一种用于核酸提纯的装置及其方法与流程

1.本发明涉及核酸提纯技术领域，尤其涉及一种用于核酸提纯的装置及其方法。


背景技术：

2.核酸可分为核糖核酸(rna)和脱氧核糖核酸(dna)，是基本的遗传物质；同时核酸在蛋白质的生物合成上也占有重要位置，对生物的生长、遗传、变异等一系列重大生命现象起决定性作用。由于核酸对生物科学的研究和发展具有重要作用，因此如何从样品中将核酸提取出来并整合成易于使用和检测的形式是研究核酸的前提和基础。
3.核酸的提取目前有主要三种方法：
4.(1)酚抽提法，是指用苯酚抽提细胞时将蛋白质变性使蛋白溶于酚相，核酸溶于水相，并通过氯仿的反复抽提去掉水相中残留的苯酚，再利用乙醇消除核酸的水化层使核酸沉淀的方式对核酸进行纯化，其操作繁琐且有机溶剂对人体有害。
5.(2)纳米磁珠法，是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微球为载体，通过磁珠在高盐、低ph溶液中吸附核酸，而在低盐溶液中将核酸从磁珠表面脱离的原理进行核酸提取的方法，其可实现核酸的快速分离纯化，安全且易于自动化实施；但其核酸提取过程中需要经过加液、震荡、吸磁、吸液、干燥、洗脱等等过程，不但条件多样复杂，每个过程对硬件设备的要求很高；
6.(3)传统膜吸附法，是指通过吸附膜直接吸附溶液中的核酸，再用小体积的水或低离子强度的缓冲液将核酸洗脱出来，其操作相对简单，回收效率高，但其提纯过程中需要反复加样、离心。


技术实现要素：

7.本发明为了解决上述技术问题提供了一种用于核酸提纯的装置，采用磁珠和吸附膜混用，实现核酸的快速提纯。
8.本发明还提供了一种核酸提纯的方法，采用本技术文件装置进行核酸提纯，其提纯过程简单、易于操作。
9.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于核酸提纯的装置，包括过滤柱和填充在过滤柱里面的核酸过滤芯；所述过滤芯包括纳米磁珠和吸附膜。
10.在上述技术方案中，过滤柱上设置有一段内径较大的膨大区域，膨大区域两端连接的部分过滤柱的内径均较小，磁珠和吸附膜形成的过滤芯就被填充在该膨大区域内，使核酸在该区域内通过磁珠和吸附膜被充分吸附，再通过洗脱液洗脱后，实现提纯。
11.进一步地，所述过滤芯包括至少1层纳米磁珠层和至少2层吸附膜层；所述纳米磁珠层由纳米磁珠组成；所述吸附膜层由吸附膜组成，所述纳米磁珠层和所述吸附膜层交替设置。
12.进一步地，所述过滤芯上下两端面均为吸附膜层；所述吸附膜层为硅胶膜和/玻璃纤维膜，通过吸附膜层将纳米磁珠层固定在过滤芯中，避免纳米磁珠的漏出，无需另外设置
保护膜层。
13.进一步地，所述过滤芯包括依次设置的第一保护膜层、过滤层和第二保护膜层；过滤层采用吸附膜颗粒和纳米磁珠混合而成。其中吸附膜颗粒可以为硅胶膜颗粒和/或玻璃纤维膜颗粒；当所述吸附膜颗粒为硅胶膜颗粒和玻璃纤维膜颗粒时，硅胶膜颗粒与玻璃纤维膜颗粒的质量比为：1:0.1～10。
14.进一步地，所述过滤芯包括若干竖直设置在过滤柱中的过滤层；所述过滤层包括吸附膜和附着在吸附膜上的纳米磁珠。
15.进一步地，所述纳米磁珠为亲水性磁性微球、疏水性磁性微球、羧基磁性微球、氨基磁性微球、环氧基磁性微球中的一种或两种，纳米磁珠的粒径为50nm～2μm，当两种纳米磁珠混用时，两种纳米磁珠的质量比为1:0.1～10。此处所述的亲水性磁性微球、疏水性磁性微球、羧基磁性微球、氨基磁性微球、环氧基磁性微球是指纳米磁珠表面的功能基团分别为亲水性基团、疏水性基团、羧基、氨基、环氧基。
