胆固醇修饰的酸敏感PEG化磁性脂质纳米颗粒及其制备方法与应用与流程

胆固醇修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医学纳米技术领域，具体涉及胆固醇修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒及其制备方法与应用。


背景技术：

2.在诸多磁性纳米材料中，主要成分含钴、镍、铁的磁性纳米材料是目前研究的热点。但在生物医学领域，钴和镍的生物毒性限制了其应用范围，而磁性铁氧体纳米颗粒由于其良好的生物相容性，在医学诊疗方面发挥了重要的作用。磁性铁氧体纳米颗粒已经被广泛应用于磁共振成像(mri)为基础的多模态成像、磁感应热疗(tmh)、药物靶向递送、生物传感器、细胞标记与分离等领域。调控铁氧体磁性纳米颗粒的磁学性能通常采用在颗粒中掺杂金属离子的方法来实现。掺杂锌的铁氧体(zn
x
fe
1-x
)fe2o4磁性纳米颗粒(mnps)与传统的fe3o4纳米颗粒相比具有更好的磁感应升温能力、更强的磁性及更高的磁共振弛豫率，因此在磁共振成像(mri)及磁感应热疗(tmh)等生物医学领域应用方面具有更大的潜力。
3.磁共振成像(mri)因其能够对生物体内进行高分辨率、非侵入性检测，是目前最具优势的肿瘤早期诊断技术。超顺磁的铁氧体纳米颗粒是临床常用的mri造影剂，其进入体内后，通过肿瘤组织增强的高通透性和滞留(epr)效应或材料表面配体与细胞表面受体特异性结合，实现对肿瘤的靶向积累。施加交变磁场，超顺磁的铁氧体纳米颗粒在交变磁场下被磁化，产生非均匀性的局部磁场，与周围生物溶液中的水分子中氢质子发生偶极作用，水分子发生自旋相位弥散，缩短了组织的t2弛豫时间，因此铁氧体纳米颗粒在t2/t2*成像中所在的区域信号降低，图像呈暗场，与周围环境的磁共振信号差异增大，从而实现正常组织与病变组织的成像差异检测。
4.活体光学成像可实时、连续进行活体检测，且无辐射损伤，是良好的医学诊断手段，包括生物发光成像及荧光成像两种技术。目前生物发光成像主要用于小动物基础研究，因其需要利用病毒载体将荧光素酶报告基因转导入细胞，操作繁琐，临床应用受限。荧光成像即采用荧光染料或荧光材料进行标记后活体成像，操作简便，应用范围较广。荧光在近红外光(发射波长为650～1000nm)范围内被水、血红蛋白等吸收最少，光散射和自发荧光最弱，在体内穿透深度高，因此可用于活体深部组织成像。随着吲哚菁绿(icg)等近红外荧光成像材料获得美国fda批准临床使用，且相关设备的开发利用，使近红外荧光成像技术成为肿瘤早期诊断临床应用的热门，以纳米颗粒为载体的近红外荧光还具有光热转换效应、类似金属和无机半导体的光学特性，引起医疗界广泛关注。
5.磁感应热疗(tmh)的概念于1957年由gilchrist等人首次提出，该技术融合了生物技术、新材料、生理学、病理学等多种学科，在几十年的发展中，一直向临床应用目标靠近，tmh的原理是：磁性铁氧体纳米颗粒在外加交变磁场作用下，磁自旋弛豫，产生热效应，造成局部温度升高，导致肿瘤细胞内细胞膜、核膜、线粒体膜、溶酶体膜等结构的破坏，使肿瘤细胞死亡，进而控制肿瘤的扩增。目前基于磁性纳米颗粒水溶液瘤内注射的磁感应热疗已经
进入临床应用，但是基于静脉注射并靶向肿瘤的磁感应热疗还需要克服瘤内磁性纳米颗粒累积量不足的问题。
6.磁性铁氧体纳米颗粒具有较大的比表面积及表面能，因此易被氧化，易被强酸强碱腐蚀，自身磁偶相互作用极易造成团聚，且负载率低，极大限制了其应用范围。为了增加其稳定性，并赋予其特定功能，通常在磁性纳米颗粒表面进行修饰，其基本原理是利用表面活性剂与纳米颗粒发生化学或物理作用，来改变纳米颗粒表面的化学结构或带电性质。为延长磁性纳米颗粒在血液中的循环时间，增加肿瘤富集效率，通常需要最大程度降低调理作用，实现这一目的最常用的方法便是在纳米颗粒表面修饰聚乙二醇(peg)，然而peg受修饰程度的影响通常呈现“刷状”及“蘑菇状”两种构象，不同的构象对调理素的吸附有着不同的作用。当表面修饰密度较小时，颗粒表面peg分子间距较大，peg链自身卷曲，发生“刷状”形态向“蘑菇状”形态过渡的构象变化，这时peg分子可激活补体，诱导吞噬细胞清除；当表面修饰密度逐渐增大时，颗粒表面的peg分子间距变小，peg链之间的空间位阻效应阻碍了peg的“刷状-蘑菇状”构象变化，这时所修饰的peg分子链依然会保持“刷状”状态，可有效屏蔽调理素蛋白的结合，避免纳米颗粒被网状内皮系统清除；但当表面修饰密度进一步增大至一定程度时，由于peg具有表面活性剂性质，反而会裂解脂质层。因此，对dspe-peg修饰程度的调控是制备稳定性优异的磁性纳米颗粒的首要前提。
7.磁性脂质体是一种新型的药物靶向系统，即磁性纳米颗粒被磷脂双层包围，当其进入体内后，在外界磁场的诱导下可在体内定向移动实现药物靶向富集。脂质体的特性与功能类似细胞膜，无毒、无免疫原型，在一定程度上能降低纳米颗粒的毒性，增加其生物相容性，使其同时具有脂质体被动靶向和磁靶向给药的优点，极大提高了其在生物医药领域的应用范围。按照功能划分，新型磁性脂质体主要分为长循环磁性脂质体、温敏性磁性脂质体、ph敏感性磁性脂质体等。
