分析方法、分析系统及分析表面与流程

1.本技术涉及一种分析方法、分析系统以及分析表面。更具体地，本技术涉及用于获取与细胞的位置信息相关联的包含在细胞中的构成成分的类型和量的分析方法、分析系统以及分析表面。


背景技术：

2.为了分析生物组织，测量包含在形成生物组织的细胞中的mrna的类型和量。在生物组织的分析中，不仅包含在细胞中的mrna的类型和量，而且细胞的位置信息也是重要的。鉴于此，目前已经提出了一些用于彼此相关联地获取包含在生物组织中的细胞的位置信息和关于包含在细胞中的mrna的信息的方法。
3.例如，下文引用的非专利文献1公开了称为空间转录组学的方法。在该方法中使用的探针含有裂解位点、t7扩增和测序处理、空间条码、umi和mrna捕获区(非专利文献1中的图2)。在该方法中，将组织切片置于固定有探针的载玻片上，组织切片中的mrna由分子捕获，然后进行逆转录以合成cdna。合成的cdna在裂解位点处裂解，收集在管中，并经受分析步骤，如序列。
4.引用列表
5.非专利文献
6.非专利文献1：patrik l.stahl等，visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics，science，2016年7月1日，第353卷，第6294期，第78-82页


技术实现要素：

7.本发明要解决的问题
8.认为如果细胞的位置信息和关于包含在细胞中的构成成分的信息可以针对形成生物组织的每个细胞彼此相关联，则可以更详细地分析生物组织。鉴于此，本技术的目的是提供一种能够以单细胞分辨率将细胞的位置信息与单元构成成分相关联的方法。
9.问题的解决方案
10.本技术的发明人发现上述问题可以通过特定的分析方法解决。
11.即，本技术提供了一种分析方法，包括：
12.成像步骤，在标本与表面重叠的状态下对标本成像，具有能通过刺激裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的分子经由连接基团固定至表面；
13.关联步骤，通过使用通过成像获得的标本图像使细胞的位置与在所述位置处的分子的条形码序列相关联；
14.裂解步骤，选择性地刺激所述细胞的位置以裂解在所述位置处的所述分子的连接基团；以及
15.结合步骤，通过该分子的目标捕获部，将通过裂解从该表面释放的该分子与该细
胞的构成成分结合。
16.标本可以包括组织样本。
17.在裂解步骤中，可以选择性地刺激细胞的位置以便不裂解在细胞的所述位置以外的位置处的分子的连接基团。
18.刺激可以是光刺激。
19.结合步骤可包括通过施加电场、磁场或离心力使分子朝向细胞移动的移动步骤。
20.结合步骤可以包括通过自然扩散细胞朝向分子移动的移动步骤。
21.结合步骤可包括将分子与细胞的构成成分结合的孵育步骤。
22.本技术的分析方法可进一步包括在结合步骤之后分析分子和细胞的构成成分的偶联物的分析步骤。
23.该偶联物可以在分析步骤中经受测序过程。
24.分析步骤可包括二维映射步骤，通过使用分析结果和标本图像，基于在关联步骤中的关联的结果执行二维映射。
25.此外，本技术还提供了一种分析系统，包括：
26.分析基板，所述分析基板具有表面，具有通过刺激可裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的分子经由所述连接基团固定至所述表面；
27.成像装置，成像与分析基板重叠的标本；
28.关联单元，将在通过所述成像获得的标本图像中选择的细胞的位置与在所述位置处的分子的条形码序列相关联；以及
29.刺激供应装置，所述刺激供应装置选择性地刺激细胞的所述位置，其中，
30.其中由于所述刺激从所述表面释放的所述分子经由所述分子的所述目标捕获部与所述细胞的构成成分结合的偶联物用作分析目标。
31.标本可以包括组织样本。
32.刺激供应装置可以形成为选择性地刺激细胞的位置，而不裂解在除细胞的位置以外的位置处的分子的连接基团。
33.该刺激供应装置可以是光照射装置。
34.分析系统可以包括施加电场、磁场或离心力的电场施加装置、磁场施加装置或离心力施加装置，电场、磁场或离心力用于使由于刺激供应装置的刺激从所述表面释放的所述分子朝向所述细胞移动。
35.分析系统可以进一步包括孵育设备，其促使由于通过刺激供应装置的刺激而从表面释放的分子与细胞的构成成分结合。
36.分析系统可以进一步包括分析装置，分析装置分析由于通过刺激供应装置的刺激而从表面释放的分子的偶联物和细胞的构成成分。
37.分析装置可以是测序器。
38.分析系统可以进一步包括二维映射单元，通过使用分析装置的分析结果和通过成像获得的标本图像，基于关联单元的关联结果执行二维映射。
39.进一步地，本技术还提供了一种分析表面，其中，
40.具有可裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的分子经由所述连接基团被固定至所述分析表面；以及
41.所述条形码序列用于提供关于具有所述条形码序列的所述分子被固定的位置的信息。
附图说明
42.图1示出根据本技术的分析方法的流程图的实例。
43.图2是用于描述根据本技术的分析方法中包括的每个步骤中的操作的示意图。
44.图3是示出了在根据本技术的分析方法中使用的分析表面和固定至该表面的分子的示意图。
45.图4是用于描述包括在根据本技术的方法中的关联步骤的示意图。
46.图5是根据本技术的分析系统的实例的框图。
具体实施方式
47.在下文中，将描述执行本技术的优选模式。要注意的是，下面描述的实施方式是本技术的典型实施例，并且本技术的范围不限于这些实施方式。应注意，将按以下顺序描述本技术。
48.1.第一实施方式(分析方法)
49.(1)第一实施方式的描述
50.(2)第一实施方式的实例
51.(2-1)成像目标制备步骤
52.(2-2)成像步骤
53.(2-3)关联步骤
54.(2-4)裂解步骤
55.(2-5)结合步骤
56.(2-6)分析步骤
