一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。


背景技术：

2.随着医疗技术的发展，免疫检测越来越受到人们的重视。其中，化学发光免疫分析法是近三十年迅速发展起来的非放射性免疫分析方法，作为一种超高灵敏度的微量测定技术，已逐渐替代elisa免疫检测。化学发光免疫分析法也已在甲状腺、激素、代谢、心血管、炎症及肿瘤等诸多方面应用。其中，酶标记抗体结合物作为酶促反应的关键组分之一，其存在储存过程中易降解、酶活性及抗体与抗体特异性结合的反应活性降低等缺陷。因此，提高酶标记抗体结合物的稳定性及灵敏度对化学发光免疫分析法的应用至关重要。
3.目前，提高酶标记抗体结合物的稳定性的方法主要包括，化学修饰和添加技术。其中，化学修饰技术相对复杂且不易控制；添加技术简单、易行。因此，添加技术应用更为广泛。
4.现有添加技术，主要包括醇类、糖类、脂类等各种稳定剂添加，有些还会添加igg保护。不同的酶标记结合物所需添加的稳定剂可能是醇类、糖类、脂类中的一种或者几种组合，igg也可能是一种或多种组合，即不同的酶标记结合物需要不同的配方，一方面，配制过程比较繁琐、复杂；另一方面，igg一般价格比较昂贵，添加一种或多种igg会增加成本；更重要的是，添加这些组份后，还可能会影响试剂性能，如：灵敏度、最低检测限等。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。该保存液能够明显提高性磷酸酶标记结合物溶液在储存和使用过程中的稳定性。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液，由水和如下组分组成：
8.10～100mmol/l缓冲盐、2～20g/l蛋白质、0.5～5g/l表面活性剂、0.1～0.5mol/l盐离子、0.5～5g/l防腐剂和0.1％～1％保护剂；
9.所述保护剂为双甘肽。
10.本发明中，所述保护剂的质量分数为0.1％～1％，优选为0.4％。
11.本发明中，所述保存液的ph为7.00～8.00，优选为7.4。
12.本发明中，所述缓冲盐选自tris、mes、pb、hepes中的至少一种；所述保存液中缓冲盐的浓度为10～100mmol/l，优选为50mmol/l。
13.本发明中，所述蛋白质选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶蛋白中的至少一种；所述蛋白质在所述保存液中的浓度为2～20g/l，优选为10g/l。
14.本发明中，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通x-100、曲拉通x-405中的至少一种；所述表面活性剂在所述保存液中的浓度为0.5～5g/l，优选为1g/l。
15.本发明中，所述盐离子选自氯化钠、氯化镁、氯化锌、氯化钾中的至少一种，优选为氯化钠、氯化镁和氯化锌的组合。本发明具体实施例中，所述盐离子由氯化钠、氯化镁和氯化锌组成，各组分在所述保存液中的浓度为：0.1～0.3mol/l氯化钠、1～25mmol/l氯化镁、0.2～5mmol/l氯化锌。
16.本发明中，所述防腐剂选自叠氮钠、pc300、氯霉素、庆大霉素中的至少一种，优选为pc300；所述防腐剂的浓度为0.5～5g/l，优选为1.0g/l。
17.本发明还提供了所述的保存液的制备方法，包括：
18.在水中加入缓冲盐，混匀，调整ph为7.00～8.00；然后加入离子盐、蛋白质、表面活性剂、防腐剂和保护剂，混匀，调整ph为7.00～8.00；定容，过滤。
19.本发明中，所述过滤为过0.10～0.50μm滤膜，具体可为0.1μm、0.22μm或0.5μm。
20.本发明提供一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法，所述保存液由水和如下组分组成：10～100mmol/l缓冲盐、2～20g/l蛋白质、0.5～5g/l表面活性剂、0.1～0.5mol/l盐离子、0.5～5g/l防腐剂和0.1％～1％保护剂；所述保护剂为双甘肽。与现有技术相比，本发明优点在于
21.1、本发明保存液不仅能明显改善不同抗体(如nt-probnp、pg i、tgab、tpo)标记的碱性磷酸酶结合物在37℃加速7天后试剂的热稳定性，而且可以提高nt-probnp及pg i的测试信噪比，降低试剂制备的成本；
22.2、本发明将双甘肽作保护剂用于碱性磷酸酶结合物保存液中，无需添加igg、糖类、脂类、醇类等稳定剂；组份简单，制备方便，便于实现大批量生产。
具体实施方式
23.本发明提供了一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
24.本发明中，“bsa”为“牛血清白蛋白”的缩写。
25.如无特殊说明，本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
26.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
27.实施例1
28.用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：50mmol/l tris、10g/l bsa、0.15mol/l nacl、1g/l吐温20、1g/l pc300、1mmol/l mgcl2、0.2mmol/l zncl2、4g双甘肽。
29.制备步骤如下：
30.1、在干净容器中加入6.06gtris缓冲盐后，加入800ml纯水充分混匀，用1m hcl调整ph为7.00-8.00；
31.2、在上述溶液中加入9g nacl、0.09g mgcl2、0.027g zncl2，搅拌混匀；
32.3、加入10g bsa搅拌混匀；