16.进一步地，本技术文件的装置还包括设置在所述过滤柱中的防污染滤芯；所述防污染滤芯设置在所述过滤柱远离所述过滤柱进液口的一端。所述防污染滤芯为聚乙烯滤芯。
17.本技术文件还公开了一种核酸提纯方法，包括采用本技术文件公开的核酸提纯装置提纯核酸。
18.其具体包括以下步骤：
19.s1)在样本中加入裂解液，加热至55～65℃；
20.s2)采用本技术文件公开的核酸提纯装置吸取步骤s1)中加热的裂解液，再排掉；
21.s3)步骤s2)中的核酸提纯装置吸取洗涤液1，然后排掉洗涤液1；
22.s4)步骤s3)中的核酸提纯装置吸取洗涤液2，然后排掉洗涤液2；
23.s5)重复至少一次步骤s4)；
24.s6)步骤s5)中的核酸提纯装置再吸取55～60℃的洗脱液，再排出并收集洗脱液即可。
25.进一步地，所述裂解液的组分包括：0.5m-5m盐酸胍，0.2m-4m氯化钠，10mm-100mm氯化钙，0.2％-3.6％l-脯氨酸，0.1％-2.4％山梨醇，0.1％-2.0％硫酸铵，10mm-1mtris，0.1％-1％聚乙烯比咯烷酮，0.1％-3％sds，0.2m-4mpeg8000，0.1％-5％pluronicl64)，0.1％-5％surfactant10g，5％-25％异丙醇，0.1％-1％proclin300，裂解液的ph值为4.0-10.0；
26.所述洗涤液1的组分包括：0.2m-4m氯化钠，10mm-1mtris，1mm-50mm乙二胺四乙酸，0.1％-2％吐温-20，20％-80％乙醇，洗涤液1的ph值为4.0-7.0；
27.所述洗涤液2的组分包括：0.2m-4m氯化钠，10mm-1mtris，0.1％-2％吐温-20，洗涤液2的ph值为4.0-7.0；
28.所述洗脱液的组成包括：10mm-1mtris，洗脱液的ph值为7.0-10.0。
29.进一步地，在核酸提纯过程中，所述裂解液与洗涤液1、洗涤液2的比例为1:1:1；所述洗脱液与裂解液的比例为1:6～1:2。
30.本发明的有益效果：(1)本发明公开的一种用于核酸提纯的装置，采用纳米磁珠和吸附膜同时吸附核酸、同时洗脱，大大提升了核酸的提纯效率和效果。
31.(2)本发明还公开一种核酸提纯方法，采用本技术文件公开的核酸提取装置提取核酸，其操作简单、方便，提取效果好。
附图说明
32.图1为本发明一些实施例中一种用于核酸的提纯装置的结构示意图；
33.图2为本发明一些实施例中一种用于核酸的提纯装置的结构示意图；
34.图3为本发明一些实施例中一种用于核酸的提纯装置的结构示意图；
35.图4为本发明的提纯方法与传统的纳米磁珠提纯法、tip法提纯核酸的浓度数据对比图；
36.附图中，各标号所代表的部件列表如下：
37.100-过滤柱，1-过滤芯，11-纳米磁珠层，12-吸附膜层，13-第一保护膜层，14-第二保护膜层，2-防污染滤芯。
具体实施方式
38.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
39.实施例1
40.本实施例提供的一种用于核酸提纯的装置，包括过滤柱和填充在过滤柱里面的核酸过滤芯；所述过滤芯包括纳米磁珠和吸附膜。
41.优选地，过滤柱上设置有一段内径较大的膨大区域，膨大区域两端连接的部分过滤柱的内径均较小，磁珠和吸附膜形成的过滤芯就被填充在该膨大区域内，使核酸在该区域内通过磁珠和吸附膜被充分吸附，再通过洗脱液洗脱后，实现提纯。
