维生素B6及其制剂在制备预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病的药物中的应用的制作方法

维生素b6及其制剂在制备预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及维生素b6(vb6)在制备用于抗细菌感染的药物体系中的用途，更涉及在制备预防和/或治疗炎性疾病的药物或制剂中的应用。


背景技术：

2.维生素b6(vitamin b6，vb6)，又称吡哆素，常用分子式为c8h
10
no5p，其包括吡哆醇(pyridoxol，c8h
11
no3)、吡哆醛(pyridoxal，c8h9no3)及吡哆胺(pyridoxamine，c8h
12
n2o2)，在体内以磷酸酯的形式存在，包括磷酸吡哆醇(pyridoxol-5’phosphate，pnp)、磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’phosphate，plp)、磷酸吡哆胺(pyridoxamine-5’phosphate，pmp)，是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。
3.维生素b6是一种能从食物中获得的可溶性微量元素，是人体脂肪和糖代谢的必需物质，缺乏维生素b6会引起食欲不振、食物利用率低、失重、呕吐、下痢等表现，严重缺乏会有粉刺、贫血、关节炎、小孩痉挛、忧郁、头痛、掉发、易发炎、学习障碍、衰弱等症状。同时，维生素b6作为一种临床药物用于多种疾病的治疗，包括：动脉硬化、秃头、胆固醇过高、.低血糖症、精神障碍、肌肉失调、神经障碍、怀孕初期的呕吐、手术后呕吐等。随着临床应用的深入研究，维生素b6在抢救异烟肼中毒、治疗贫血、治疗白细胞减少症等方面也表现出了一定的治疗效果。


技术实现要素：

4.目前尚未有针对维生素b6在预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病方面的研究，本技术通过小鼠、线虫等动物模型的研究，发现了维生素b6在预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病尤其在保护机体免受炎症侵入或损伤等方面的作用，能够用于制备预防和/或治疗炎症或炎症相关疾病的药物/制剂中。
5.一方面，本发明提供了维生素b6在制备预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病的药物中的应用，其中，所述维生素b6包括以下至少一种：吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、或者其药物学上可接受的盐或酯；所述盐包括盐酸盐、磷酸盐等等；所述酯包括磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺、吡哆醇二棕榈酸酯中的至少一种。
6.所述感染或炎症相关性疾病为感染性疾病或非感染性疾病所引发的组织炎症性侵入或损伤；所述感染性疾病可以为病毒、衣原体、支原体、细菌或寄生虫引起的感染；所述细菌包括以下至少一种：铜绿假单胞菌、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、志贺氏菌等等相关或相似致病菌。所述非感染性疾病可以为自身免疫性肝炎、关节炎、胰腺炎、肠胃炎、家族性嗜血细胞综合症、全身型幼年特发性关节炎、嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法或红斑狼疮；所述组织炎症性侵入或损伤中的组织包括以下至少一种：血液、肺、肝脏、肾、心脏、胃、肠、脾脏。
7.另一方面，本发明还提供了维生素b6在制备提高抗菌肽表达的药物中的应用，其
中，所述维生素b6包括以下至少一种：吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、或者其药物学上可接受的盐或酯；所述盐包括盐酸盐、磷酸盐等等；所述酯包括磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺、吡哆醇二棕榈酸酯中的至少一种；所述抗菌肽包括以下至少一种：ang4、defa、defa5、bd3、lyz1、pla2g2a、reg3α、reg3β、reg3γ。