8.长循环磁性脂质体通常采用含有亲水性链段peg分子的磷脂包覆纳米颗粒，未被修饰的纳米颗粒进入人体后很快便会被血液中调理素蛋白吸附，进而被免疫系统中吞噬细胞清除，无法到达病变部位实现医学应用。利用磷脂peg进行表面修饰可有效延长纳米颗粒在血液中的循环时间，原因如下：第一，peg在纳米颗粒表面形成的亲水层所产生的空间位阻可有效抑制调理素蛋白吸附；第二，磷脂peg改变了纳米颗粒的表面弹性，柔性表面在一定程度上能抑制细胞膜弯曲，使细胞吞噬困难。
9.生理状态下，人体正常组织ph值约7.2～7.4之间，而肿瘤组织ph值约为6.5～6.9之间，利用肿瘤组织微环境存在酸化的特点，可设计ph敏感性磁性脂质体。ph敏感性元素包括对ph敏感的化学键，以及对ph敏感的静电作用，其中常见的酸敏性化学键主要有腙键、苯亚胺键、咪唑环、缩醛键、硼酸键等。ph敏感性磁性脂质体的设计原理是当酸敏性化学键暴露于肿瘤微酸环境时发生断裂，亲疏水作用失衡引起外层胶束破裂，疏水药物得以释放。


技术实现要素：

10.发明目的：针对上述情况，以及目前肿瘤磁感应热疗研究中面临的磁介质肝脾截留、肿瘤部位富集量不足、磁介质易从肿瘤部位泄露等问题，本发明通过加入卵磷脂调控纳米颗粒表面peg的位阻对纳米材料的稳定性的影响，提高了纳米颗粒的亲水性与血液循环时间。同时利用peg化磷脂末端的氨基与peg(mpeg2000-cho)末端醛基结合形成酸敏键，一
方面该结构使得疏水的胆固醇基团被亲水的peg分子覆盖，进一步增加了纳米颗粒整体的亲水性和稳定性，提高了体内长循环时间；另一方面，酸敏健可以在纳米颗粒循环到肿瘤组织时，在微酸性的肿瘤微环境中断裂，暴露出其中的胆固醇基团，该基团与细胞有较强的亲和力，可使磁性纳米颗粒锚定在细胞膜上，使材料在肿瘤组织中高浓度富集并且长时间滞留以保证长期治疗效果。
11.本发明所要解决的技术问题是提供了一种胆固醇修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒及其制备方法。
12.本发明还要解决的技术问题是提供了一种偶联icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒及其制备方法。
13.本发明最后要解决的技术问题是提供了胆固醇修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒或所述的偶联icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒在制备磁共振造影剂和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
14.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胆固醇(cls)修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒，所述纳米颗粒以磁性锌铁氧体纳米颗粒为内部磁核，以功能性胆固醇-peg化磷脂分子(dspe-peg-cls)、氨基-peg化磷脂分子(dspe-peg-nh2)蛋黄卵磷脂e80及席夫碱酸敏键修饰的peg为外壳。
15.其中，所述磁性锌铁氧体纳米颗粒粒径为10～34nm，fe与zn原子所占比例分别为31.94％与1.69％，磁性纳米颗粒的形貌为球形，且尺寸较为均一，对应mnps@cls纳米颗粒水动力尺寸在27～46nm之间，表面电位为16.44
±
0.72mv。
16.其中，所述dspe-peg-cls、dspe-peg-nh2中peg的分子量为2000～5000，所述dspe-peg-cls、dspe-peg-nh2质量比为15∶0～15∶3。
17.其中，作为优选，所述的胆固醇修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于此制备方法中所用dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls的分子量为2000或者5000，质量比分别为15∶0～15∶3；所用的e80投料量为0～17mg；所述的油酸(oa)与油胺(oam)的总体积为4ml，油酸体积为3～4ml，油胺体积为0～1ml。
18.本发明内容还包括一种偶联icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒，所述偶联icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒将所述的纳米颗粒与icg荧光染料偶联即得。
19.本发明内容还包括所述的胆固醇修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
