一种HBP/PSP免疫层析试剂盒及其制备方法与流程

一种hbp/psp免疫层析试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明属于免疫学技术领域，更具体地说，涉及一种hbp/psp免疫层析试剂盒；尤其涉及一种hbp/psp免疫层析试剂盒的制备方法。


背景技术：

2.败血症(sepsis)是人体免疫系统对感染发出过度炎症反应，感染可由细菌、病毒，或真菌等引发，但细菌感染最常见。败血症的进展迅速，是引发住院病人死亡重要原因。
3.败血症引发过度免疫反应活化中性粒细胞并释放肝素结合蛋白(heparin binding protein，hbp)到血液中，导致血凝集形成和血管泄漏，进一步阻碍血液流动，并导致器官损伤。检测血液中hbp水平可用于诊断败血症发生及判定败血症的严重程度。
4.hbp又称为阳离子抗菌蛋白(cap37)，是由活化中性粒细胞的分泌泡释放出37kd糖蛋白。当细菌感染发生时，释放出细菌表面m-蛋白，结合纤维蛋白原，形成复合物，进一步与中性粒细胞表面i2-整合素结合，促进中性粒细胞分泌泡释放出hbp。在细菌感染部位，在吞噬细菌过程中，中性粒细胞嗜天青颗粒中分泌出hbp，在感染部位，hbp表现出抗菌活性，并负责招募和激活单核细胞，hbp被单核细胞内吞后，可以避免单核细胞凋亡发生促进单核细胞生存并产生更多的细胞因子。因此，hbp能直接导致炎症发生并促进炎症进展，hbp是诊断败血症发生的直接炎症指标。
5.hbp通过与血管内皮细胞表面粘多糖相互作用，激活蛋白激酶c和rho-激酶通路，增加内皮渗透性，肺部血管通透性的增加会导致肺泡中的液体积聚，诱发呼吸衰竭。脱落或破坏内皮细胞表面粘多糖暴露出粘附分子，增强吸附和跨壁迁移激活淋巴细胞。结构性内皮细胞损坏引发凝血状态，进一步扰乱血管内皮舒缩功能，随后发生间位和组织水肿，形成败血症病理生理学关键特征，导致器官衰竭发生。有研究检测败血症病人血清中hbp，pct，crp指标用于判定器官衰竭发生，其roc曲线值分别为0.8，0.70，0.70，可见，hbp是评估败血症严重程度最优异的指标之一。
6.全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，sirs)是机体内促炎-抗炎反应失衡所致的，伴有免疫防御功能下降、持续不受控制的炎症反应。sirs可由感染、烧伤、创伤、手术、胰腺炎以及缺血等多种因素引发，但败血症和非感染性sirs中的病理生理过程非常相似，感染性败血症和非感染性sirs患者血清中呈现高水平hbp，当设定血液中hbp临界值为50ng/ml时，诊断非感染性sirs的敏感性78％，而特异性较低，为36％，因此，需要开发区别败血症和非感染性sirs的新指标。
7.目前研究发现，细菌感染时，激发胰腺的腺泡细胞合成和分泌胰石蛋白(pancreatic stone protein，psp)到血液中，psp由再生基因(regenerating gene)编码16kd蛋白，能促进细胞增殖、抗细胞凋亡、调节细胞黏附、促细菌聚集等作用，psp还能作为一种抗菌蛋白，控制肠道菌群的扩散和防止病原菌感染肠道。
8.psp是一种急性期反应炎性因子，受到il-6、tnf-α等炎症因子的调节，可诱导中性粒细胞中l-选择素的脱落和下调β2整合素表达，激活中性粒细胞，因此，psp是一种感染和
炎症发生的标记物。
9.研究表明，急性或慢性胰腺炎发生时，psp表达增加；而全身性细菌感染发生时，在缺乏任何胰腺炎症情况下，也促进胰腺表达和分泌高水平psp，说明psp也是全身性细菌感染反应的标记。
10.研究进一步发现，在局部感染、败血症、脓毒血症、器官衰竭及休克病人血清中psp水平依次增高，正常人血清中psp浓度低于20ng/ml；细菌感染存在时，血清中psp浓度高于45ng/ml；进一步发展到败血症、脓毒血症、脓毒性休克或器官衰竭发生，血清中psp水平超过270ng/ml，而且死亡风险明显增高，由此可见，血清中psp水平是判定细菌性败血症严重程度的准确指标。
11.研究发现，感染性败血症患者血清中psp水平迅速升高，非感染性sirs患者血清中psp水平很低，血清中psp临界值为30ng/ml时，诊断非感染性sirs的敏感性为90％，特异性为83％，检测血清中psp指标明显提高鉴别败血症和非感染性sirs能力。
12.败血症发生时激发淋巴系统和器官组织炎症反应，中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，是最早因感染而激活的白细胞之一，表明中性粒细胞的活化极大地影响最初的免疫反应。血液中hbp水平升高，反映中性粒细胞活化状态，代表感染性败血症的发生；而血循环中psp水平升高，特异性反应组织器官组织炎症状态，同时检测血液中hbp和psp水平，能同时表明淋巴细胞和器官组织的炎症状况，用于早期诊断败血症发生，判定败血症的严重程度，或鉴别败血症和非感染性sirs发生，需要开发同时检测血液中hbp和psp水平的试剂盒。


技术实现要素：