57.2.第二实施方式(分析系统)
58.3.第三实施方式(分析表面)
59.1.第一实施方式(分析方法)
60.(1)第一实施方式的描述
61.在本技术的分析方法中，在其中标本与表面重叠的状态下对标本成像，具有可通过刺激裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的分子经由连接基团固定至该表面。然后，通过使用通过成像获得的标本图像将包含在标本中的细胞的位置与在该位置处的分子的条形码序列相关联。在进行关联之后，刺激待分析的细胞的位置，并且裂解存在于该位置处的分子的连接基团。由于裂解，分子从表面释放，并且分子经由目标捕获部与待分析的细胞的构成成分结合。
62.由此与细胞的构成成分结合的分子具有条形码序列，并且条形码序列与细胞的位置相关联。因此，当分析与细胞的构成成分结合的分子(例如，细胞的构成成分的识别、条形码序列的识别等)时，可以获得与细胞的位置信息相关联的关于细胞的构成成分的信息。此外，在分析方法中，还如上所述获取标本图像。因此，例如，可以在标本图像上映射关于细胞的构成成分的数据。
63.在本技术中，标本可以是固定的标本，例如，冷冻切片或ffpe切片。在许多情况下，相关技术的分析方法仅适用于冷冻切片或ffpe切片。然而，本技术的分析方法适用于这两个切片。标本可以是，例如，组织样本，并且特别地可以是生物组织样本。
64.在本技术的分析方法中，细胞的位置被选择性刺激，并且存在于该位置处的分子从表面释放然后与细胞的构成成分结合。更优选地，在裂解步骤中，选择性地刺激细胞的位置以便不裂解在细胞的该位置以外的位置处的分子的连接基团。这使得可以在单细胞分辨率下分析细胞的构成成分(例如，mrna或蛋白质)。即，本技术的分析方法可以是以单细胞分辨率分析包含在标本中的细胞的构成成分的分析方法。
65.此外，可以通过使用与细胞的位置信息相关联的条形码序列全面地分析包含在标本中的各种细胞的构成成分。例如，在根据相关技术的组织样本中的mrna的分析中，可以基于组织样本中的细胞的形态信息或免疫染色信息来指定特定区域，用激光等切出特定区域，然后对特定区域进行mrna分析。在本技术中，可以针对包含在组织样本中的每个细胞全面地执行组织样本中的mrna的表达信息，而无需例如切出组织样本。即，本技术的分析方法可以是以单细胞分辨率分析包含在标本中的多个细胞的构成成分的分析方法。
66.(2)第一实施方式的实例
67.图1示出根据本技术的分析方法的流程图的实例。如图1所示，本技术的分析方法可以包括成像目标制备步骤s101、成像步骤s102、关联步骤s103、裂解步骤s104、结合步骤s105和分析步骤s106。下面将描述每个步骤。
68.(2-1)成像目标制备步骤
69.在成像目标制备步骤s101中，制备稍后描述的成像步骤s102中的成像目标。成像目标可以是通过使标本与具有可通过刺激裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的分子经由连接基团固定至其的表面重叠而获得的层压体。
70.在成像目标制备步骤s101中，例如，如图2的(a)所示，具有其上固定有多个分子100的表面101的分析基板(例如，载玻片等)102与其上放置标本103的基板(例如，载玻片等)104重叠。可以执行重叠，使得表面101和标本103彼此面对，并且例如，表面101和标本103可以经由缓冲液等彼此接触。此外，在表面101和标本103重叠之后，分析基板102和基板104的层压体可以浸入诸如pbs的缓冲液中。
71.可以固定基板102和104之间的位置关系，使得在后面描述的步骤(具体地，成像步骤s102至结合步骤s105)中不改变由此重叠的表面101和标本103之间的位置关系。
72.每个分子100具有可通过刺激裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部。
73.在本说明书中，分子(即，具有连接基团、条形码序列和目标捕获的分子)用于捕获目标并且还可以被称为目标捕获分子。目标捕获分子是指示用于本技术的分子的名称，并且可以用于本说明书中，例如，是指已经捕获目标的分子，并且还是指其中连接基团已经在随后描述的裂解步骤中裂解的分子。目标捕获分子可以是，例如，单个分子或复杂分子。单个分子可意指例如具有多种功能的一种类型的分子，并且可以是例如具有配置为连接基团的核酸部分、配置为条形码序列的核酸部分和配置为目标捕获部的核酸部分的一种核酸(例如，dna或rna)。复合分子可以是，例如，含有两种或更多种类型的分子(例如，两种或更多种类型的分子的结合物质)的分子组装，并且可以是，例如，具有被配置为连接基团的核酸部分和被配置为条形码序列的核酸部分的核酸和被配置为目标捕获部的多肽(例如，蛋
白质或其部分、寡肽等)的偶联物。
74.将参考图3描述分子100的结构的实例。图3中的分子100具有连接基团1、收集序列部2、扩增序列部3、条形码序列部4、唯一分子标签(umi)部5、以及目标捕获部6。此外，分子100经由连接基团1被固定至表面101。
75.收集序列部2、扩增序列部3、条形码序列部4、umi部5也可以构成为连续的核酸(特别是dna)。在目标捕捉部6是核酸的情况下，不仅收集序列部2、扩增序列部3、条形码序列部4、umi部5，也可以将目标捕捉部6构成为连续的核酸(特别是dna)。在那些情况下，例如，靠近分子100被固定至表面101的部分的端部可以是5'-端，并且另一端可以是3'-端。
76.下面将描述分子100的构成成分。
77.连接基团1可以是通过刺激可裂解的，是通过例如光刺激或温度刺激可裂解的，并且优选地是通过光刺激可裂解的。光刺激特别适合于在以下描述的裂解步骤中选择性地刺激特定位置。