33.4、加入表面活性剂1g tw-20搅拌混匀；
34.5、加入防腐剂1g pc300搅拌混匀；
35.6、加入保护剂双甘肽，搅拌混匀，并用5m hcl或5m naoh调ph为7.40，用纯水定容至1000ml，用0.22um滤芯过滤，得到保存液。
36.实施例2
37.用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：10mmol/l tris、2g/l bsa、0.1mol/l nacl、0.5g/l吐温20、0.5g/l pc300、5mmol/l mgcl2、1mmol/l zncl2、1g双甘肽。
38.制备步骤如下：
39.1、在干净容器中加入1.2100gtris缓冲盐后，加入800ml纯水充分混匀，用1m hcl调整ph为7.00-8.00；
40.2、在上述溶液中加入6.0000g nacl、0.4500g mgcl2、0.1350g zncl2，搅拌混匀；
41.1、加入2.0000g bsa搅拌混匀；
42.2、加入表面活性剂0.5000g吐温20搅拌混匀；
43.3、加入防腐剂0.5000g pc300搅拌混匀；
44.4、加入保护剂1.0000g双甘肽，搅拌混匀，并用5m hcl或5m naoh调ph为7.40，用纯水定容至1000ml，用0.22um滤芯过滤，得到保存液。
45.实施例3
46.用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：50mmol/l tris、15g/l bsa、0.2mol/l nacl、2g/l吐温20、2g/l pc300、10mmol/l mgcl2、5mmol/l zncl2、10g双甘肽。
47.制备步骤如下：
48.1、在干净容器中加入6.0600gtris缓冲盐后，加入800ml纯水充分混匀，用1m hcl调整ph为7.00-8.00；
49.2、在上述溶液中加入12.0000g nacl、0.9000g mgcl2、0.675g zncl2，搅拌混匀；
50.3、加入15.0000g bsa搅拌混匀；
51.4、加入表面活性剂2.0000g吐温20搅拌混匀；
52.5、加入防腐剂2g pc300搅拌混匀；
53.6、加入保护剂10g双甘肽，搅拌混匀，并用5m hcl或5m naoh调ph为7.40，用纯水定容至1000ml，用0.22um滤芯过滤，得到保存液。
54.对比例1
55.用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：
56.50mmol/l tris、10g/l bsa、0.15mol/l nacl、1.0000g/l吐温20、1.0000g/l pc300、1mmol/l mgcl2、2mmol/l zncl2、50g/l甘油、10g/l葡萄糖、1g/l壳聚糖、1g/l聚乙二醇4000、5g/l鼠igg。
57.测试例
58.酶标试剂由向上述保存液中加入氨基末端脑利钠肽前体(nt-probnp)或胃蛋白酶原i(pg i)与碱性磷酸酶标记结合物制得。
59.将上述时似乎离1～3和对比例1的试剂分别分为三份，一份用于信噪比测试，一份放置于37℃加速老化7天，一份放置于2～8℃保存。放置7天后，以放置2～8℃试剂为对照，
用两份酶标试剂同步测试相同样本。
60.信噪比测试结果如下：
61.表1 nt-probnp及pg i酶标记结合物信噪比测试结果
[0062][0063]
37℃加速7天结果如下：
[0064]
表2 nt-probnp及pg i酶标记结合物37℃加速7天稳定性结果
[0065][0066][0067]
从检测结果可以看出，本发明保存液配制的碱性磷酸酶结合物溶液热稳定性明显
改善且信噪比更优；37℃加速7天，nt-probnp和pg i的发光值降幅在3％以内；保护剂含量对稳定性影响不大。
[0068]
从对比实验例1中可以看出，碱性磷酸酶结合物在含有醇类、糖类、脂类、鼠igg的保存液中，37℃加速7天，其发光值降幅均在15％以上；
[0069]
将表1中nt-probnp和pg i替换成tgab和tpo，按上述方法检测加速7天后的发光值，测试结果如下：
[0070]
表3 tgab和tpo酶标记结合物37℃加速7天稳定性结果
[0071][0072][0073]
从检测结果可以看出，实例1-3的发光值降幅也在4％以内；对比实验例1发光值降幅均在15％以上。
[0074]
因考虑到双甘肽的结构特点，分别探究了双甘肽及甘氨酸对酶标工作液热稳定性的影响。
[0075]
表4
[0076][0077][0078]
从检测结果可以看出，添加双甘肽至酶标工作液中发光值降幅均在5％以内；对比
添加甘氨酸，发光值降幅均在15％以上。添加甘氨酸至酶标工作液中无显著保护作用。而且基于溶液的酸碱度，双甘肽所起到的保护作用并不是水解成甘氨酸后，作为氨基酸保护剂所起到的保护作用。
[0079]
因此，本发明的保存液不仅可以明显改善不同抗体碱性磷酸酶结合物在37℃加速7天的热稳定性，而且可以提高部分测试项目的测试信噪比。
[0080]
另外，本发明在实施例1的配方基础上还进行了如下试验：
[0081]
将缓冲盐替换成其他种类，如mes、hepes、pb等，保存液效果与实施例1较接近，无明显差别。
[0082]
将离子盐nacl更换成kcl，保存液效果与实施例1较接近，无明显差别。
[0083]
将表面活性剂更换成吐温80、曲拉通x-100、曲拉通x-405，保存液效果与实施例1较接近，无明显差别。
[0084]
将防腐剂更换成叠氮化钠、氯霉素、庆大霉素，保存液效果与实施例1较接近，无明显差别。
[0085]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。