20.1)制备油酸修饰的锌铁氧体磁性纳米颗粒即mnps@oa：在三颈烧瓶中加入乙酰丙酮铁、乙酰丙酮锌、二苄醚、油酸和油胺，在恒定氮气2～10mpa气压下，设置程序控温装置以2.5～3.5℃/min的加热速率从25℃升温至100℃，达到100℃后打开瓶塞；待温度达到210～220℃时维持45～90min，此时反应溶液由红棕色变为光亮的黑色；继续以相同的加热速率升温，并维持30～60min使纳米颗粒充分熟化，整个反应过程始终保持冷凝回流状态；反应结束后，移去加热装置，溶液自然冷却至室温后倒入烧杯中，加入无水乙醇，放于磁铁上静置，待产物沉淀后磁分离，重复上述洗涤3～5次，以去除溶液中残留的油酸、油胺；加入适量三氯甲烷，超声溶解后保存待用；
21.2)制备混合磷脂修饰的锌铁氧体磁性纳米颗粒mnps@cls：称取dspe-peg-nh2、
dspe-peg-cls、e80，加入去离子水使其充分溶解；加入mnps@oa 1ml，调控e80的浓度为0～17mg/ml；将混合溶液置于超声波细胞破碎仪中，直至得到澄清透亮的溶液，将所得溶液过滤膜以去除聚集体，采用磁分离柱进行磁分离处理以去除磷脂空泡，重复几次即可获得纯化的磁性纳米颗粒水溶液；3)制备酸敏性peg修饰的磁性脂质纳米颗粒即mnps@cls@sb：用naoh调节mnps@cls水溶液ph至7～8，在mnps@cls水溶液中加入适量醛基末端的peg溶液，机械搅拌过夜，搅拌速率3000～3500rpm，将获得的溶液超滤去除游离分子后即可获得纯化的酸敏性磁性脂质纳米颗粒；
22.本发明内容还包括一种偶联icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括所述的步骤1)～3)，还包括步骤4)制备偶联了icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒：称取icg粉末，分散于去离子水中，并充分超声溶解，制成icg水溶液，将其与mnps@cls@sb溶液充分混合后，置于摇床中孵育、震荡，于截留分子量12000～100000d的透析袋中透析过夜，去除游离的icg分子即得。
23.其中，步骤1)中乙酰丙酮铁2mmol、乙酰丙酮锌0.4mmol、二苄醚20ml、油酸3ml～4ml和油胺0ml～1ml；
24.其中，步骤2)dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls的浓度比例为15∶0～15∶3、e80的终浓度为0～17mg/ml；
25.其中，步骤2)中，利用e80(卵磷脂)成功调控表面peg的分布与空间位阻，增加了纳米颗粒的稳定性与体内长循环时间。作为优选地，dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls与e80的质量比例为15∶3∶11。
26.其中，步骤3)超滤转速4000～5000rpm，时间为15～20min。
27.其中，步骤4)铁浓度1～2mg/ml的mnps@cls@sb溶液与0～1mg/ml的icg水溶液的体积比为1∶1。
28.本发明内容还包括所述的胆固醇修饰的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒或所述的偶联icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒在制备磁共振造影剂和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
29.其中，所述磁共振造影剂和/或治疗肿瘤的药物用于肿瘤的精准诊断、定位和/或杀死肿瘤细胞。
30.本发明的应用机理：本发明的锌铁氧体磁性核心具有超顺磁性可用作磁共振造影剂，磷脂层中负载的icg荧光染料可作为荧光成像探针，可结合荧光成像和磁共振成像，实现肿瘤的精准诊断与定位；当酸敏性磁性脂质纳米颗粒通过epr(增强的渗透与滞留)效应进入肿瘤酸性微环境时，酸敏键断裂，胆固醇分子暴露并锚定在肿瘤细胞膜上，从而增加材料在肿瘤组织中的累积及滞留时间。富集于肿瘤组织的磁性纳米材料在交变磁场作用下感应发热，使局部肿瘤区域温度快速升至42℃以上，并保持一段时间，即可达到杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长的目的。
31.有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
32.1、本发明利用胆固醇修饰的peg化磷脂末端的胆固醇基团与醛基末端的peg(mpeg2000-cho)的醛基结合形成的酸敏键，一方面该结构使得疏水的胆固醇基团被亲水的peg分子覆盖，增加了纳米颗粒整体的亲水性和稳定性，提高了体内长循环时间；另一方面，当酸敏性磁性脂质纳米颗粒通过epr(增强的渗透与滞留)效应进入肿瘤酸性微环境时，酸
敏键断裂，胆固醇分子暴露并锚定在肿瘤细胞膜上，从而增加材料在肿瘤组织中的累积及滞留时间。