78.连接基团1可以含有例如选自芳基羰基甲基、硝基芳基、香豆素-4基甲基、芳基甲基、含金属的基团和其他基团的任何一种作为通过光刺激可裂解的连接基团。这些基团可以是描述于例如photoremovable protecting groups in chemistry and biology:reaction mechanisms and efficacy,chem.rev.2013,113,119-191。
79.例如，芳基羰基甲基可以是苯甲酰甲基、邻烷基苯甲酰基或对羟基苯甲酰基。硝基芳基可以是例如邻硝基苄基、邻硝基-2苯乙氧基羰基或邻硝基苯胺。芳基甲基可以是例如引入羟基的芳基或不引入羟基的芳基。
80.在连接基团1可通过光刺激裂解的情况下，连接基团可优选地通过具有360nm或更大波长的光裂解。连接基团可以优选地在0.5μj/μm2或更小的能量下切断。(light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology,nat methods.2015jan；12(1):23-6.doi:10.1038/nmeth.3219.)。通过采用通过具有上述波长或以上述能量的光切断的连接基团，可以减少当施加光刺激时可能发生的细胞损伤(具体地，dna或rna等的切断)。
81.在连接基团1可通过温度刺激裂解的情况下，连接基团1可包含例如温度响应聚合物。温度响应型聚合物可以响应于例如温度变化而从亲水变成疏水或从疏水变成亲水。通过这样的改变，目标捕获分子可以从表面1释放。
82.特别优选的是，可以通过短波长区域内的光，具体地，360nm至410nm的波长区域内的光来裂解连接基团，或者可以通过近红外区域或红外区域内的光，具体地，800nm以上的波长区域内的光来裂解连接基团。在连接基团被具有在可见光区域中的波长的光有效切断的情况下，可能难以处理分析表面。因此，连接基团优选地被短波长区域内的光或近红外区域或红外区域内的光裂解。
83.收集序列部2包含用于收集在后面描述的分析步骤中从表面101释放的分子100的核酸。该核酸可以是dna或rna，并且特别是dna。例如，如图3的(d)所示，包含在收集序列部2中的核酸的序列与固定至珠9的核酸8的序列互补。具有收集序列部2的分子100可以通过固定有多个核酸8的珠9有效地收集。包含在收集序列部2中的核酸的碱基序列可以由本领域技术人员适当地设定。
84.扩增序列部3可包含例如具有用于扩增核酸的引物序列或用于在稍后描述的分析步骤中转录核酸的启动子序列的核酸。该核酸可以是dna或rna，并且特别是dna。扩增序列
部3可以具有引物序列和启动子序列两者。引物序列可以是，例如，pcr handle。启动子序列可以是，例如，t7启动子序列。
85.条形码序列部4包含具有条形码序列的核酸。该核酸可以具体地是dna或rna，并且更具体地是dna。条形码序列用于例如识别目标捕捉分子在表面101上的位置。条形码序列可以用作用于区分具有某个条形码序列的目标捕获分子与具有其他条形码序列的目标捕获分子的标签。条形码序列可以与关于具有条形码序列的目标捕获分子被固定的位置的信息(在下文中，也称为“位置信息”)相关联。位置信息可以用于识别表面101上的位置，并且例如是关于xy坐标的信息，但是不限于此。id号可以分配给与位置信息相关联的条形码序列。id号可以用于成像步骤中的步骤和成像步骤之后的步骤中。id号可以一对一地对应于条形码序列，并且可以在成像步骤中和之后的步骤中用作对应于条形码序列的数据。
86.固定在表面101的特定区域中的多个目标捕捉分子可具有相同的条形码序列。因此，特定区域和条形码序列彼此相关联。通过将特定区域的大小设定为小于细胞的大小，具有条形码序列的目标捕获分子可以与一个细胞存在的位置相关联。如上所述，用于本技术的分析方法的表面可以具有多个区域，具有相同条形码序列的多个目标捕捉分子被固定到所述多个区域中的每一个。条形码序列在每个区中可以是不同的。每个区域的大小优选地小于细胞的大小并且可以是，例如，50μm或更小，优选地，10μm或更小，并且更优选地，5μm或更小。
87.在本技术的一个实施例中，具有其序列是已知的条形码序列的目标捕获分子可以固定在预定区域中。例如，表面101具有多个区域，并且固定到多个区域中的每一个的多个目标捕获分子可以具有相同的条形码序列。多个区域可以被设置为小于待分析的细胞的大小。关于如上所述形成的表面101，多个区域中的每一个可以与固定到每个区域的多个目标捕获分子的条形码序列相关联。
88.在本说明书中，具有相同条形码序列的目标捕捉分子被固定的区域(如上所述)也将被称为斑点。斑点的大小可以是，例如，50μm或更小，优选10μm或更小，并且更优选5μm或更小。
89.在如上所述形成的表面101中，当目标捕获分子固定到表面101上时，某些目标捕获分子的条形码序列和其中存在某些目标捕获分子的位置可以彼此相关联。为了固定，例如，将生物素与目标捕获分子的连接基团1结合，将链霉亲和素与目标捕获分子待固定的表面101结合，并且将生物素与链霉亲和素结合，从而将目标捕获分子固定在表面101。
90.在本技术的另一个实施例中，具有条形码序列的目标捕获分子可以被随机布置在表面101上。在这种情况下，在具有条形码序列的目标捕捉分子被固定到表面101之后，固定的目标捕捉分子的条形码序列被读取，由此某些目标捕捉分子的条形码序列与某些目标捕捉分子存在的位置相关联。该读取可以通过一种方法进行，例如通过合成的测序、通过连接的测序、或通过杂交的测序。
91.在此实施例中，例如，可以使用与具有相同条形码序列的多个目标捕获分子结合的珠(例如，凝胶珠)，并且该珠(例如，凝胶珠)可以被固定到表面101上。珠(例如，凝胶珠)的大小可以是例如50μm或更小，优选10μm或更小，并且更优选5μm或更小。为了使目标捕获分子与珠(例如，凝胶珠)结合，例如，可以使用生物素和链霉亲和素的组合。例如，生物素与这些目标捕获分子的连接基团1结合，链霉亲和素与该珠结合，并且该生物素与该链霉亲和
素结合，由此这些目标捕获分子被固定到该珠上。