13.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种hbp/psp免疫层析试剂盒及其制备方法，建立hbp/psp免疫层析试剂盒，操作简单，快速，特异性高，定量测定出血液中hbp和psp浓度，能满足临床检验要求。
14.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
15.一种hbp/psp免疫层析试剂盒，包括免疫层析检测卡，样品液和hbp/psp质控品，所述hbp/psp质控品包括冻干10-20ng/ml hbp蛋白和20-40ng/ml psp蛋白和0.5-1.0ml蛋白稀释液。
16.其中，所述免疫层析检测卡包括免疫层析试纸条和外壳，所述免疫层析试纸条包括pvc底板以及pvc底板上顺序连接固定fusion5、硝酸纤维素膜和吸水纸，fusion5用于吸附pct抗体-微球，ip-10抗体-微球和igg-微球；硝酸纤维素膜固定pct抗体形成检测线(t1线)，固定ip-10抗体形成检测线(t2线)和固定抗igg抗体形成质控线(c线)。
17.其中，所述的微球为金标微球、彩色微球、荧光微球、磁性微球或上转换发光微球中的一种或者多种；所述微球表面修饰官能团为氨基、羧基或羟基中的一种，所述微球直径范围是100-300nm。
18.本发明还提供一种hbp/psp免疫层析试剂盒的制备方法，包括包括如下步骤：
19.s1、制备hbp抗体-荧光微球，选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒，微球直径为100nm-300nm；本发明实施例中，把hbp单克隆抗体，偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm；
20.s2、制备psp抗体-荧光微球；
21.s3、制备igg-荧光微球；
22.s4、喷涂fusion5和硝酸纤维素膜；
23.s5、组装免疫层析检测卡；
24.s6、制备样品液和hbp/psp质控品。
25.其中，把hbp单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：
26.a、10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
27.b、再加1.2ml 20mmmes缓冲液，ph6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
28.c、加0.2ml上述mes缓冲液含5mm edc和20mm sulfo-nhs到离心管中，混均，室温，反应30分钟；
29.d、再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
30.e、加0.2ml ph7.0 pbs含40ug hbp单克隆抗体到上述离心管中，室温，反应2小时；
31.f、加40ul 100mm tris，ph7.4到离心管中，室温，反应60分钟；
32.g、加1.2ml nahpo4缓冲液，20mm nahpo4，ph7.0，0.2％bsa，0.01％tween-20到离心管中；
33.h、离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
34.i、用上述nahpo4缓冲液悬浮hbp抗体-荧光微球，2-8℃，储存备用。
35.其中，把psp单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：
36.a.取10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
37.b.再加1.2ml 20mmmes缓冲液，ph6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
38.c.加0.2ml上述mes缓冲液含5mm edc和10mm sulfo-nhs到离心管中，混均，室温，反应30分钟；
39.d.再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
40.e.加0.2ml ph7.0 pbs含40ug psp单克隆抗体到上述离心管中，室温，反应2小时；
41.f.加40ul 100mm tris，ph7.4到离心管中，室温，反应60分钟；
42.g.加1.2ml nahpo4缓冲液，20mm nahpo4，ph7.0，0.2％bsa，0.01％tween-20到离心管中；
43.h.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
44.i.用上述nahpo4缓冲液悬浮psp抗体-荧光微球，2-8℃，储存备用。
45.其中，把兔igg偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：
46.a.10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