42.将磁珠和吸附膜填充在膨大区域中，可以使吸取的样本、裂解液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液在进入膨大区域后，其流速变缓，可以与其中填充的磁珠和吸附膜充分接触，便于核酸吸附、洗涤和洗脱效果良好，提纯效果更佳；同时磁珠和吸附膜填充在膨大区域内，可以缩短过滤柱的高度，避免了由于过滤柱的长度限制而导致吸附、洗脱效果不佳，影响装置的整体大小。此外，由于过滤柱设置膨大区域内，也更便于磁珠和吸附膜填充。
43.实施例2
44.为了更好的实施上述实施例，参阅图1，本实施例中采用的过滤芯包括至少1层纳米磁珠层和至少2层吸附膜层；所述纳米磁珠层由纳米磁珠组成；所述吸附膜层由吸附膜组成，所述纳米磁珠层和所述吸附膜层交替设置。
45.优选地，所述纳米磁珠层至少包括10层，所述吸附膜层至少包括11层。
46.优选地，所述过滤芯上下两端面均为吸附膜层；所述吸附膜层为硅胶膜和/玻璃纤维膜，通过吸附膜层将纳米磁珠层固定在过滤芯中，避免纳米磁珠的漏出，无需另外设置保护膜层。
47.所述过滤芯可采用以下方法设置：将纳米磁珠的悬浊液涂覆到吸附膜上，干燥后加工成与过滤柱的膨大区域内径相同的圆片状；然后水平铺设在过滤柱的膨大区域中，依次放置涂覆有纳米磁珠的吸附膜，即可实现吸附膜层和纳米磁珠层的交替设置。
48.本实施例中其他部分与1实施例基本相同，故不再一一赘述。
49.实施例3
50.为了更好的实施上述实施例，参阅图2，本实施例中采用的过滤芯包括依次设置的第一保护膜层、过滤层和第二保护膜层；过滤层采用吸附膜颗粒和纳米磁珠混合而成。其中吸附膜颗粒可以为硅胶膜颗粒和/或玻璃纤维膜颗粒；当所述吸附膜颗粒为硅胶膜颗粒和玻璃纤维膜颗粒时，硅胶膜颗粒与玻璃纤维膜颗粒的质量比为：1:0.1～10。所述第一保护膜层和第二保护膜层起到支撑和限制吸附膜颗粒和纳米磁珠的作用，防止吸附膜颗粒和纳米磁珠漏出。
51.本实施例中的过滤芯可采用以下方法设置：将吸附膜粉碎成颗粒，并与纳米磁珠悬浊液混合后搅拌混合均匀，然后干燥后，得到过滤芯填充料；将第一保护膜层铺设在过滤柱膨大区域的下端面；然后填充过滤芯填充料；再将第二保护膜层铺设在过滤柱膨大区域的上端面，即可实现过滤芯的设置。
52.本实施例中其他部分与实施例1基本相同，故不再一一赘述。
53.实施例4
54.为了更好的实施上述实施例，参阅图3，本实施例中采用的过滤芯包括若干竖直设置在过滤柱中的过滤层；所述过滤层包括吸附膜和附着在吸附膜上的纳米磁珠。所述过滤层成片状或者卷成圆柱状后竖直填充在过滤柱中。
55.本实施例中的过滤芯可采用以下方法设置：将纳米磁珠的悬浊液涂覆在吸附膜上，一并干燥后，再对折成片状或者卷成圆柱状；再将对折成片状或者卷成圆柱状的过滤层竖直放入过滤柱中的膨大区域，并保持相邻的过滤层之间相互压紧。
56.本实施例中其他部分与实施例1基本相同，故不再一一赘述。
57.实施例5
58.为了更好的实施上述实施例，本实施例中采用的装置还包括设置在所述过滤柱中的防污染滤芯；所述防污染滤芯设置在所述过滤柱远离所述过滤柱进液口的一端，防止液体和气溶胶的污染。
59.本实施例中其他部分与上述实施例基本相同，故不再一一赘述。
60.实施例6
61.本技术文件还公开了一种核酸提纯方法，采用本技术文件公开的核酸提纯装置提纯核酸，其具体包括以下步骤：
62.s1)在样本中加入裂解液，加热至55～65℃；
63.s2)采用本技术文件公开的核酸提纯装置吸取步骤s1)中加热的裂解液，再排掉；
64.s3)步骤s2)中的核酸提纯装置吸取洗涤液1，然后排掉洗涤液1；
65.s4)步骤s3)中的核酸提纯装置吸取洗涤液2，然后排掉洗涤液2；