92.表面101可以具有多个凹部。本实施例中的一个斑点或一个珠可以放置在该多个凹部中的每一个凹部中。由于多个凹部，该斑点或珠可以更容易地放置在表面101上。例如，该凹部优选地具有一个珠可以放置在其中的大小。凹部可具有诸如圆形、椭圆形、六边形或四边形的形状，但不限于此。
93.此外，在表面101中，其上放置斑点或珠的表面部分的表面状态可以不同于其他表面部分的表面状态。例如，放置斑点或珠的表面部分可以是亲水的，并且其他表面部分可以是疏水的，或者其它表面部分可以是疏水的并且具有突起。赋予表面亲水性的方法的实例包括在氧存在下的反应离子蚀刻和在臭氧存在下用深紫外光照射。在这些方法中，可以使用掩模，其要赋予亲水性的部分被穿透。此外，赋予表面疏水性的方法的实例包括硅酮喷雾(硅酮上喷雾)，例如，可以使用techspray 2101-12s等。此外，在赋予疏水性的情况下，例如，可以使用其待赋予疏水性的部分被穿透的掩模。
94.例如，也可通过使用dna微阵列制备技术等在基板上合成目标捕捉分子。例如，可以通过使用诸如用于光刻的数字微反射镜器件(dmd)、液晶快门或空间光相位调制器的技术在特定位置处合成目标捕捉分子。合成方法描述于，例如，basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology,clinical microbiology reviews,oct.2009,pp.611-633。注意，在通过合成在基板上合成目标捕捉分子的情况下，当合成目标捕捉分子时获取关于合成目标捕捉分子的位置的信息，并且条形码序列与位置信息相关联。此时，可给出id号。
95.在本技术的一个实施方式中，固定至表面的所有目标捕获分子可以具有共同的寡核苷酸序列。通过使用具有与寡核苷酸序列互补的序列的荧光标记的核酸，可以确认目标捕获分子被固定的位置(特别地，斑点的位置或珠的位置)，并且特别地可以确认暗场中的位置。此外，在表面上没有上述凹部或突起的情况下，可能难以掌握目标捕捉分子被固定的位置。在这种情况下，荧光标记使得更容易掌握其中目标捕获分子被固定的位置。
96.umi部5可以含有核酸，特别是dna或rna，更特别是dna。umi部5可以具有例如5个碱基至30个碱基，特别是6个碱基至20个碱基，更特别是7个碱基至15个碱基的序列。
97.umi部5可以被配置成使得固定到表面101上的目标捕获分子具有不同的序列。例如，在umi部具有10个碱基的核酸序列的情况下，umi序列的类型是四次方至十次方，即，一百万或更多。
98.umi部5可以用于定量目标分子。例如，将umi序列添加到通过mrna的逆转录获得的cdna中。通过扩增从一种mrna分子转录的cdna而获得的大量cdna具有相同的umi序列，但是通过扩增从与该mrna具有相同序列的另一种mrna分子转录的cdna而获得的大量cdna具有一不同的umi序列。因此，可以通过对具有相同cdna序列的umi序列的类型的数目进行计数来确定mrna的拷贝数。
99.例如，umi部5可以被配置成使得固定到斑点或珠的具有相同条形码序列的多个目标捕获分子具有不同的序列。也就是说，固定到斑点或珠的多个目标捕获分子可以具有相同的条形码序列并且具有不同的umi。
100.目标捕获部6具有用于捕获包含在细胞中的分子的构成成分。该构成成分可以是例如核酸或蛋白质。在构成成分是核酸的情况下，核酸可以是例如poly-t序列，以便全面地
捕获包含在细胞中的mrna。可替代地，该核酸可以具有与目标序列互补的序列。在构成成分是蛋白质的情况下，蛋白质可以是例如抗体。该构成成分可以是适体或分子印迹聚合物。
101.目标捕获部6可以包含两种或更多种类型的用于捕获包含在细胞中的分子的构成成分。目标捕获部6可以包含蛋白和核酸两者，并且可以包含例如抗体和poly-t序列两者。因此，可以同时检测蛋白质和mrna两者。
102.表面101可以优选地是透明基板的表面。整个基板可以是透明的，或者仅目标捕获分子待固定至其的一部分可以是透明的。该基板的表面优选地是平面的以便有利地使该表面与标本接触。透明基板可以是例如玻璃基板或树脂基板。基板可以是例如载玻片。因为基板是透明的，所以可以在后面描述的成像步骤中对标本成像。此外，因为基板是透明的，所以在后面描述的关联步骤中可以容易地执行关联。
103.标本4可以是，例如，包含细胞的标本，并且更具体地，包含细胞的固定标本。标本可以是生物组织样本，特别是冷冻的组织样本或福尔马林固定的石蜡包埋的(ffpe)标本，更特别是冷冻的组织切片或ffpe切片。标本4可装载在例如基板上，并且可特别地装载在透明基板的表面上。整个基板可以是透明的，或仅其上待装载标本的部分可以是透明的。透明基板可以是例如玻璃基板或树脂基板。基板可以是例如载玻片。基板的表面优选为平面的，以有利地使表面与固定有目标捕获分子的表面接触。
104.标本4可以被染色以便更容易执行稍后描述的细胞的分割。染色可以是例如细胞膜染色、苏木精伊红(he)染色、dapi染色或它们中的两种或更多种的组合。对于细胞膜染色，可以使用被并入脂质双层膜以发射荧光的细胞膜染色试剂，并且本领域技术人员可以适当地选择试剂。he染色可以用于明视野观察，例如，以鉴定细胞形态。dapi染色可以用于核染色。
105.(2-2)成像步骤
106.在成像步骤s102中，例如，如图2的(b)所示，在表面101和标本103重叠的状态下对标本103成像。成像可以在能够识别包含在标本103中的单个细胞的分辨率下进行。成像元件110可以是例如ccd或cmos。
107.例如，经由物镜111可通过成像元件110进行成像。即，捕捉图像可以是显微图像。可以根据细胞的大小适当地选择物镜111的放大倍率。
108.该成像可以是明场成像或暗场成像，或者可以执行明场成像和暗场成像两者。成像可以进行一次或多次。例如，成像可以针对由用户或控制单元选择的部分区域执行一次或多次，或者可以执行一次或多次以便全面覆盖整个或部分标本103。
109.成像元件110的成像能够通过与成像元件110连接的未图示的控制单元进行控制。控制单元可包括例如硬盘、cpu和存储器，并且控制单元的功能可通过例如通用计算机或信息处理装置来实现。
