冲盐溶液（取三乙胺3ml，加水稀释至1000ml，乙酸调节ph7.0；流动相b：乙腈-四氢呋喃（95∶5）流动相：流动相a-流动相b（10∶90）柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：244nm；进样体积：10μl上述色谱条件为此色谱柱下尝试的最优条件时的结果，可以看出杂质a与主峰未完全分离，杂质b与起始物料重合，上述三个杂质在此色谱柱下未完全与主峰分离，具体结果见图2。
[0047]
另外本发明在优化过程中发现，杂质a及杂质c随色谱条件改变而同时向左或向右移动，从而无法同时与起始物料达到分离效果。
[0048]
实施例11
专属性试验：各杂质定位溶液：取杂质a、杂质b、杂质c及其它杂质1、杂质2、杂质3、杂质4各约1mg，不同10ml量瓶中，加20%甲醇溶解（杂质1、杂质2、杂质3用乙腈溶解），加20%甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0049]
混合溶液：取本品（起始物料）约10mg，置10ml量瓶中，加入杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质a、杂质b、杂质c定位溶液各0.1ml，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0050]
上述定位溶液及混合溶液采用实施例1相同的色谱条件进行hplc检测，结果见图3及表3。
[0051]
表3由表3可以看出，采用本发明的hplc检测方法，起始物料中其它杂质均不干扰杂质a、杂质b及杂质c的检测，说明专属性良好。
[0052]
对比例1和对比例2是现有常规思路中色谱柱的对起始物料和杂质a、杂质b及杂质c的分离情况，可以看出，对比例1和对比例2中杂质a、杂质b及杂质c很难同时达到完全与主峰分离，分离效果差，而本发明的实施例11的杂质a、杂质b及杂质c可以实现同时与主峰分离，分离效果好，且实施例11为本发明方法的专属性验证，还加入了起始物料的其它杂质，该分离结果充分说明本发明的方法的专属性良好。
[0053]
实施例12检测限与定量限：取实施例11中杂质a、杂质b及杂质c各定位溶液用20%甲醇逐级稀释，当各成分峰高约为基线噪音值10倍时的溶液为定量限溶液，当各成分峰高约为基线噪音值3倍时的溶液为检测限溶液。hplc的色谱条件与实施例1相同，结果见表4。
[0054]
表4
从表4可以看出，本发明的hplc检测方法对各杂质及起始物料的检测灵敏度高，各杂质均能满足检测要求。
[0055]
实施例13线性试验：分别取杂质a、杂质b及杂质c适量，稀释制成含定量限、20%、40%、80%、100%、120%、200%的限度水平浓度（限度水平浓度为1μg/ml），作为线性溶液。取各水平线性溶液采用实施例1的色谱条件进样分析，以主成分和各杂质浓度为横坐标，对应溶液峰面积为纵坐标，计算各自线性回归方程及相关系数r，各杂质的相关系数均大于0.999，y轴截距在100%响应的10%以内，表明各杂质及起始物料在定量限~200%限度水平，线性关系良好。
[0056]
实施例14准确度试验：未加标供试品溶液：取本品（起始物料）约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加20%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0057]
准确度储备液：精密量取实施例11中杂质a、杂质b、杂质c定位溶液各1ml，置10ml量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0058]
混合对照溶液：精密量取准确度储备液1ml，置10ml量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0059]
20%水平加标供试品溶液：取起始物料约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加20%甲醇使溶解，加准确度储备液0.2ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份，分别记为20%-1、20%-2、20%-3。
[0060]
80%水平加标供试品溶液：取起始物料约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂使溶解，加准确度储备液0.8ml，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀。平行配制3份，分别记为80%-1、80%-2、80%-3。
[0061]
100%水平加标供试品溶液：取起始物料约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂使溶解，加准确度储备液1ml，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀。平行配制3份，分别记为100%-1、100%-2、100%-3。
[0062]
120%水平加标供试品溶液：取起始物料约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂使溶解，加准确度储备液1.2ml，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀。平行配制3份，分别记为120%-1、120%-2、120%-3。
[0063]
取未加标供试品溶液、混合对照溶液及各水平加标供试品溶液采用实施例1的色谱条件进样分析，结合上述溶液，计算各杂质回收率，其中各杂质回收率=（测得量-本底量）/加入量*100%。结果见表5。
[0064]
表5从表5可以看出，本发明的hplc检测方法，各杂质在限度水平的20%~120%之间的回收率均在90%~108%，rsd值均小于5%，均能准确测定，表明准确度良好。
[0065]
对比例3色谱柱与实施例1相同，系统适用性溶液及各杂质定位溶液同对比例2。其它色谱条件具体如下：流动相a：冰乙酸-三乙胺缓冲液（取三乙胺3ml，加水稀释至1000ml，冰乙酸调节ph 3.5）；流动相b：四氢呋喃；流动相c：甲醇；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm；进样体积：10μl；梯度洗脱程序：
具体结果见图4对比例4色谱柱与实施例1相同，系统适用性溶液及各杂质定位溶液同对比例2。其它色谱条件具体如下：流动相a：三氟乙酸-三乙胺缓冲液（取三乙胺3ml，加水稀释至1000ml，三氟乙酸调节ph 2.5）；流动相b：四氢呋喃；流动相c：甲醇；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；进样体积：20μl；梯度洗脱程序：具体结果见图5。
[0066]
从图4、图5中可以看出，在单独使用冰乙酸或单独使用三氟乙酸的两个色谱条件下，杂质a与杂质c的出峰顺序相反，且起始物料与相邻杂质均无法达到有效分离。结合ph的综合作用，表明杂质a与杂质c在这两个流动相体系下，色谱行为发生了较大变化。综上看出在本发明的冰乙酸和三氟乙酸的缓酸体系并结合特定的ph作用下，才能使起始物料及其杂质a、杂质b、杂质c得到较好的分离。
[0067]
综上，本发明提供的匹伐他汀钙起始物料中脱氟杂质及其氟位置异构体杂质的检
测方法，系统适用性溶液中起始物料与相邻杂质分离度均大于1.5，杂质间分离度均大于1.2，在一个方法下即可同时检测，检测专属性强、灵敏度好、准确度高、耐用性好，方法对仪器要求低，检测成本低。
[0068]
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。