33.2、本发明通过加入卵磷脂调控纳米颗粒表面peg位阻对纳米材料的稳定性进行了优化，并且经过大量实验后，确定了胆固醇修饰的peg化磷脂(dspe-peg-cls)、氨基修饰的peg化磷脂(dspe-peg-nh2)、蛋黄卵磷脂(e80)三种物质的组分比例，制备出稳定性最好的的单分散水溶性纳米颗粒。
34.3、本发明制备的锌铁氧体纳米核心具有具有良好的单分散性、稳定性、超顺磁性、升温性能及批间一致性。
35.4、本制备方法通过结合结合超顺磁性的锌铁氧体纳米核心和icg荧光染料，可实现mri和荧光成像的双模态成像诊断，以及磁感应热疗，为实现临床诊疗一体化提供了重要前提。
附图说明
36.图1为本发明包覆荧光纳米探针的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒的制备过程示意图。
37.图2为不同尺寸mnps@oa纳米颗粒的透射电镜图及其所对应的粒径分布统计结果，图2a对应粒径为10nm；图2b对应粒径为13nm；图2c对应粒径为16nm；图2d对应粒径为20nm；图2e对应粒径为34nm。
38.图3a和图3b为13nm的mnps@oa的透射电镜图，(图3a标尺为20nm，图3b标尺为5nm)，图3c为电子衍射图。
39.图4为mnps@oa纳米颗粒在sem下的edc-mapping视图，图4a为氧元素，图4b为铁元素，图4c为锌元素，图4d为总图谱。
40.图5为超声破碎法制备的mnps@cls@nh2纳米颗粒tem图，标尺为100nm。图5a为不同比例时的粒径统计图，图5b为15∶3时的电镜图，图5c为15∶2时的粒径统计图。
41.图6为dspe-peg5000-cls、dspe-peg5000-nh2、e80原料及mnps@cls的红外图谱。
42.图7a为peg分子量5000，图7b为peg分子量2000不同e80添加量的纳米颗粒分别在h2o、pbs溶剂中的稳定时间；peg5000与peg2000在相同e80添加量修饰的纳米颗粒分别在h2o(图7c)、pbs(图7d)溶剂中的稳定时间。
43.图8a为不同浓度纳米颗粒水溶液相应的t2加权mri图(1.7t)；图8b为纳米颗粒在常温(300k)下的磁滞回线；图8c为不同浓度纳米颗粒水溶液升温能力对比。
44.图9为mnps@cls@nh2及mnps@cls@sb的红外图谱。
45.图10a为纳米颗粒在pbs中水动力尺寸变化；图10b为ph改变前后dls的变化；图10c为ph改变前后zeta电位的变化。
46.图11为不同种类及浓度的磁性脂质纳米颗粒对4t1细胞的细胞毒性试验。
47.图12a为三组纳米材料别经尾静脉注射前后在小鼠肿瘤部位的t2及t2*-mr图像；12b为三组小鼠肿瘤相应的基于mri的tbr信号。
48.图13为mnps@sb、mnps@cls与mnps@cls@sb组分别相应统计的肿瘤区域ci值变化曲线。
49.图14为不同组实验小鼠在14天内的体重变化统计图，图14a为以及热疗期间各组
的肿瘤增长情况的统计图，图14b中数据以平均值
±
se表示(n＝5，***p＜0.001)；图14c为不同实验组小鼠在磁感应热疗期间的肿瘤体积变化情况图；(d)不同实验组小鼠生存率曲线(n＝6)。
50.图15为空白组、mncs@sb组、mncs@cls组与mncs@cls@sb组小鼠的肝、脾、肿瘤离体组织伊红/核固红和普鲁士蓝染色图。
具体实施方式
51.本发明采用高温热解法制备了形貌规则、粒径均一，且具有良好的结晶度、升温能力与磁学性能的锌铁氧体纳米颗粒；再使用超声细胞破碎仪在尺寸为13nm的单分散锌铁氧体纳米颗粒表面修饰氨基端peg化磷脂(dspe-peg-nh2)、偶联胆固醇peg化磷脂(dspe-peg-cls)、e80，获得稳定的mnps纳米颗粒水溶液；然后加入醛基端peg(mpeg2000-cho)溶液，利用席夫碱键制备酸敏性磁性脂质纳米颗粒即mnps@cls@sb；最后在磷脂分子层中包覆吲哚菁绿(icg)作为荧光纳米探针。
52.本发明的纳米颗粒和荧光纳米探针的制备方法包括以下步骤：
53.(1)制备油酸(oa)修饰的锌铁氧体磁性纳米颗粒(mnps@oa)：在50ml三颈烧瓶中加入2mmol的乙酰丙酮铁，0.4mmol的乙酰丙酮锌，20ml二苄醚及油酸(oa)3ml～4ml，油胺0ml～1ml。在恒定氮气2～10mpa气压下，设置程序控温装置以2.5～3.5℃/min的加热速率从25℃升温至100℃，达到100℃后打开瓶塞；待温度达到220℃时维持45～90min，此时反应溶液由红棕色变为光亮的黑色；继续以相同的加热速率升温至纳米颗粒的生长温度290℃，并维持30～60min使纳米颗粒充分熟化，整个反应过程始终保持冷凝回流状态；反应结束后，移去加热装置，溶液自然冷却至室温后倒入烧杯中，加入无水乙醇，放于磁铁上静置，待产物沉淀后磁分离，重复上述洗涤3～5次，以去除溶液中残留的油酸、油胺；加入适量三氯甲烷，超声溶解后保存待用，铁浓度为3mg/ml；