47.b.再加1.2ml 20mmmes缓冲液，ph6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
48.c.加0.2ml上述mes缓冲液含10mm edc和20mm sulfo-nhs到离心管中，混均，室温，反应30分钟；
49.d.再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
50.e.加0.2ml ph8.0 pbs含35ug兔igg到上述离心管中，室温，反应2小时；
51.f.加40ul 100mm tris，ph7.4到离心管中，室温，反应60分钟；
52.g.加1.2ml nahpo4缓冲液，20mm nahpo4，ph7.5，0.2％bsa，0.01％tween-20到离心管中；
53.h.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
54.i.用上述nahpo4缓冲液悬浮兔igg-荧光微球，2-8℃，储存备用。
55.其中，步骤s4中的喷涂fusion5和硝酸纤维素膜，包括如下步骤：
56.a.用nahpo4缓冲液，10mm nahpo4，ph 7.0，20mm nacl，1.0％bsa，10％trehalose，0.2％pvp，0.5％np-40，稀释hbp抗体-荧光微球浓到0.05mg/ml，psp抗体-荧光微球浓度到0.08mg/ml，兔igg-荧光微球浓度到0.005mg/ml，制备抗体-荧光微球混合液，混均后，3000rpm，离心5分钟，取上清液再混均，用xyz三维划膜喷金仪，微定量喷涂方式，5ul/cm速度，将上述抗体-荧光微球混合液喷涂到fusion5上，30℃，烘干8小时，干燥封存，备用；
57.b.用nahpo4缓冲液，10mm nahpo4，ph7.0，1.5％trehalose，0.1％pvp，hbp抗体购于mybiosource，稀释到1.5mg/ml，psp抗体购于r&d systems，稀释到1.5mg/ml，羊抗兔igg抗体购于arbor assays,稀释到0.5mg/ml，将硝酸纤维素膜放在xyz三维划膜喷金仪上，用微定量划线方式，0.5ul/cm速度，将上述3个抗体液喷涂到硝酸纤维素膜上形成t1线，t2线和c线，两线间距5mm，30℃，烘干8小时，干燥封存备用；
58.其中，所述免疫层析检测卡由免疫层析试纸条和外壳构成，在湿度小于30％，25-37℃房间进行组装；在pvc底板长度方向顺次粘覆于底板上的25mm fusion5、25mm硝酸纤维素膜和32mm吸水纸；其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔hbp抗体涂层形成t1线、psp抗体涂层形成t2线和由羊抗兔igg抗体涂层形成c线；fusion5喷涂有hbp抗体-荧光微球，psp抗体-荧光微球和兔igg-荧光微球。
59.其中，所述t1线与t2线平行设置，t1线与t2线之间的距离为5mm，t2线与c线平行设置，t2线与c线之间的距离为5mm。吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近c线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。fusion5位于硝酸纤维素膜靠近t1线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；fusion5重叠在硝酸纤维素膜上方，将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm免疫层析试纸条。
60.其中，所述步骤s6具体操作流程如下：
61.a.样品液：20mm tris，ph7.5，150mm nacl，0.5％bsa，0.5％tween-20，0.05％proclin300；
62.b.制备hbp/psp质控品；
63.用pbs，ph7.0，1％trehaloes制备2000ng/ml hbp重组蛋白和4000ng/ml psp蛋白混合液，取10ul蛋白混合液倒入冻干瓶中，放入冷冻干燥机，离心，冷冻干燥，取出冻干瓶，密封后，2-8℃保存；
64.c、制备蛋白稀释液：20mm nahpo4，ph7.0，1.0mm edta，1.0mm dtt，150mm nacl,10％bsa，2.0％trehalose，0.5％pvp，0.02％np-40，0.05％proclin 300。使用前，将密封冻干瓶打开，加入1.0ml蛋白稀释液，充分溶解蛋白，制备成20ng/ml hbp蛋白和40ng/mlpsp蛋白质控品，2-8℃保存。
65.本发明的技术效果和优点：
