一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法

技术特征：
1.一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、样本处理；包括s11.使用皂苷对样本宿主基因进行去除；s12.批量提取dna；s2、构建多样本pcr扩增dna测序文库；s3、对dna测序文库中的dna测序；使用minion纳米孔测序仪进行dna测序，实时进行数据收集；s4、对收集的数据进行筛选和分析；s5、对处理的样本进行病原体基因拼接；s6、对拼接成功的细菌进行耐药性检测。2.根据权利要求1所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s11中，所述使用皂苷对样本宿主基因进行去除的过程包括以下子步骤：s111、用250μl无菌pbs缓冲液将临床下呼吸道样本沉淀重悬，充分吹打混匀；s112、加入200μl 5％无菌皂苷溶液使用无菌无酶去离子水溶解，涡旋15s混匀，室温静置10min，以使皂苷溶液和样本充分混合，皂苷可使宿主细胞膨胀破裂；s113、加入350μl无菌无酶去离子水，室温静置30s；s114、加入12μl 5m nacl溶液，上下颠倒混匀，以终止皂苷的膨胀作用；s115、8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；s116、沉淀使用100μl无菌pbs缓冲液重悬，加入100μl hl-san缓冲液，涡旋15s混匀，加入10μl hl-san酶，颠倒混匀，消化游离核酸；s117、37℃水浴，高速震荡15min；s118、8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；s119、加入800μl无菌pbs缓冲液，颠倒混匀，8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；s1110、加入1000μl无菌pbs缓冲液，颠倒混匀，8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液。3.根据权利要求2所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s116步骤中，所述hl-san缓冲液的配置过程为：将0.2g mgcl
2-6h2o溶于5m nacl中，定容至10ml后使用0.22μm过滤器过滤得到。4.根据权利要求3所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s12中，使用bscc45s1e试剂盒和自动dna提取仪进行dna提取。5.根据权利要求4所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s12中，dna提取过程包括以下子步骤：s121、bscc45s1e试剂盒所带溶菌酶全部溶于tet缓冲液中，震荡混匀；s122、180μl混合液重悬沉淀，震荡混匀后37℃孵育30min；s123、向试剂盒第1、7列加入20μl蛋白酶k和含菌重悬液；s124、试剂盒放入机器中，设定程序：s125、待提取完成后使用nanodrop进行dna浓度和纯度鉴定，使用qubit进行浓度精准定量。6.根据权利要求1所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s2中，使用快速条码试剂盒sqk-rbk004进行多样本快速dna测序文库构建，所有操作均于超净台中进行，所有仪器紫外照射至少30min；所有试剂置于冰上融化，使用前
离心处理，吹打混匀。7.根据权利要求6所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s3中，dna测序过程中，使用芯片引发试剂盒exp-flp002进行芯片引发，所有操作于超净台中进行，所用除芯片外的其他仪器紫外照射30min；使用flo-min106d r9.4芯片和minion测序仪进行测序。8.根据权利要求7所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s3中，dna测序过程具体包括以下子步骤：s31、将flo-min106d r9.4芯片插入minion测序仪中，连接笔记本电脑，使用minknow软件flowcell test模块进行芯片检测，新芯片纳米孔道数大于800为合格芯片；s32、断开测序仪与电脑的连接，测序仪拿入超净台中上样；s33、向一支试剂flb中加入30μl试剂flt，吹打混匀；s34、打开引发孔，吸出孔中空气；s35、加入800μl flb flt混合试剂，关闭引发孔，室温静置5min；s36、打开引发孔和上样孔，向引发孔中加入200μl flb flt混合试剂，向上样孔中悬空滴加75μl文库；s37、测序仪连接笔记本电脑，使用minknow软件进行测序。9.根据权利要求8所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述s37中，根据使用试剂盒进行程序设定，实时进行数据分析，待出现临床致病菌序列后继续测序1-2h，若无其他致病菌序列出现，则停止测序，断开电脑与测序仪的连接。10.根据权利要求1至9所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，所述s4步骤中的对收集的数据进行筛选和分析包括：对收集的数据进行筛选和分析的过程包括：先进行碱基判读，碱基判读后进行数据过滤，数据过滤后进行数据质控，并进行宿主基因对比去除，然后进行分类分析。

技术总结
本发明公开了一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，属于呼吸道抽吸物样本处理技术领域，解决了现有呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道抽吸物样本处理时间长达24-48h，样本处理效率低下的技术问题。该样本处理方法包括：S1、样本处理；包括S11.使用皂苷对样本宿主基因进行去除；S12.批量提取DNA；S2、构建多样本PCR扩增DNA测序文库；S3、对DNA测序文库中的DNA测序；使用MinION纳米孔测序仪进行DNA测序，实时进行数据收集；S4、对收集的数据进行筛选和分析；S5、对处理的样本进行病原体基因拼接；S6、对拼接成功的细菌进行耐药性检测。本发明可针对呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道抽吸物样本进行快速处理，将样本处理用时从常规24～48h缩短到6h以内。常规24～48h缩短到6h以内。常规24～48h缩短到6h以内。


技术研发人员：吴楠 沈宁 贺蓓 杨萍
受保护的技术使用者：北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）
技术研发日：2022.06.17
技术公布日：2022/9/13