54.(2)制备混合磷脂修饰的锌铁氧体磁性纳米颗粒即mnps@cls：称取适量dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls、e80(卵磷脂)，加入适量去离子水使其充分溶解；加入纳米尺寸的油相锌铁氧体磁性纳米颗粒1ml，最终反应体系中dspe-peg-nh2的浓度为15mg/ml、dspe-peg5000-cls的浓度为3mg/ml，调控e80的浓度分别为0、1、3、5、7、9、11、13、15、17mg/ml；将混合溶液置于超声波细胞破碎仪中，调节功率为20％，超声2s停3s，直至得到澄清透亮的溶液。将所得溶液过220nm滤膜以去除聚集体，采用磁分离柱进行磁分离处理以去除磷脂空泡，重复几次即可获得纯化的磁性纳米颗粒水溶液，将获得的磁性纳米颗粒水溶液于4℃冰箱中保存待用，铁浓度为3mg/ml；
55.(3)制备酸敏性peg修饰的磁性脂质纳米颗粒即mnps@cls@sb：用naoh调节mnps@cls水溶液ph至7～8，在1ml的mnps@cls水溶液中加入适量醛基末端的peg(mpeg2000-cho)溶液，在37℃条件下机械搅拌过夜，搅拌速率3000～3500rpm。将获得的溶液超滤(超滤管规格10000d，转速4000rpm，时间条件15～20min)去除游离分子后即可获得纯化的酸敏性磁性脂质纳米颗粒，铁浓度为2mg/ml；
56.(4)制备偶联了icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒：称取10mg icg粉末，分散于10ml去离子水中，并充分超声溶解，制成1mg/ml的icg水溶液。将其与10ml的mnps@cls@sb溶液充分混合后，置于37
°
摇床中孵育8～16h，震荡速度为500次/分钟，于截留
分子量12000d的透析袋中透析过夜，去除游离的icg分子，样品避光保存。
57.此制备方法中所用dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls的分子量为2000或者5000，质量比分别为15∶0～15∶3；所用的e80投料量为0～17mg；所述的油酸(oa)与油胺(oam)的总体积为4ml，油酸体积为3～4ml，油胺体积为0～1ml。
58.其中，所述的锌铁氧体磁性纳米颗粒的粒径为10～34nm，fe与zn原子所占比例分别为31.94％与1.69％，磁性纳米颗粒的形貌为球形，且尺寸较为均一，对应mnps@cls纳米颗粒水动力尺寸在27～46nm之间，表面电位为16.44
±
0.72mv。
59.当酸敏性磁性脂质纳米颗粒通过epr(增强的渗透与滞留)效应进入肿瘤酸性微环境时，酸敏键断裂，胆固醇分子暴露并锚定在肿瘤细胞膜上，从而增加材料在肿瘤组织中的累积及滞留时间。利用e80(卵磷脂)成功调控表面peg的分布与空间位阻，增加了纳米颗粒的稳定性与体内长循环时间。一个优化的dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls与e80的质量比例为15∶3∶11。锌铁氧体磁性核心具有超顺磁性可用作磁共振造影剂，磷脂层中负载的icg荧光染料可作为荧光成像探针，可结合荧光成像和磁共振成像，实现肿瘤的精准诊断与定位。富集于肿瘤组织的磁性纳米材料在交变磁场作用下感应发热，使局部肿瘤区域温度快速升至42℃以上，并保持一段时间，即可达到杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长的目的。
60.下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出，以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
61.实施例1：油相锌铁氧体磁性纳米颗粒即mnps@oa的制备和理化性质表征
62.50ml三颈烧瓶中加入2mmol的乙酰丙酮铁，0.4mmol的乙酰丙酮锌，20ml二苄醚及油酸(oa)3ml～4ml，油胺(oam)0ml～1ml。在恒定氮气2～10mpa气压下及冷凝回流的条件下，设置程序控温装置以3.3℃/min的加热速率从25℃升温至100℃，达到100℃后打开瓶塞；待温度达到220℃(成核温度)时维持1h，此时反应溶液由红棕色变为光亮的黑色；继续以3.3℃/min的加热速率升温至纳米颗粒的生长温度290℃，并维持1h使纳米颗粒充分熟化；反应结束后，移去加热装置，溶液自然冷却至室温后倒入250ml烧杯，加入无水乙醇，放于磁铁上静置，待产物沉淀后磁分离，重复上述洗涤直至上清液澄清透明，以去除溶液中残留的油酸、油胺；加入适量三氯甲烷，超声溶解后保存待用。
63.磁性纳米颗粒的尺寸、形貌、组成通过扫描电子显微镜(sem)、透射电子显微镜(tem)及其配置的能谱(eds)进行表征；磁性颗粒晶体结构通过高倍透镜(hrtem)进行表征；磁性纳米颗粒磁性通过振动样品磁强计(vsm)在常温(300k)下进行表征，并得到饱和磁化强度。