110.此外，控制单元可设置在成像元件110中。例如，包括控制单元的成像元件可形成为具有层压多个晶粒(例如，两个或三个晶粒)的层压结构的单片半导体器件。晶粒之一包括在二维中并排布置的多个像素。用于实现控制单元的功能的组件(例如，cpu、存储器等)可被安装在剩余的晶粒上。包括控制单元的成像元件的实例是例如在wo 2018/051809中公开的成像元件。通过使用包含控制单元的成像元件作为成像元件，不用向成像元件的外部输出标本图像数据，就能够进行各种处理。这导致信息处理的速度增加。
111.成像元件110可将通过成像获得的标本图像数据传输至控制单元。控制单元接收标本图像数据并在后续步骤中使用标本图像数据。
112.此外，由控制单元接收的标本图像数据可存储在例如连接至控制单元的存储单元中。存储单元可以是通用存储装置。在执行后续步骤的情况下，控制单元可以从存储单元获取标本图像数据。
113.(2-3)关联步骤
114.在关联步骤s103中，通过使用通过在成像步骤s102中成像而获得的标本图像，细胞的位置和在该位置处的目标捕捉分子的条形码序列彼此相关联。该关联可以提前经由与条形码序列相关联的位置信息来执行。在id号被分配给每个条形码序列的情况下，细胞的位置和id号可以关联。因此，细胞的位置和条形码序列可以经由id号相关联。
115.细胞的位置可以意指在标本图像中由细胞占据的区域。为了识别该区域，可以对标本图像执行图像处理，例如，可以对其进行细胞分割。细胞分割使得更容易鉴定存在于细胞位置处的目标捕获分子。
116.例如，在关联步骤s103中，获取标本图像中细胞中待分析的细胞的位置信息。细胞的位置信息可以通过使用通过分割获得的图像数据来获取。因为标本图像是通过对由此重叠的表面101和标本103成像而获得的，所以细胞的位置信息对应于在细胞的位置处的目标捕捉分子的位置信息。这里，如上所述，在成像目标制备步骤s101中，目标捕捉分子的位置信息与目标捕捉分子的条形码序列相关联。因此，通过获取标本图像中的细胞的位置信息，可以使细胞的位置与该位置处的目标捕捉分子的条形码序列相关联。
117.这种关联可以优选地进行，使得一个条形码序列不与两个或更多个细胞的位置相关联。例如，在一些情况下，两个或更多个细胞存在于上述一个斑点中。在这种情况下，固定到该一个斑点的目标捕获分子的条形码序列优选地不与这两个或更多个细胞的任何位置相关联。
118.将参照图4描述如何在表面上的斑点中区分待关联的斑点和不待关联的斑点的实例。
119.当放大图4的左边部分中的组织的标本图像的一部分或者获取其部分的放大图像时，如在图4的中心部分中所示，可以视觉识别组织样本中的细胞。标本在与分析表面重叠的同时被成像，并且因此在标本与大量圆形斑点重叠的状态下被成像，例如，如图4的右侧部分所示。每个圆形斑点具有多个具有相同条形码序列的目标捕获分子。
120.在图4的右侧部分中，为了更好的理解，示出了大量圆形斑点。然而，这些斑点可能在由成像元件获取的图像中不被确认或者可能被确认。
121.另外，在标本图像中无法确认斑点的位置的情况下，也可以通过图像处理在标本图像中显示斑点的位置。
122.在图4的中心部分的标本图像中，可以确认存在两种类型的细胞。一种类型的细胞用深灰色着色，而另一种类型的细胞用浅灰色着色。例如，对于那些两种类型的细胞，每个细胞的位置与存在于该位置处的目标捕获分子的条形码序列相关联，由实线圆指示的斑点被关联，如图4的右侧部分所示。每个实线圆存在于一个细胞的图像的区域中。如上所述，存在于一个细胞的图像区域中的斑点可以是待关联的目标。
123.同时，例如，每个虚线圆与两个或更多个细胞重叠，在细胞和细胞外的区域上延
伸，或存在于细胞的图像的区域之外。这些虚线圆可能不是要关联的目标。
124.例如，可以通过控制单元来执行关联步骤s103。例如，控制单元可以使存在于标本图像中的细胞之中的所有或一些类型的细胞的位置与存在于细胞的该位置处的分子的条形码序列相关联。在关联一些类型的细胞的情况下，控制单元可以基于例如细胞的特性(形状、大小、颜色、图案或其组合)来识别要相关联的细胞。例如，可以仅关联特定类型的细胞。例如，在图4的中心部分的图像中，具有深灰色的细胞的位置与存在于该位置处的目标捕获分子的条形码序列相关联，而具有浅灰色的细胞不关联。
125.另外，在作为成像元件使用包括控制单元的成像元件的情况下，在不向成像元件的外部输出标本图像数据的情况下，能够进行关联步骤s103。因此，能够以更高的速度执行关联步骤s103。
126.可以响应于用户操作来执行关联步骤s103。例如，用户通过例如点击鼠标，从存在于标本图像中的细胞之中选择将被关联的细胞。然后，控制单元可以将由用户选择的细胞的位置与该位置处的目标捕获分子的条形码序列相关联。
127.(2-4)裂解步骤
128.在裂解步骤s104中，选择性地刺激细胞的位置以裂解在该位置处的分子的连接基团。例如，如图2的(c)所示，可以通过刺激供应装置130用光照射所选择的细胞的位置。
129.提供刺激的位置可以是在关联步骤s103中关联的一些细胞的位置或者可以是在其中关联的所有细胞的位置。优选的是，选择性地刺激细胞的位置以便不裂解在除细胞的位置以外的位置处的目标捕获分子的连接基团。刺激供应装置130优选地被配置为选择性地提供刺激，如上所述。即，在裂解步骤s104中，具有尚未关联的条形码序列的目标捕获分子的连接基团可以不被裂解。
130.例如，在图4的右部的图像中，可以刺激由实线圆表示的所有相关联的斑点。如上所述，可以刺激相关联的细胞的所有位置。
131.可替换地，在图4的右部的图像中，可以刺激在具有深灰色的细胞中由实线圆形斑点表示的位置或在具有浅灰色的细胞中由实线圆形斑点表示的位置。如上所述，可以刺激一些相关联的细胞(具体地，特定类型的细胞)的位置。
132.可替换地，在图4的右部的图像中，可以刺激从相关细胞中选择的一个或多个细胞中的由实线圆形斑点表示的位置。如上所述，可以刺激一些相关联的细胞(具体地，所选择的细胞)的位置。