8.再一方面，本发明还提供了一种药物组合物在预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病的药物中的应用，其中，所述药物组合物包括维生素b6以及在药学上可接受的载体或辅料；所述维生素b6包括以下至少一种：吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、或者其药物学上可接受的盐或酯；所述盐包括盐酸盐、磷酸盐等等；所述酯包括磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺、吡哆醇二棕榈酸酯中的至少一种。
9.所述药物组合物还可包含有药学上可接受的用于预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病的其他药物或其他相关活性物质。
10.所述感染或炎症相关性疾病为感染性疾病或非感染性疾病所引发的组织炎症性侵入或损伤；所述感染性疾病可以为病毒、衣原体、支原体、细菌或寄生虫引起的感染；所述细菌包括以下至少一种：铜绿假单胞菌、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、志贺氏菌等等相关或相似致病菌。所述非感染性疾病可以为自身免疫性肝炎、关节炎、胰腺炎、肠胃炎、家族性嗜血细胞综合症、全身型幼年特发性关节炎、嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法或红斑狼疮；所述组织炎症性侵入或损伤中的组织包括以下至少一种：血液、肺、肝脏、肾、心脏、胃、肠、脾脏。
11.所述药物组合物的剂型包括口服制剂、注射制剂、经皮给药制剂、粘膜给药制剂、肺部吸入给药制剂或肠道给药制剂；具体的，所述药物组合物的剂型包括：滴剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、膜剂、凝胶剂、散剂、乳剂、自乳化制剂、滴丸剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、贴剂、贴膏剂、溶液剂、软膏剂或乳膏剂。
12.本发明的有益效果在于：
13.本发明研究了vb6在预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病方面的新用途，发现vb6具有预防和/或治疗感染或炎症相关性疾病的作用，尤其具有抗感染、减缓机体组织炎性症状发展并起到预防及保护机体组织免受炎性影响的作用。同时，发明人发现，维生素b6能够提高相关抗菌肽的表达，说明维生素b6可能通过改变抗菌肽来实现抗感染、减缓机体组织的炎性症状。
附图说明
14.图1吡哆醇在线虫感染模型中线虫存活统计图。图1a和图1b分别为两次独立重复实验。其中对照组为线虫加入到含有铜绿假单胞菌pa14菌落及代谢物的培养基中；吡哆醇组为线虫加入到含有吡哆醇和铜绿假单胞菌pa14菌落及代谢物的培养基中。
15.图2吡哆醇在小鼠感染模型中的表型分析图。图2a为小鼠体重变化百分比，图2b为病原菌在小鼠肠道的定植情况，图2c为病原菌在小鼠各个器官和血液中的分布情况，图2d为小鼠结肠长度，图2e为小鼠脾脏大小。其中空白组为灌胃pbs，未经过病原菌感染；对照组为灌胃pbs，给予沙门氏菌感染；吡哆醇组为灌胃吡哆醇，给予沙门氏菌感染。其中*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001均具有显著差异。
16.图3维生素b6在小鼠感染模型中的表型分析图。图3a为小鼠体重变化百分比，图3b
为小鼠存活率统计图，图3c为病原菌在小鼠肠道的定植情况，图3d为病原菌在小鼠各个器官和血液中的分布情况，图3e为小鼠结肠长度，图3f为小鼠脾脏大小。其中空白组为灌胃pbs，未经过病原菌感染；对照组为灌胃pbs，给予沙门氏菌感染；吡哆醇组为灌胃吡哆醇，给予沙门氏菌感染。其中*p《0.05具有显著差异。
17.图4qpcr验证小鼠结肠组织抗菌肽基因表达情况。其中对照组为灌胃pbs，给予沙门氏菌感染；维生素b6组为灌胃维生素b6，给予沙门氏菌感染。其中*p《0.05，**p《0.01均具有显著差异。