66.本发明提供的一种hbp/psp免疫层析试剂盒，通过免疫荧光分析仪对t1线、t2线和c线荧光信号进行扫描，获得t1线，t2线和c线的相对荧光强度单位(relative fluorescence units，rfu)，进一步获得t1/c rfu比值，与样品中hbp浓度成正相关，获得样品中hbp浓度；获得t2/c rfu比值，与样品中psp浓度成正相关，获得样品中psp浓度，本发明建立hbp/psp免疫层析试剂盒，操作简单，快速，特异性高，定量测定出血液中hbp和psp浓度，能满足临床检验要求。
附图说明
67.图1为本发明的试剂盒制备工艺流程图。
具体实施方式
68.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
69.在本发明的描述中，需要理解的是，指示方位或位置关系的术语为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
70.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据说明书具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
71.本发明提供了一种hbp/psp免疫层析试剂盒，包括免疫层析检测卡，样品液和hbp/psp质控品，所述hbp/psp质控品包括冻干10-20ng/ml hbp蛋白和20-40ng/ml psp蛋白和0.5-1.0ml蛋白稀释液。
72.其中，所述免疫层析检测卡包括免疫层析试纸条和外壳，所述免疫层析试纸条包括pvc底板以及pvc底板上顺序连接固fusion5、硝酸纤维素膜和吸水纸，fusion5用于吸附hbp抗体-微球，psp抗体-微球和igg-微球；硝酸纤维素膜设有固定hbp抗体形成检测线1(t1线)，固定psp抗体形成检测线2(t2线)和固定抗igg抗体形成质控线(c线)。
73.其中，所述的微球为金标微球、彩色微球、荧光微球、磁性微球或上转换发光微球中的一种或者多种；所述微球表面修饰官能团为氨基、羧基或羟基中的一种，所述微球直径范围100-300nm。
74.本发明还提供了一种hbp/psp免疫层析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
75.s1、制备hbp抗体-荧光微球：选用铕螯合物(europium chelate)荧光标记羧基修饰微粒，微球直径为100nm-300nm；本发明实施例中，把hbp单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：
76.a、10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
77.b、再加1.2ml 20mmmes缓冲液，ph6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
78.c、加0.2ml上述mes缓冲液含5mm edc和20mm sulfo-nhs到离心管中，混均，室温，反应30分钟；
79.d、再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
80.e、加0.2ml ph7.0 pbs含40ug hbp单克隆抗体到上述离心管中，室温，反应2小时；
81.f、加40ul 100mm tris，ph7.4到离心管中，室温，反应60分钟；
82.g、加1.2ml nahpo4缓冲液，20mm nahpo4，ph7.0，0.2％bsa，0.01％tween-20到离心管中；
83.h、离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
84.i、用上述nahpo4缓冲液悬浮hbp抗体-荧光微球，2-8℃，储存备用。
85.s2、制备psp抗体-荧光微球：
86.本发明实施例中，把psp单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：
87.a.取10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
88.b.再加1.2ml 20mmmes缓冲液，ph6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
89.c.加0.2ml上述mes缓冲液含5mm edc和10mm sulfo-nhs到离心管中，混均，室温，反应30分钟；
90.d.再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
91.e.加0.2ml ph7.0 pbs含40ug psp单克隆抗体到上述离心管中，室温，反应2小时；
92.f.加40ul 100mm tris，ph7.4到离心管中，室温，反应60分钟；
93.g.加1.2ml nahpo4缓冲液，20mm nahpo4，ph7.0，0.2％bsa，0.01％tween-20到离心管中；
94.h.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
95.i.用上述nahpo4缓冲液悬浮psp抗体-荧光微球，2-8℃，储存备用。