133.通过在步骤s104中裂解连接基团，目标捕获分子从表面101释放。例如，如图3的(b)所示，分子100的连接基团1被裂解，并且分子100从表面101释放。
134.该刺激可以是例如光刺激或温度刺激(也称为热刺激)并且可以优选地是光刺激。光刺激特别适合于选择性地刺激特定的窄范围。
135.例如，可以通过控制单元执行裂解步骤s104。更具体地，控制单元可以驱动刺激供应装置以选择性地刺激细胞的位置。以下将描述可采用的刺激供应装置的实例。
136.为了选择性地将光刺激施加到细胞的位置，可以使用光照射装置作为刺激供应装置130。例如，光照射装置可以是数字微镜装置(dmd)或液晶显示装置。包括在dmd中的微镜可用光照射表面101上的选定位置。例如，液晶显示装置可以是反射液晶显示器，并且其具体实例包括sxrd(索尼公司)。通过控制液晶显示装置的液晶，可以用光照射表面101上的选
定位置。
137.此外，液晶快门或空间光调制器可以用于选择性地将光刺激施加到细胞的位置。同样，通过这些单元，可以将光刺激施加到所选择的位置。
138.本领域技术人员可根据目标捕获分子中包含的连接基团的类型适当地选择照射光的波长。
139.例如，红外光和红外光吸收材料的组合可用于选择性地向细胞的位置施加温度刺激。在这种情况下，该刺激供应装置可以是例如红外激光产生装置。例如，具有表面101的基板102由红外光吸收材料制成，然后通过红外激光产生装置用红外光选择性地照射细胞的位置，由此可以选择性地对该位置施加温度刺激。
140.(2-5)结合步骤
141.在结合步骤s105中，通过步骤s104中的裂解从表面101释放的目标捕捉分子经由目标捕捉分子的目标捕捉部与细胞的构成成分结合。
142.例如，如由图2的(c)中的单点链线包围的示意性放大图所示，仅在用光照射的位置处的目标捕获分子的连接基团被裂解并且被带入紧邻其下方的细胞中。然后，例如，如图3的(c)中所示，细胞构成成分7可以在细胞中与目标捕获分子100的目标捕获部6结合。
143.结合步骤s105可以包括通过施加电场、磁场或离心力使目标捕获分子朝向细胞移动的移动步骤。例如，因为目标捕获分子中包含的核酸具有负电荷，所以可以通过正电荷使目标捕获分子朝向细胞移动。例如，可以通过将基板102和基板104的层压体放置在相对的电极之间来施加电场。此外，具有不阻碍明场观察或暗场观察(具体地，荧光观察)的厚度的金属薄膜或透明电极(诸如氧化铟锡(ito)电极)可以放置在基板102和基板104上。施加电场的电场施加装置、施加磁场的磁场施加装置或施加离心力的离心力施加装置可以是本领域中已知的装置。离心力施加装置的实例包括摆动转子型离心力施加装置。例如，通过控制单元可以控制由这些装置施加电场、磁场或离心力。
144.结合步骤s105可以包括通过自然扩散使目标捕捉分子朝向细胞移动的移动步骤。
145.在移动步骤中，可以使用施加电场、磁场或离心力和自然扩散的组合。该移动步骤优选地包括施加电场。这使得可以增加所释放的目标捕获分子被摄入细胞的概率。
146.结合步骤s105可以包括用于使目标捕获分子与细胞的构成成分结合的孵育步骤。孵育步骤的时间和温度可以根据目标捕获部和由目标捕获部捕获的细胞构成成分来选择。孵育步骤可以在例如表面101和标本之间的空间填充有缓冲液的状态下进行。例如，在目标捕获部和细胞构成成分两者都是核酸的情况下，例如，孵育可以在恒温室中在30℃至40℃、具体地30℃至37℃进行例如5小时至30小时、具体地16小时至24小时。例如，在目标捕获部是抗体并且细胞构成成分是由抗体捕获的构成成分的情况下，孵育可以在例如0℃至30℃、具体地4℃至室温(例如，25℃)下进行例如5小时至30小时、具体地16小时至24小时。
147.在结合步骤s105中，目标捕获分子可以被带入细胞或可以与细胞表面结合。然后，目标捕获分子经由目标捕获分子的目标捕获部与细胞的构成成分结合。此后，分离表面101和标本103，并且通过洗涤去除未结合的目标捕获分子。洗涤方法可以是，例如，在缓冲液中浸渍标本103。
148.(2-6)分析步骤
149.在分析步骤s106中，可以分析通过结合步骤s105中使目标捕获分子与细胞构成成
分结合而产生的偶联物。如图2的(d)所示，可以通过使用分析装置200进行分析。例如，在分析步骤s106中，可以使偶联物经受测序过程，并且分析装置200可以是测序仪。测序过程可以在例如细胞构成成分是核酸，特别是dna或rna，更特别是mrna的情况下进行。测序过程可以通过测序仪进行，或者可以通过下一代测序仪或通过桑格方法的测序仪进行。为了以更高的速度全面分析形成组织的细胞，可以通过下一代测序仪进行测序过程。
150.为了在分析步骤中进行测序过程，分析步骤可进一步包括制备要进行测序过程的核酸(例如，cdna等)的步骤和纯化核酸的步骤。通过制备步骤和纯化步骤，例如，可以制备用于进行下一代测序过程的库。
151.在库的制备中，可以使用收集序列部2，例如图3的(d)中所示。与细胞构成成分7结合的分子100可以通过使用珠9收集，具有与包含在收集序列部2中的核酸序列互补的序列的核酸被固定至该珠。
152.在制备步骤中，可以使用例如pbs的缓冲液洗涤在结合步骤s105中结合的基板102和104的层压体，以去除未结合的目标捕获分子。然后，接下来，从基板104移除基板102，并且例如，可以在已经取得目标捕获分子的细胞上进行从mrna合成cdna的cdna合成步骤和扩增合成的cdna的扩增步骤。在cdna合成步骤和扩增步骤之前，可以进行溶解细胞的溶解步骤。当在溶解步骤之后收集目标捕获分子和目标的偶联物时，可以更有效地进行cdna合成步骤和扩增步骤。