64.实验发现，合成原料中oa/oam的不同体积投料比对调控磁性锌铁氧体纳米颗粒的尺寸起到关键作用。控制oa/oam的比例分别为3.3ml：0.7ml、3.2ml；0.8ml、3.1ml；0.9ml、3.0ml；1ml、2.0ml：2ml，分别制备得到了尺寸为10nm、13nm、16nm、20nm、34nm的mnps纳米颗粒。从图2的tem照片可以看出，在五种不同的油酸/油胺的摩尔比条件下制备获得的油溶性纳米颗粒尺寸大小相对均一，形貌规则，具有良好的单一分散性，纳米颗粒尺寸随表面活性剂油胺的比例增加而增大。经统计，在高温热解法中，合成获得的球形纳米颗粒的产率大于88％。
65.图3显示的尺寸为13nm的mnps@oa纳米颗粒的透射电镜(tem)、高倍透射电镜(hrtem)、电子衍射(saed)示意图，可以看出，磁性纳米颗粒的形貌为球形，且尺寸较为均
一。saed图显示纳米颗粒具有明显的电子衍射光环，说明纳米颗粒具有良好的晶型，视野中出现的较为明显的两种晶格间距分别为0.29nm和0.42nm。
66.为进一步确认合成的纳米颗粒为锌铁氧体纳米颗粒，对合成获得的磁性颗粒进行了sem及原位edc-mapping图下的元素分布进行表征。从图4b和图4c中可以看出，fe在扫描电镜下呈现绿色光点，zn则呈现黄色光点，证明zn、fe元素确实已经掺杂在制备的材料中，即合成的产物确定为锌铁氧体纳米颗粒。实施例2混合磷脂修饰的锌铁氧体磁性纳米颗粒即mnps@cls的制备和理化性能的评价
67.称取并配置终浓度分别为15mg/ml的dspe-peg-nh2(上海拓旸生物科技有限公司，)、3mg/ml的dspe-peg-cls(上海拓旸生物科技有限公司)、0-17mg/ml的e80(卵磷脂)的混合溶液，其中dspe-peg-nh2与dspe-peg-cls的peg分子量同为2000或5000，调控e80的浓度分别为0、1、3、5、7、9、11、13、15、17mg/ml；之后加入1ml尺寸为13nm的实施例1制备的铁浓度3mg/ml的mnps@oa纳米颗粒混合均匀，将混合溶液置于超声波细胞破碎仪中，调节功率为20％，超声2s停3s，直至得到澄清透亮的溶液。将所得溶液过220nm滤膜以去除聚集体，采用磁分离柱进行磁分离处理以去除磷脂空泡，重复几次即可获得纯化的磁性纳米颗粒水溶液，将获得的磁性纳米颗粒水溶液于4℃冰箱中保存待用。
68.采用超声破碎法制备水溶性纳米颗粒，dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls的质量比分别为15∶3和15∶2时，油相的mnps@oa纳米颗粒经过表面dspe-peg-nh2、dspe-peg-cls修饰后，获得了均匀分散在水溶液中的单包覆mnps@cls。将纳米颗粒经2％的磷钨酸负染后，利用tem进行观察，从图5中可以看出，颗粒表面有一层白圈，即为表面修饰的磷脂层，说明磷脂peg成功修饰在了纳米颗粒表面，并通过ftir光谱进行了进一步验证(图6)，在mnps@cls的红外图谱中存在cls的特征吸收峰：1170.7cm-1(γ
c-o
)、1467.6em-1(δ
ch
)、1348.7cm-1(δ
ch
)；伯胺特征吸收峰：3344.86cm-1(γ
n-h
)；卵磷脂特征吸收峰：1170.7cm-1(γ
p-o
)，说明胆固醇、氨基、卵磷脂成功接枝到了颗粒表面。
69.通过粒度分析仪测量纳米水溶液的水动力尺寸，随着尺寸的增大，水动力尺寸随之增大，尺寸为10nm、13nm、16nm、20nm、34nm的纳米颗粒的的水动力分别对应为27nm、31nm、36nm、39nm、45nm。
70.高稳定性是磁性纳米颗粒实现体内长循环，高效富集于肿瘤部位，提高肿瘤治疗效果的首要前提。本文通过添加不同量的e80来调控纳米颗粒表面peg的空间位阻，并对其水动力尺寸及溶液状态进行长期监测。由图7a、b结果可知，当e80投料量为11mg时，peg5000组及peg2000组的纳米颗粒在纯水及pbs溶液中均具有更高的稳定性，这是因为e80的掺入有效调控了peg的空间位阻；进一步通过纵向比较发现，peg5000组的纳米水溶液明显比peg2000组的具有更优异的稳定性，由此可知，长链peg的修饰可使纳米颗粒具有更高的稳定性。
71.利用临床1.7t磁共振成像仪对不同铁含量的纳米水溶液进行t2＊成像，如图8a所示，随着铁浓度的增加，t2＊图像灰度逐渐变暗，呈现出出显著的阴性造影剂的效果。制备的mnps@cls@nh2纳米颗粒将应用于生物医学领域，为了更加真实地反映其在应用中的磁学性能，采用vsm对mnps@cls的磁学性能进行了表征。如图8b所示，在室温下-20000g～20000g范围内，矫顽力和剩磁近似等于0，说明mnps@cls具有良好的超顺磁性且饱和磁化强度达到了73emu/g。对mnps@cls进行磁感应升温实验，设置交变磁场参数为480khz，8a，纳米颗粒溶