96.s3、制备igg-荧光微球，本发明实施例中，把兔igg偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：
97.a.10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，
15000rpm，15分钟，去除上清液；
98.b.再加1.2ml 20mmmes缓冲液，ph6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
99.c.加0.2ml上述mes缓冲液含10mm edc和20mm sulfo-nhs到离心管中，混均，室温，反应30分钟；
100.d.再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
101.e.加0.2ml ph8.0 pbs含35ug兔igg到上述离心管中，室温，反应2小时；
102.f.加40ul 100mm tris，ph7.4到离心管中，室温，反应60分钟；
103.g.加1.2ml nahpo4缓冲液，20mm nahpo4，ph7.5，0.2％bsa，0.01％tween-20到离心管中；
104.h.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
105.i.用上述nahpo4缓冲液悬浮兔igg-荧光微球，2-8℃，储存备用。
106.s4、喷涂fusion5和硝酸纤维素膜，包括如下步骤：
107.a.用nahpo4缓冲液，10mm nahpo4，ph 7.0，20mm nacl，1.0％bsa，10％trehalose，0.2％pvp，0.5％np-40，稀释hbp抗体-荧光微球浓到0.05mg/ml，psp抗体-荧光微球浓度到0.08mg/ml，兔igg-荧光微球浓度到0.005mg/ml，制备抗体-荧光微球混合液，混均后，3000rpm，离心5分钟，取上清液再混均，用xyz三维划膜喷金仪，微定量喷涂方式，5ul/cm速度，将上述抗体-荧光微球混合液喷涂到fusion5上，30℃，烘干8小时，干燥封存，备用；
108.b.用nahpo4缓冲液，10mm nahpo4，ph7.0，1.5％trehalose，0.1％pvp，hbp抗体购于mybiosource，稀释到1.5mg/ml，psp抗体购于r&d systems，稀释到1.5mg/ml，羊抗兔igg抗体购于arbor assays,稀释到0.5mg/ml，将硝酸纤维素膜放在xyz三维划膜喷金仪上，用微定量划线方式，0.5ul/cm速度，将上述3个抗体液喷涂到硝酸纤维素膜上形成t1线，t2线和c线，两线间距5mm，30℃，烘干8小时，干燥封存备用；
109.s5、组装免疫层析检测卡，步骤如下：
110.a、免疫层析检测卡由免疫层析试纸条和外壳构成，在湿度小于30％，25-37℃房间进行组装；
111.b、在pvc底板长度方向顺次粘覆于底板上的25mm fusion5、25mm硝酸纤维素膜和32mm吸水纸；其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔hbp抗体涂层形成t1线、psp抗体涂层形成t2线和由羊抗兔igg抗体涂层形成c线；fusion5喷涂有hbp抗体-荧光微球，psp抗体-荧光微球和兔igg-荧光微球。
112.本发明实施例中，t1线与t2线平行设置，t1线与t2线之间的距离为5mm，t2线与c线平行设置，t2线与c线之间的距离为5mm。吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近c线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。fusion5位于硝酸纤维素膜靠近t1线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；fusion5重叠在硝酸纤维素膜上方，将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm免疫层析试纸条。
113.c、免疫层析检测卡的外壳由底座中和上盖构成，将上述免疫层析试纸条装入底座中，合上盖，构成免疫层析检测卡，上盖设置有样品孔和检测窗，露出试纸条局部区域；样品孔位于fusion5上部，露出部分为fusion5区域；检测窗位于硝酸纤维素膜上部，以露出全部t1线，t2线和c线；将免疫层析检测卡和干燥剂放入锡箔袋中，密封后，干燥保存。
114.s6、制备样品液和hbp/psp质控品，步骤如下：
115.a.样品液：20mm tris，ph7.5，150mm nacl，0.5％bsa，0.5％tween-20，0.05％proclin300；
116.b.制备hbp/psp质控品；
117.用pbs，ph7.0，1％trehaloes制备2000ng/ml hbp重组蛋白和4000ng/ml psp蛋白混合液，取10ul蛋白混合液倒入冻干瓶中，放入冷冻干燥机，离心，冷冻干燥，取出冻干瓶，密封后，2-8℃保存；