153.在制备步骤之后，可以进行纯化在制备步骤中获得的核酸的纯化步骤。纯化步骤可以包括，例如，通过使用酶(如蛋白酶k)分解除核酸之外的构成成分的过程。此外，可以在纯化步骤中进行核酸收集过程。在核酸收集过程中，例如，可以使用可商购的核酸纯化试剂，并且其实例包括磁珠，如ampure xp。注意，细胞中的dsdna也可以在纯化步骤中收集，但是可以防止dsdna在测序过程中经受测序。例如，当目标捕获分子具有用于测序过程(具体地，用于下一代测序过程)的适配子序列时，只有具有该适配子序列的核酸可以经受测序。
154.在分析步骤s106中，可以基于测序过程的结果针对每个细胞分析细胞构成成分。例如，在分析步骤s106中，可以针对每个细胞确定包含在细胞中的mrna的序列和/或每个mrna的拷贝数。此外，在分析步骤s106中，可以针对每个细胞确定抗原的类型和/或数量或转录因子的类型和/或数量。对每个细胞的细胞构成成分的此类分析可以基于由测序过程确定的序列的条形码序列进行。例如，从通过测序过程确定的大量序列中选择具有相同条形码序列的序列。具有相同条形码序列的序列是基于摄取到一个细胞中的目标捕获分子。因此，针对每个条形码序列分析细胞构成成分是指针对每个细胞分析细胞构成成分。
155.分析步骤s106可包括二维映射步骤，通过使用分析结果和标本图像，基于在关联步骤s103中的关联的结果执行二维映射。例如，在分析步骤s106中，可以基于与条形码序列相关联的位置信息将每个细胞的细胞构成成分的分析结果映射到在成像步骤中获得的标本图像上。通过映射，例如，如图2的(e)所示，可以获得标本图像(图2的(e)中的上部)和示出标本图像中各个位置处的细胞构成成分的类型的分布的映射图像(图2的(e)中的下部)。基于通过映射获得的图像，可以掌握在哪个位置处的哪个细胞包含哪个分子多少量。即，可以将通过成像获得的位置信息与通过序列分析获得的定量信息相结合，并且因此可以在单细胞分辨率下保持空间信息的同时全面分析组织样本中的分子。
156.2.第二实施方式(分析系统)
157.图5是根据本技术的分析系统的实例的框图。如图5所示，本技术的分析系统10包括分析基板102、成像元件110、控制单元120、存储单元125和刺激供应装置130。
158.分析基板102、成像元件110和刺激供应装置130可以是在以上部分1中描述的那些，并且其描述也应用于本实施方式。
159.控制单元120可以是上述部分1中描述的控制单元，并且其描述也应用于本实施例。控制单元120可包括例如图像处理单元121、关联单元122和刺激控制单元123。以下将更详细地描述这些单元。
160.图像处理单元121处理由成像元件110获取的标本图像。例如，图像处理单元121可以执行在以上部分1中描述的细胞分割。此外，图像处理单元121可从存在于标本图像中的细胞之中识别在关联步骤中要关联的细胞。例如，可以基于细胞的特性(形状、大小、颜色、图案或它们的组合)执行识别。还可以基于图像中的颜色数据来执行识别。例如，可以将发射特定荧光的细胞识别为要在关联步骤中关联的细胞。
161.关联单元122将细胞的位置与细胞的该位置处的目标捕获分子的条形码序列相关联。可通过使用通过分割获得的图像来执行关联。
162.例如，关联单元122可以基于标本图像获取细胞的位置数据，识别对应于该位置数据的位置数据被分配到的条形码序列，并且将该条形码序列与细胞的位置相关联。
163.关联单元122可以针对标本图像中的所有细胞或者标本图像中的一些细胞执行细胞的位置与目标捕获分子的条形码序列的关联。例如，关联单元122可以仅关联一些类型的细胞或者仅关联标本图像中存在的所有细胞中存在于一些区域中的细胞。
164.刺激控制单元123使刺激供应装置130选择性地刺激由关联单元122相关联的细胞的位置。刺激控制单元123可以驱动刺激供应装置130以刺激由关联单元122关联的所有或一些细胞。刺激供应装置130优选地被配置为选择性地刺激细胞的位置，而不裂解在除细胞的位置以外的位置处的目标捕获分子的连接基团。刺激供应装置130优选地是在以上部分1中描述的光照射装置。
165.控制单元120可包括例如硬盘、cpu和存储器，并且控制单元的功能可通过例如通用计算机或信息处理装置来实现。图像处理单元121、关联单元122和刺激控制单元123的功能也可通过通用计算机或信息处理装置来实现。
166.如以上部分(2-2)中所述，控制单元120可设置在成像元件110中。通过使用包括控制单元的成像元件作为成像元件，可以进行各种类型的处理，而不向成像元件的外部输出标本图像数据。这导致信息处理的速度增加。例如，上述图像处理单元121、关联单元122和刺激控制单元123的处理可以更高速度执行。
167.为了执行在以上部分1中描述的结合步骤s105，分析系统10可以包括，例如，施加电场或磁场的电场或磁场施加装置，或施加离心力的离心力施加装置，用于将由于通过刺激供应装置130的刺激而从分析基板102的表面释放的目标捕获分子朝向细胞移动。通过该装置，目标捕获分子被更有效地带入细胞。
168.为了执行在以上部分1中描述的结合步骤s105，分析系统10可以进一步包括用于促进细胞构成成分与由于刺激供应装置130的刺激而从分析基板102的表面释放的目标捕获分子结合的孵育装置。孵育装置可包括例如恒温室。
169.为了执行在以上部分1中描述的分析步骤s106，分析系统10可以进一步包括用于
分析细胞构成成分与由于由刺激供应装置130的刺激从分析基板102的表面释放的目标捕获分子的偶联物的分析装置。分析装置可以是例如测序仪。测序仪可以是例如下一代测序仪或通过桑格法进行测序的测序仪。
170.分析系统10还可以包括二维映射单元，二维映射单元通过使用分析装置的分析结果和标本图像，基于关联单元的关联结果执行二维映射。二维映射单元能够被设置为控制单元120的组件并且能够执行例如在以上部分1中描述的二维映射步骤。二维映射单元能够将例如关于细胞的构成成分的信息映射到标本图像上。例如，关于细胞的构成成分的信息可以是细胞构成成分的类型或者数量。基于通过映射获得的图像，可以掌握在哪个位置处的哪个细胞包含什么量的哪个分子。即，可以将通过成像获得的位置信息与通过序列分析获得的定量信息相结合，并且因此可以在单细胞分辨率下保持空间信息的同时全面分析组织样本中的分子。
