一种基于靶向vvhA基因准确检测创伤弧菌的检测方法与流程

技术特征：
1.一种基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、基于vvha基因序列进行多重序列比对，并将序列中的相同序列输入预设的基本局部排列搜索工具中，进行引物和探针设计；s2、通过qpcr方法，筛选出最佳引物对，根据所述最佳引物对设计并得到对应的探针；s3、基于步骤s2中得到的引物和探针配置第一检测溶液，并基于定量实时pcr系统进行热循环处理，得到最佳qpcr循环方案；s4、基于步骤s2中得到的引物和探针配置第二检测溶液，并基于液滴数字pcr系统进行扫描处理，得到最佳ddpcr扩增方案；s5、将预设浓度的pma加入预制的活菌菌液和热灭活菌液中，进行曝光，获得完全抑制死菌dna扩增而不影响活菌dna扩增的最佳pma浓度和确定最佳曝光时间；s6、采用步骤s5得到的pma，处理不同浓度v.vulnificus的血浆模拟临床样本，提取基因组dna，并进行检测。2.如权利要求1所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，在步骤s1中，基于vvha基因序列进行多重序列比对，并将序列中的相同序列输入预设的基本局部排列搜索工具中，进行引物和探针设计，包括：预设primer-blast基本局部排列搜索工具；根据genbank中已发表序列，对创伤弧菌v.vulnificus溶血素a基因(vvha基因)的序列进行多重序列比对，并将这些序列中的相同序列输入所述primer-blast中进行引物设计；在所述primer-blast页面上勾选internal hybridization oligo选项，并按以下标准进行探针设计：(1)探针大小设定为最小18-30bp；(2)熔解温度(tm)设定为50-70℃；(3)gc含量设定为40-60％；其他参数设置为默认值，探针的5'端为6-fam(6-corboxy-fluororescein)，3'端为bhq1(black hole quencher 1)。3.如权利要求1所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，在步骤s2中，通过qpcr方法，筛选出最佳引物对，根据所述最佳引物对设计并得到对应的探针，包括：通过qpcr方法，从primer-blast中筛选出最佳引物对；根据所述最佳引物对，设计与所述最佳引物对相相应的探针，用于后续的pma-qpcr和pma-ddpcr检测。4.如权利要求3所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，在步骤s3中，基于步骤s2中得到的引物和探针配置第一检测溶液，并基于定量实时pcr系统进行热循环处理，得到最佳qpcr循环方案，包括：配置第一检测溶液，第一检测溶液包括：10μl perfectstartii probe qpcr supermix，1μl引物，1μl探针，2μl模板dna，5μl无核酸酶水；将所述第一检测溶液置于热循环仪中，并设定热循环参数和冷却时间；基于上述实施步骤，设定不同引物浓度、探针浓度和退火温度的扩增条件，并根据不同扩增条件下扩增曲线的ct值和荧光强度增强值(δrn)来判断最佳的qpcr循环参数方案。5.如权利要求3所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，
在步骤s4中，基于步骤s2中得到的引物和探针配置第二检测溶液，并基于液滴数字pcr系统进行扫描处理，得到最佳ddpcr扩增方案，包括：配置第二检测溶液，第二检测溶液包括：7μl perfectstart ii probe qpcr supermix，1.4μl引物，0.42μl探针，1.4μl模板dna，2.38μl无核酸酶水；将所述第二检测溶液注入预设的数字芯片上的加样孔，设定热循环参数和冷却时间，并进行pcr反应至终点，进行pcr扩增；pcr扩增后，把数字芯片转移到芯片扫描仪上，用于读取和分析每个液滴的荧光幅度；基于上述实施步骤，设定不同引物浓度、探针浓度和退火温度的扩增条件，并根据不同扩增条件下一维扩增图像中所有阳性点和阴性点之间的分离程度来判断最佳的ddpcr扩增方案。6.如权利要求1所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，在步骤s5中，将预设浓度的pma加入预制的活菌菌液和热灭活菌液中，进行曝光，获得完全抑制死菌dna扩增而不影响活菌dna扩增的最佳pma浓度和确定最佳曝光时间，包括：将预设浓度的pma溶解在20％的二甲亚砜中，生成储存溶液，并在-40℃下避光保存；基于所述储存溶液，配置若干不同浓度的pma；将配置好的pma加入预制的活菌菌液和热灭活菌液中，在黑暗中进行孵育；通过预设波长的曝光设备进行曝光处理，得到最佳pma浓度；在所述最佳pma浓度下，对热灭活菌液测试不同的曝光时间，确定最佳曝光时间。7.如权利要求6所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，所述活菌菌液的预制方法，包括：获取若干菌株，将所有菌株置于20％(v/v)甘油中，于-80℃环境中进行中保存；预置培养基，将所有菌株置于所述培养基上培养，在37℃下持续摇动(180rpm)培养48h，得到v.vulnificus活菌菌液。8.如权利要求7所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，所述热灭活菌液的预制方法，包括：配置所述v.vulnificus活菌菌液；将所述v.vulnificus活菌菌液在95℃下加热10min，得到所述热灭活菌液。9.如权利要求1所述的基于靶向vvha基因准确检测创伤弧菌的检测方法，其特征在于，在步骤s6中，采用步骤s5得到的pma，处理不同浓度v.vulnificus的血浆模拟临床样本，提取基因组dna，并进行检测，包括：配置不同浓度v.vulnificus的血浆样本，利用血浆样本模拟被v.vulnificus感染的临床样本；采用步骤s5得到的pma，处理所述临床样本；处理完毕，通过dna提取试剂盒提取基因组dna，进行临床样本检测，评估验证vvha基因适用于v.vulnificus的检测性能。

技术总结
本申请公开了一种基于靶向vvhA基因准确检测创伤弧菌的检测方法，联合液滴数字PCR和叠氮溴化丙锭(PMA)处理来对创伤弧菌活菌细胞进行准确、及时、可信的检测方法。并分析了所发明的方法的特异性、敏感性和检测活菌的能力，同时通过检测人工污染的血浆样品评估了其在临床样品中的稳定检测性能；本申请建立了一种基于靶向vvhA基因，联合ddPCR和PMA，用以准确检测V.vulnificus活菌的检测方法，并在人工污染的血浆样品中对其检测能力进行了评估。研究中开发的以vvhA基因为靶向基因并采用PMA-ddPCR对创伤弧菌进行活菌检测的方法为临床诊断和评估弧菌感染的治疗效果提供了可靠的工具，这在弧菌疾病监测中有着非常重要的意义。这在弧菌疾病监测中有着非常重要的意义。这在弧菌疾病监测中有着非常重要的意义。


技术研发人员：张顺 朱鹏 蔡挺 胡玲 刘鹏 傅一栋 张沛瑶
受保护的技术使用者：国科宁波生命与健康产业研究院
技术研发日：2022.06.28
技术公布日：2022/9/13