118.c、制备蛋白稀释液：20mm nahpo4，ph7.0，1.0mm edta，1.0mm dtt，150mm nacl,10％bsa，2.0％trehalose，0.5％pvp，0.02％np-40，0.05％proclin 300。使用前，将密封冻干瓶打开，加入1.0ml蛋白稀释液，充分溶解蛋白，制备成20ng/ml hbp蛋白和40ng/mlpsp蛋白质控品，2-8℃保存。
119.具体的，本技术的hbp/psp免疫层析试剂盒操作过程如下：
120.a、免疫荧光分析仪检测hbp和psp浓度过程：
121.用hbp/psp免疫层析检测卡进行定量测定样品中hbp和psp时，加10ul hbp/psp校准品或样品到免疫层析检测卡样品孔中，再加100ul样品液到样品孔中，反应5-20分钟后，t1线，t2线和c线产生相应的荧光信号，用免疫荧光分析仪测定t1线，t2线和c线产生的相对荧光强度单位(relative fluorescence units，rfu)；
122.b、建立免疫荧光分析仪检测hbp和psp浓度系统；
123.(1)、制备hbp/psp校准品；
124.用蛋白稀释液制备出0ng/mlhbp/psp蛋白液，10ng/ml hbp-20ng/ml psp蛋白液，20ng/ml hbp-40ng/ml psp蛋白液，40ng/ml hbp-80ng/ml psp蛋白液，80ng/ml hbp-160ng/ml psp蛋白液，作为hbp/psp校准品，2-8℃保存备用；
125.(2)、建立hbp和psp浓度标准曲线；
126.加10ul hbp/psp校准品到hbp/psp免疫层析检测卡样品孔中，再加100ul样品液到样品孔中，进行膜层析反应，10-20分钟后，用免疫荧光分析仪，选定激发波长365nm，检测波长610nm，测定免疫层析检测卡t1线，t2线及c线的rfu；以hbp校准品浓度为纵坐标，t1/c rfu比值为横坐标，制备hbp校准品浓度标准曲线，得到方程式，y＝13.445x
–
4.0496，r2＝0.9903，通过此标准曲线得到hbp浓度标准卡，作为对样品中所含hbp浓度进行定量分析依据。
127.hbp010204080ng/mlt1rfu42213654230563945673642crfu1248111684123861108912190t1/c0.0341.1691.8613.5586.041
128.以psp校准品浓度为纵坐标，t2/c rfu比值为横坐标，制备psp校准品浓度标准曲线，得到方程式，y＝20.96x-8.85，r2＝0.9894，通过此标准曲线得到psp浓度标准卡，作为对样品中所含psp浓度进行定量分析依据。
129.psp0204080160ng/mt2rfu48617459318495034894848crfu1248111684123861108912190
t2/c0.0341.4942.5714.547.78
130.输入上述标准卡到免疫荧光分析仪，建立免疫荧光分析仪自动显示检测样品中hbp和psp浓度系统。
131.(3).测定hbp/psp免疫层析试剂盒重复性和准确度；
132.制备成20ng/ml的hbp和40ng/ml psp校准品作为样本，用上述免疫层析试剂盒重复测定hbp和psp样本20次，分别计算平均值(m)，标准差(sd)，变异系数(cv)＝sd/m x100％，相对偏差(bias)＝(1-m/样本浓度)x 100％，结果见下表。
133.[0134][0135]
hbp/psp免疫层析试剂盒检测hbp的cv为4.05％，bias为3.7％，检测psp的cv为3.1％，bias为1.25％，说明此试剂盒重复性和准确度良好。
[0136]
(4).用hbp/psp免疫层析试剂盒检测血清中hbp和psp浓度；
[0137]
取出6瓶密封冻干hbp/psp质控品，打开瓶后，加入1.0ml蛋白稀释液溶解蛋白，制备成20ng/ml hbp蛋白和40ng/mlpsp蛋白质控品。10ul hbp/psp质控品与100ul样品液混合，加到hbp/psp免疫层析检测卡样品孔中，进行膜层析反应，10-20分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测hbp和psp浓度，获得相对偏差(bias)＝(1-检测浓度/质控品浓度)
×
100％，
结果如下：
[0138][0139]
hbp/psp质控品的相对偏差(bias)在
±
10％范围内。
[0140]
取10ul血清加到hbp/psp免疫层析检测卡加样孔中，再加100ul样品液到样品孔中，进行膜层析反应，10-20分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测hbp和psp浓度，结果如下：
[0141][0142]
具体的，本发明所采用的双抗体夹心免疫层析原理：
[0143]