171.分析系统10还可以包括输出单元。输出单元可包括例如显示装置和/或打印装置。控制单元120可使输出单元输出通过执行根据本技术的分析方法获得的图像，诸如，由成像元件110获取的标本图像和由二维映射单元生成的映射图像。此外，控制单元120可使输出单元输出分析装置的分析结果(例如，测序过程的结果等)。
172.3.第三实施方式(分析表面)
173.本技术还提供了一种分析表面，其中具有可裂解连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的目标捕获分子经由连接基团固定至分析表面，并且条形码序列用于提供关于具有条形码序列的分子被固定的位置的信息。分析表面的实例是在以上部分1中描述的分析基板102的表面101，并且表面的描述也应用于本实施方式。
174.应注意，本技术还可具有以下配置。
175.[1]一种分析方法，包括：
[0176]
成像步骤，在所述标本与表面重叠的状态下对所述标本成像，具有能通过刺激裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的分子经由所述连接基团固定至所述表面；
[0177]
关联步骤，通过使用通过所述成像获得的标本图像使细胞的位置与在所述位置处的所述分子的所述条形码序列相关联；
[0178]
裂解步骤，选择性地刺激所述细胞的位置以在所述位置处裂解所述分子的连接基团；以及
[0179]
结合步骤，通过该分子的目标捕获部，将通过该裂解从该表面释放的该分子与该细胞的一种构成成分结合。
[0180]
[2]根据[1]所述的分析方法，其中，所述标本包括组织样本。
[0181]
[3]根据[1]或[2]所述的分析方法，其中，在裂解步骤中，选择性地刺激细胞的位置以便不在细胞的位置以外的位置处裂解分子的连接基团。
[0182]
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的分析方法，其中，所述刺激是光刺激。
[0183]
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的分析方法，其中，结合步骤包括通过施加电场、磁场或离心力使分子朝向细胞移动的移动步骤。
[0184]
[6]根据[1]至[4]中任一项所述的分析方法，其中，结合步骤包括通过自然扩散朝向细胞移动分子的移动步骤。
[0185]
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的分析方法，其中，结合步骤包括使分子与细胞的
构成成分结合的孵育步骤。
[0186]
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的分析方法，进一步包括在结合步骤之后分析分子与细胞的构成成分的偶联物的分析步骤。
[0187]
[9]根据[8]所述的分析方法，其中，在分析步骤中对偶联物进行测序处理。
[0188]
[10]根据[8]或[9]所述的分析方法，其中，所述分析步骤包括二维映射步骤，通过使用所述分析的结果和所述标本图像，基于所述关联步骤中的关联的结果执行二维映射。
[0189]
[11]一种分析系统，包括：
[0190]
分析基板，所述分析基板具有表面，具有通过刺激可裂解的连接基团的分子、条形码序列、以及目标捕获部经由所述连接基团固定至所述表面；
[0191]
成像装置，成像与分析基板重叠的标本；
[0192]
关联单元，将在通过所述成像获得的标本图像中选择的细胞的位置与在所述位置处的所述分子的所述条形码序列相关联；以及
[0193]
刺激供应装置，所述刺激供应装置选择性地刺激所述细胞的位置；其中，
[0194]
其中由于所述刺激从所述表面释放的所述分子经由所述分子的所述目标捕获部与所述细胞的构成成分结合的偶联物用作分析目标。
[0195]
[12]根据[11]所述的分析系统，其中，标本包括组织样本。
[0196]
[13]根据[11]或[12]所述的分析系统，其中，所述刺激供应装置被配置为选择性地刺激所述细胞的位置，而不在除所述细胞的位置以外的位置处裂解分子的连接基团。
[0197]
[14]根据[11]至[13]中任一项所述的分析系统，其中，刺激供应装置是光照射装置。
[0198]
[15]根据[11]至[14]中任一项所述的分析系统，其中，分析系统包括电场施加装置、磁场施加装置或离心力施加装置，所述电场施加装置、磁场施加装置或离心力施加装置施加电场、磁场或离心力以使由于由刺激供应装置的刺激而从表面释放的分子朝向细胞移动。
[0199]
[16]根据[11]至[15]中任一项所述的分析系统，进一步包括孵育装置，所述孵育装置促使由于通过所述刺激供应装置的刺激而从表面释放的分子与所述细胞的构成成分结合。
[0200]
[17]根据[11]至[16]中任一项所述的分析系统，进一步包括分析装置，所述分析装置对由于通过所述刺激供应装置的刺激而从所述表面释放的所述分子的偶联物和所述细胞的构成成分进行分析。
[0201]
[18]根据[17]所述的分析系统，其中，分析装置是测序器。
[0202]
[19]根据[17]或[18]所述的分析系统，进一步包括二维映射单元，通过使用分析装置的分析结果和通过成像获得的标本图像，基于关联单元的关联结果执行二维映射。
[0203]
[20]一种分析表面，其中，
[0204]
具有可裂解的连接基团、条形码序列、以及目标捕获部的分子经由所述连接基团被固定至所述分析表面；以及
[0205]
所述条形码序列用于提供关于具有所述条形码序列的所述分子被固定的位置的信息。
[0206]
附图标记列表
[0207]
100 分子
[0208]
101 分析表面
[0209]
102 基板
[0210]
103 标本
[0211]
104 基板
[0212]
110 成像元件
[0213]
120 控制单元
[0214]
130 刺激供应装置。