18.图5维生素b6对肠炎的保护至关重要。图5a为小鼠体重变化百分比，图5b为病原菌在小鼠肠道的定植情况，图5c小鼠结肠长度，图5d为小鼠结肠长度统计情况，图5e为小鼠脾脏大小，图5f为小鼠脾脏重量统计图。其中空白组为未经过病原菌感染；对照组为灌胃pbs，给予沙门氏菌感染。其中*p《0.05具有显著差异。
具体实施方式
19.下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
20.实施例1吡哆醇在线虫感染模型中具有抗感染作用
21.线虫寄生于动植物，或自由生活于土壤、淡水和海水环境中，绝大多数营自生生活，极少部分寄生于人体并导致疾病。常说的线虫特指秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)，是一种很小的蠕虫，是蛔虫及其他寄生线虫的幼虫，寄生在土壤层中，以模式生物的角色活跃着。秀丽隐杆线虫以细菌为食，包括铜绿假单胞菌，但铜绿假单胞菌对线虫致病并致死。因此，可以使用铜绿假单胞菌喂食秀丽隐杆线虫，观察额外加入吡哆醇的线虫是否有存活率差异。
22.取铜绿假单胞菌pa14(atcc来源)划线，挑单克隆到含有lb培养基(索莱宝，l1010)的试管中，37℃过夜培养。取20μl菌液垂直滴加到6cm ngm培养基(mybiosource，mbs652720-c)平板中心，放置于超净台中吹干，置于37℃培养箱中培养12h，将配置好的1mmol/ml吡哆醇(sigma，p5669-5g)100μl均匀滴加至细菌表面并吹干待用。同步化产卵时期的秀丽隐杆线虫(由中国科学院遗传与发育生物学研究所田烨课题组提供)，收集l4时期的成虫加入到含有铜绿假单胞菌pa14菌落及代谢物的ngm平板中，每12小时统计线虫的存活率，直至线虫全部死亡。如图1所示，结果显示，加入吡哆醇喂养的线虫在不同时期都表现出了更强的抗感染能力和生存能力，说明吡哆醇在线虫感染模型中具有抗感染和延长线虫寿命的作用。
23.实施例2吡哆醇在小鼠感染模型中具有抗感染、减缓肠炎作用
24.提前7天每天使用吡哆醇对小鼠(c57bl/6小鼠，雄性，6-8周，购买于南京集萃药康)进行灌胃，并持续至整个实验结束。鼠伤寒沙门氏菌sl1344(来源于atcc)在链霉素100μg/ml(bbi，a610494-0050)的lb平板中划线，挑取单克隆到含链霉素的lb液体培养基中37℃过夜培养，第二天接菌到空白lb培养基中，37℃培养。当od
600
值为0.5-0.8期间，收取适量菌于pbs洗两次，计算细菌用量并重悬于pbs中备用。灌胃吡哆醇7天后，按照每只小鼠感染总量为1
×
106cfu的细菌数对小鼠进行鼠伤寒沙门氏菌sl1344灌胃，每日监测小鼠体重和感
染状态。
25.小鼠粪便沙门氏菌菌落数：小鼠沙门氏菌菌落数反应了小鼠肠道的感染情况，菌落数越多，说明在小鼠肠道定植的菌落数越多，也说明感染越严重。每日将每只小鼠分别放入无菌盒子中收集小鼠新鲜粪便，按照50mg/ml的比例加入pbs缓冲液(赛维尔，g4207)，加玻璃珠后用组织匀浆机进行研磨，研磨后取适量体积进行梯度稀释到10-2
，10-3
，10-4
。取10μl均匀涂布于链霉素lb平板中，过夜培养后统计cfu数量。
26.结肠长度：结肠长度反应了小鼠肠道受感染情况和肠道炎症情况。感染一星期后牺牲小鼠，取出结肠，对结肠长度进行测量，结肠长度越短表示肠道受感染程度越严重。
27.脾脏大小：脾脏大小反应了小鼠的炎症情况，脾脏越大，说明小鼠炎症越严重。感染一星期后牺牲小鼠，取出脾脏，对小鼠的脾脏进行拍照和称量。
28.器官菌落数cfu：各器官cfu反应了细菌逃避肠道粘膜免疫入侵机体的严重情况。血液cfu由小鼠眼球取血，直接进行梯度稀释后涂板，脾脏、肝、结肠、盲肠等器官在牺牲小鼠后解剖小鼠获得，加入pbs和玻璃珠/钢珠后组织匀浆机进行研磨，取适量进行梯度稀释涂板，计算器官中cfu。
29.如附图2结果显示，灌胃吡哆醇的小鼠相对于对照组表现出了更稳定的体重变化，更小的脾脏，更长的结肠长度，各器官中的cfu数量更少，多方面说明吡哆醇对感染性肠炎、脾炎等起到了很好的保护作用，具有预防效果。
30.实施例3维生素b6在小鼠感染模型中具有抗感染、减缓肠炎作用