hbp/psp免疫层析检测卡样品孔中的hbp和psp通过层析作用向前移动，与fusion5吸附hbp抗体-荧光微球或psp抗体-荧光微球结合，形成hbp-hbp抗体-荧光微球复合物或psp-psp抗体-荧光微球复合物；在毛细动力作用下，上述复合物和igg-荧光微球进入硝酸纤维素膜，通过硝酸纤维素膜t1线，hbp-hbp抗体-荧光微球复合物与t1线固定hbp抗体结合，形成荧光微球-hbp抗体-hbp-hbp抗体复合物，聚集在t1线；而psp-psp-抗体-荧光微球复合物通过t1线，向前移动，与t2线固定psp抗体结合，形成荧光微球-psp抗体-psp-psp抗体复合物，聚集在t2线；而igg-荧光微球通过t1线和t2线，继续向前移动，并与c线固定抗igg抗体结合，形成荧光微-igg-抗igg抗体复合物，聚集在c线，未结合成分继续移动到吸水纸位置。t1线捕获的荧光微球量与样品中hbp浓度成正相关，t2线捕获的荧光微球量与样品中psp浓度成正相关，而c线捕获的igg-荧光微球，表明完成免疫层析过程，也作为稳定因子，矫正外界因素引发微球荧光强度不一致。通过免疫荧光分析仪对t1线、t2线和c线荧光信号进行扫描，获得t1线，t2线和c线的相对荧光强度单位(relative fluorescence units，rfu)，进一步获得t1/c rfu比值，与样品中hbp浓度成正相关，获得样品中hbp浓度；获得t2/c rfu比值，与样品中psp浓度成正相关，获得样品中psp浓度。
[0144]
本发明建立了免疫荧光分析仪自动检测hbp/psp浓度过程：
[0145]
免疫荧光分析仪，其特征在于：激发光波长为350-430nm，接收波长为600-650nm。用此分析仪对免疫层析检测卡结果进行判读，可实现自动化，提供简单、快速、可靠的检测结果。将hbp/psp校准品加到hbp/psp免疫层析检测卡样品孔中，反应5-20分钟，用免疫荧光分析仪，测定免疫层析检测卡检测窗中t1线，t2线和c线rfu，获得t1/c和t2/c rfu比值，制备hbp和psp浓度标准曲线，通过标准曲线得到hbp或psp浓度标准卡，用于设立免疫荧光分析仪自动检测hbp和psp浓度系统，进一步检测样品中hbp和psp浓度。
[0146]
本发明建立hbp/psp免疫层析试剂盒操作过程：
[0147]
冻干hbp/psp质控品与蛋白稀释液混均，取出密封袋中hbp/psp免疫层析检测卡，加10-100ul hbp/psp质控品到免疫层析检测卡样品孔中，再加10-100ul样品液到样品孔中，进行膜层析反应，5-20分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测hbp和psp浓度，与预设hbp/psp质控品浓度比较，相对偏差在
±
10％范围内。加10-100ul样品到hbp/psp免疫层析检测卡样品孔中，再加10-100ul样品液到样品孔中，进行膜层析反应，5-20分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测hbp和psp浓度。
[0148]
本发明建立hbp/psp免疫层析试剂盒，操作简单，快速，特异性高，定量测定出血液中hbp和psp浓度，能满足临床检验要求。
[0149]
作为一个总的发明构思，本发明公还开了一种免疫层析试纸条组装过程：
[0150]
在湿度低于30％干燥房间，在pvc底板中间粘贴硝酸纤维素膜，一端粘贴吸水纸，位于硝酸纤维素膜上方，重叠2-3mm；另一端粘贴fusion5，位于硝酸纤维素膜上方，重叠2-3mm，形成试纸板，切割成宽3-5mm免疫层析试纸条。
[0151]
作为一个总的发明构思，本发明还公开了一种免疫层析检测卡组装过程：
[0152]
免疫层析检测卡由外壳和免疫层析试纸条构成，外壳由朔料上盖和底座组成。将上述免疫层析试纸条置于底座上，合上盖，形成免疫层析检测卡。所述上盖对应于硝酸纤维膜位置设有检测窗，暴露出t1线，t2线和c线，上盖对应于fusion5位置设有样品孔；
[0153]
将免疫层析检测卡和干燥剂放入锡箔袋中，密封后，干燥保存。
[0154]
样品液包括20-200mm tris，ph7.0-8.0，0.1-1.0％bsa，50-500mm nacl，0.2-2.0％tween-20，01-0.1％proclin 300。
[0155]
具体的，蛋白稀释液：10-100mm nahpo4，ph6.0-8.0，0.5-5.0mm edta，0.5-5.0mm dtt,20-200mm nacl,2-20％bsa,1.0-10％trehalose，0.1-1.0％polyvinylpyrrolidone(pvp),0.01-0.1％nonidet p-40(np-40)，0.01-0.1％proclin 300。使用前，将冻干hbp/psp蛋白与蛋白稀释液混合，2-8℃，储存备用。
[0156]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0157]
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。