液铁浓度分别设置为2mg/ml；1mg/ml；0.5mg/ml，如图8c所示，浓度为2mg/ml的纳米颗粒在700s内可升至88℃，说明该纳米材料具有优异的升温性能，为后续体内磁感应热疗提供了基础。
72.实施例3酸敏性peg修饰的磁性脂质纳米颗粒即mnps@cls@sb的制备
73.用naoh将磁性纳米颗粒水溶液调至ph7～8，在1ml的上述溶液中加入适量醛基末端的peg(mpeg2000-cho)溶液，在37℃条件下机械搅拌过夜，搅拌速率3000～3500rpm。将获得的溶液超滤(超滤管规格10000d，转速4000rmp，时间为15～20min)去除游离分子后即可获得纯化的酸敏性磁性脂质纳米颗粒。
74.利用氨基与醛基的缩合反应在颗粒表面构建席夫碱键构建了表面同时修饰胆固醇和酸敏键的磁性纳米颗粒(mnps@cls@sb)。ftir光谱图(图9)显示存在席夫碱键特征吸收峰：1645cm-1(γ
c＝n
)，2950cm-1(γ
ch
)，此外3350.81cm-1(γ
n-h
)特征吸收峰的消失，也是席夫碱键形成的有力证据。
75.通过对颗粒的水动力尺寸监测来评价mnps@cls@sb纳米颗粒在去离子水溶液(ph＝7.4)中的稳定性，如图10a所示，该纳米颗粒在中性溶液中保存5天时仍表现出良好的稳定性，且未观察到明显的形态变化。改变溶液ph为弱酸性(ph＝5.5)，如图10b所示，水动力尺寸迅速增大，这是由于在酸性条件下席夫碱键断裂，导致纳米材料的稳定性降低，且ph改变前后zeta电位变化明显(图10c)，进一步证明了颗粒表面酸敏键的成功修饰。
76.实施例4偶联icg荧光染料的酸敏感peg化磁性脂质纳米颗粒的制备
77.称取10mg吲哚菁绿icg(上海阿拉丁试剂有限公司，cas号：3599-32-4)粉末，分散于10ml去离子水中，并充分超声溶解，制成1mg/ml的icg水溶液。将其与10ml的铁浓度为2mg/ml的mnps@cls@sb溶液充分混合后置于37℃摇床中孵育12h，震荡速率为500次/分钟，并于截留分子量12000d的透析袋中透析过夜，去除游离的icg分子，样品避光保存。
78.实施例5磁性锌铁氧体脂质纳米颗粒(包括mnps@cls、mnps@sb及mnps@cls@sb)体外细胞毒性实验
79.在体外通过cell counting kit-8(cck8)实验评估合成的磁性锌铁氧体脂质纳米颗粒(包括mnps@cls、mnps@sb及mnps@cls@sb)在不同浓度下对4t1细胞的活性影响，以此验证材料的细胞毒性。cck8法检测的原理是：cck8可被细胞中的线粒体脱氢酶还原为水溶性橙黄色甲臜，其颜色与活细胞数量成正比，通过测定其吸光度，可定量活细胞。具体操作如下：取对数生长期细胞，在96孔板中以每孔1
×
105的数量进行铺板，放置于37℃，5％co2培养箱中培养24h，加入已灭菌的不同浓度(0μg fe/ml、40μg fe/ml、80μg fe/ml、120μg fe/ml、160μg fe/ml)的mnps@cls、mnps@sb及mnps@cls@sb样品，每组设置3个平行对照并设置空白组。将材料与细胞孵育24h后，移去培养基，依次加入10μl cck-8试剂，避光孵育1h。设置酶标仪检测吸光值为450nm，依次检测od值，计算细胞生存率。
80.结果如图11显示，这三种纳米材料对细胞的毒性较小，且呈浓度依赖性，即随着材料浓度的增加，细胞存活率呈阶梯式下降，当浓度达到100μg fe/ml时，三组细胞的存活率可达85％以上，说明这三种材料具有良好的生物相容性，可应用于生物体内研究。表面修饰了peg的纳米颗粒对细胞的毒性较小一方面是因为锌铁氧体纳米颗粒本身毒性较小，另一方面是因为表面修饰的peg磷脂层一定程度上能降低纳米颗粒的毒性，增加其生物相容性。
81.实施例6磁性锌铁氧体脂质纳米颗粒体外抗吞噬实验
82.peg分子在磁性锌铁氧体纳米颗粒表面形成空间屏障，可有效避免被血液中调理素蛋白吸附，进而避免被免疫系统中吞噬细胞清除，可在体内实现长循环。为验证复合纳米颗粒的体外细胞抗吞噬能力，将材料与单核巨噬细胞raw264.7(中国科学院细胞库，中国上海)共孵育后检测细胞荧光信号。具体操作如下：在12孔板中接种raw264.7细胞，放置于37℃，5％co2培养箱中培养24h，将浓度为45μg/ml的mnps@cls、mnps@sb、mnps@cls@sb三种纳米材料与raw264.7细胞孵育，并以mnps@dmsa作为阳性对照组，孵育12h后，移去培养液，用磷酸盐缓冲溶液(pbs 0.01m，ph7.4)洗3次，用4％的多聚甲醛进行固定，30min后用pbs洗涤细胞，加入普鲁士蓝染液对细胞内纳米颗粒进行染色，30min后用pbs冲洗多余普鲁士蓝，加入核固红染液对细胞核进行染色，20min后用pbs冲洗多余染液，将细胞置于光学显微镜下观察记录。