66.s5)重复至少一次步骤s4)；
67.s6)步骤s5)中的核酸提纯装置再吸取55～60℃的洗脱液，再排出并收集洗脱液即可。
68.所述裂解液的组分包括：0.5m-5m盐酸胍，0.2m-4m氯化钠，10mm-100mm氯化钙，0.2％-3.6％l-脯氨酸，0.1％-2.4％山梨醇，0.1％-2.0％硫酸铵，10mm-1mtris，0.1％-1％聚乙烯比咯烷酮，0.1％-3％sds，0.2m-4mpeg8000，0.1％-5％pluronicl64)，0.1％-5％surfactant10g，5％-25％异丙醇，0.1％-1％proclin300，裂解液的ph值为4.0-10.0；
69.所述洗涤液1的组分包括：0.2m-4m氯化钠，10mm-1mtris，1mm-50mm乙二胺四乙酸，0.1％-2％吐温-20，20％-80％乙醇，洗涤液1的ph值为4.0-7.0；
70.所述洗涤液2的组分包括：0.2m-4m氯化钠，10mm-1mtris，0.1％-2％吐温-20，洗涤液2的ph值为4.0-7.0；
71.所述洗脱液的组成包括：10mm-1mtris，洗脱液的ph值为7.0-10.0。
72.在核酸提纯过程中，所述裂解液与洗涤液1、洗涤液2的比例为1:1:1；所述洗脱液与裂解液的比例为1:6～1:2。
73.以所述裂解液为0.6～10ml为例，其具体提纯步骤如下：
74.s1)样本中加入0.8-10ml裂解液，55-65℃加热裂解10分钟；
75.s2)用本技术文件公开的提纯装置吸取上述样本裂解液0.6ml-10ml，然后再排掉裂解液；
76.s3)提纯装置吸取0.6ml-10ml洗涤液1，然后再排掉洗涤液1；
77.s4)提纯装置再吸取0.6ml-10ml洗涤液2，然后再排掉洗涤液2；
78.s5)重复一次步骤s4)；
79.s6)提纯装置再吸取55-60℃预热的0.1ml-0.5ml洗脱液，最后收集排出并收集洗脱液。
80.应用例和对比例
81.采用口腔拭子采集口腔样本，其样本来源为普通人群的随机样本，共138个，并随机通过本技术公开的装置和方法提纯其中46个样本中的核酸，并以传统的纳米磁珠法和吸附膜法中的tip法分别提出其他92个样本中的核酸，作为对比例，其提纯结果如表1、表2、表3所示。其中，表1为使用本技术文件公开的提纯装置和方法提取的样本的数据；表2为传统磁珠法提纯提取样本的数据；表3为传统tip法提纯提取样本的数据，并将上述表格数据求取平均值后做平均值的比较，参阅图4，本技术文件公开的核酸提纯方法提取的核酸浓度最高，其平均可达到48ng/μl；而其纯度方面也明显优于传统的磁珠法和tip法提纯的核酸。
82.其中：a260指核酸在吸收波长为260nm的最高吸收峰下的光吸收值，数值越大说明溶液中的核酸含量越高；a230指碳水化合物在吸收波长为230nm最高吸收峰下的光吸收值，与a260的比值可进行核酸样品纯度评估，较纯净的核酸a260/a230的比值一般在1.8-2.2之间；a280是指蛋白质在280nm紫外光吸收高峰下的光吸收值，其与260nm处的吸光度比值，经常被用于判断核酸样品的纯度。纯度好的核酸样品a260/a280比值应大于1.8(dna)或者2.0(rna)；浓度为对应样本的核酸浓度；类型为检测的样本类型。
[0083][0084]
[0085]
表1
[0086]
[0087][0088]
表2
[0089]
[0090][0091]
表3
[0092]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。