31.提前7天每天使用维生素b6注射液(国药集团)对小鼠(c57bl/6小鼠，雄性，6-8周)进行灌胃，并持续至整个实验结束。七天后使用鼠伤寒沙门氏菌sl1344进行感染，感染方法和剂量与实施例2一致，每天统计小鼠的体重及存活情况。如附图3所示，统计结果显示，灌胃维生素b6效果与灌胃吡哆醇一致，灌胃维生素b6的小鼠表现出了更稳定的体重变化，更小的脾脏，更长的结肠长度，各器官中的cfu数量更少，多方面说明维生素b6对感染性肠炎、脾炎等起到了很好的保护作用，具有预防效果。
32.造模结束后牺牲小鼠，取小鼠结肠组织，抽提rna，对其抗菌肽进行qpcr检测。如附图4结果显示，维生素b6组小鼠回肠的抗菌肽ang4和defa等都发生了明显改变。血管生成素4(ang4)是一种新型的抗菌肽，主要在哺乳动物的肠道组织表达，具有抗菌和促血管生成等功能，在机体对病原体的免疫过程和血管生成过程中发挥着重要的作用。defa是防御素的总称，一类内源性抗微生物肽，也是其自身防御体系的重要组成部分，defa5是防御素家族中的一种防御素α5，在抵抗病原菌感染中发挥重要作用。小鼠结肠中的抗菌肽上升，说明维生素b6可能通过改变抗菌肽来抗感染。
33.具体方法如下：
34.1.取1cm的结肠片段，加入含有钢珠的trizol中转移至1.5ml ep管中，按照1ml trizol加入0.2ml三氯甲烷(1/5trizol量的三氯甲烷)，然后剧烈震荡15s，室温放置5min。4℃12000g离心15min，将200μl左右上清转移到新的rnase free的ep管内，加入等量的异丙醇沉淀；充分混匀溶液，4℃放置10min沉淀rna(如果rna量多，不需放置10min)；4℃12000g离心15-30min，弃掉上清，加入1ml的75％乙醇(depc水配制)洗涤rna沉淀，4℃7500g离心3min；干燥rna。小心弃掉离心后的上清，再短时间离心5s，将管壁上的液体收集到管底，用rnase free枪头吸除，打开离心管管盖干燥rna 15min(小心rnase污染)，等rna沉淀变透明
后，加入适量的depc水，充分溶解，混匀后离心，-80℃长期保存。
35.2.反转录(rna-逆转录)：
36.使用反转录试剂盒(诺唯赞，r323)去除基因组gdna，按照如下成分配制反应混合液(4μl体系)：
[0037][0038][0039]
42℃2min/37℃5min
[0040]
4℃∞
[0041]
反转录(5μl体系)
[0042]
上一步的反应液(去除基因组步骤)4μl5x rt enzyme mix1μl
[0043]
反转录的程序：
[0044]
37℃15min
[0045]
85℃5s
[0046]
4℃5min
[0047]
用ddh2o 10倍稀释cdna产物，短期4℃储存，长期-20℃储存。
[0048]
3.rt-pcr(实时pcr)：
[0049]
以上述步骤提取的cdna为模板进行实时荧光定量pcr检测。在8联管中配制如下成分：
[0050][0051]
短暂离心混匀，放入定量pcr仪，设置程序，用两步法进行扩增。程序为：预变性60秒，95℃。45个反应循环：95℃，10秒；60℃，30秒。每个循环延伸结束采集荧光。使用2-δδct
分析方法处理数据。
[0052]
4.引物列表
[0053][0054][0055]
实施例4维生素b6缺乏会加重小鼠的感染炎症
[0056]
为了验证维生素b6对肠炎的重要性，我们构建了维生素b6缺陷/正常/添加模型。我们订购了吡哆醇缺陷的食物，构建成了维生素b6缺陷组沙门氏菌感染、正常食物对照组沙门氏菌感染、维生素b6沙门氏菌感染、正常食物不感染四组进行实验，沙门氏菌感染的同时喂食不同食物。如图5所示，在沙门感染后，维生素b6缺陷组小鼠体重下降最快，正常食物对照组次之，维生素b6添加组体重下降最缓慢。从小鼠肠道沙门氏菌的定植情况分析，维生素b6的添加可以降低沙门氏菌在肠道的定植。结肠长度也显示，维生素b6添加组肠道炎症最轻。综上所述，维生素b6对感染性肠炎的保护至关重要，添加维生素b6能够抵抗小鼠肠炎，具有治疗作用。
[0057]
应当说明的是，本发明的上述所述之技术内容仅为使本领域技术人员能够获知本发明技术实质而进行的解释与阐明，故所述之技术内容并非用以限制本发明的实质保护范围。本发明的实质保护范围应以权利要求书所述之为准。本领域技术人员应当知晓，凡基于本发明的实质精神所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应在本发明的实质保护范围之内。