83.经普鲁士蓝染色和核固红染色后，在mnps@cls@sb与mnps@sb作用组的细胞内几乎未见蓝色斑点；同时相同浓度的mnps@cls作用组的细胞内有少量蓝色斑点，说明材料被少量吞噬，而mnps@dmsa作用组却仍被巨噬细胞大量的吞噬，这一现象充分说明了颗粒表面致密的peg层可有效抵御吞噬细胞吞噬。
84.实施例7建立小鼠皮下乳腺瘤模型
85.当4t1细胞培养至对数生长期时，用胰酶消化处理，调整细胞浓度约为106个cell/ml，取250μl注射于balb/c小鼠(雌性，4-6周，体重20g～25g)(约6周龄)右侧胸腺处，饲养1～2周时间，胸部肿瘤体积即可达到60mm3～70mm3。
86.实施例8荷瘤小鼠体内mri成像与体内荧光成像
87.利用小动物磁共振成像设备(7t)对荷瘤小鼠原位肿瘤进行t2-及t2*-mri扫描，扫描时间分别为注射药物前与注射药物后1～5天，共分为4组，并设置对照组与平行组，控制注射药物剂量为25mg fe/kg体重。具体操作如下：利用异氟烷将小鼠进行麻醉，并通过设备检测小鼠呼吸频率，通过调节气麻流速控制小鼠呼吸，保持频率在20～30次/min；将小鼠置于实验床上，通过mr扫描仪进行扫描。具体参数如下：tr＝500.0ms，te＝4.5ms；定位角度＝30
°
；厚层＝1mm；视野(field of view，fov)＝30mm
×
30mm。
88.如图12a所示，t2-和t2*-mr图像显示了单次静脉给药后0h～96h内不同时间段mnps@cls、mnps@sb、mnps@cls@sb纳米材料分别在肿瘤的累积效果，随着纳米材料在肿瘤区域中的积累逐渐增加，在t2-和t2*-mr图像上，mr信号逐渐变暗。药物注射时间达到48h时，mnps@sb、mnps@cls@sb作用组小鼠肿瘤部位信号斑点达到最暗，表明材料在肿瘤部位达到最大累积量，而mnps@cls组肿瘤在24h时达到最暗，这充分说明了排布致密、分子链长的peg外壳可延长纳米颗粒在体内的循环时间。随着时间的增加，肿瘤中的实时mr信号逐渐减弱，这是因为材料肿瘤血管网络的较大空隙中漏出，被肝脏和肾脏代谢出体外。从结果可得知，mnps@cls@sb纳米材料可以作为mri造影剂实现体内长循环。为定量评价三组纳米颗粒的mri成像效果，计算了不同时间点肿瘤组织与初始肿瘤组织基于t2*-mri的背景比值(tbr)(图12b)，tbr值越小，代表着成像效果越好，进一步证实了mnps@cls@sb纳米材料的时间依赖性跟踪，积累和代谢过程。
89.实施例9荷瘤小鼠体内荧光成像
90.将荷瘤小鼠随机分成5组，每组分别设置6个平行对照，并设置生理盐水对照组。设置体内ivis荧光成像系统参数为：激发波长＝710nm，发射波长＝840nm，扫描时间分别为注
射药物前与注射药物后1～5天。将药物通过尾静脉注射入小鼠体内后，分别在不同时间段利用气麻剂异氟烷将小鼠进行麻醉，放置于载物台上进行扫描，及时记录小鼠肿瘤内材料的荧光信号，并比较其与肿瘤周围肌肉组织荧光信号(ci值)大小，对荧光纳米探针的成像效果进行评价。为进一步探究荧光纳米探针在小鼠体内的组织分布情况，在48h时剖出小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，将其置于ivis荧光成像系统中扫描观测各个组织内的荧光信号。
91.随着血液循环时间的延长，肿瘤部位的荧光信号逐渐增加，说明这三种材料在肿瘤部位累积量逐渐增加，mnps@sb与mnps@cls@sb组在48h累积量达到最大，而mnps@cls组在24h时累计量达到最大，与mri结果一致。通过纵向对比可以看出，mnps@cls@sb在相同时间内具有更强的荧光信号，表明其具有更强的肿瘤累积能力。48h之后随着纳米材料在小鼠体内代谢排出，荧光信号逐渐减弱，但三组小鼠肿瘤仍能保持一定强度的荧光信号，说明这三种纳米材料是具有长循环能力的高性能荧光纳米探针。为保证实验的精确性，对肿瘤区域荧光信号进行了定量分析，即ci值，如图13所示，mnps@cls@sb组的小鼠肿瘤区域的ci值在48h时达到最大值，且在96h时ci值仍能达到2.5以上(评价荧光成像意义的标准是肿瘤部位荧光信号值与肿瘤部位周围荧光信号值比值大于2.5)，表明mnps@cls@sb纳米材料可实现体内长循环的荧光成像效果。
92.实施例10荷瘤小鼠体内磁感应热疗策略设计
93.通过尾静脉注射将mnps@cls@sb磁性脂质纳米颗粒水溶液分别注射入小鼠体内，单次注射剂量25mg fe/kg体重，周期为每隔3天一次，共4次注射，16天内对肿瘤热疗效果进行评价，注射频次和热疗次数如图14b所示。在交变磁场(alternating current magnetic field，acmf)发生器中，我们采用碗装线圈覆盖小鼠肿瘤区域，这种设计可以尽可能减少磁热效应对小鼠肝脾等其他正常脏器的损伤。设置交变磁场参数为：频率＝480khz，电流＝20a，每次热疗30min，热疗作用后立即用近红外光热成像仪检测并记录肿瘤表面温度。在治疗周期内，定期记录小鼠体重与肿瘤体积大小。肿瘤体积计算公式为v＝ab2π/6(a为肿瘤长径，b为肿瘤短径)。根据记录的肿瘤体积大小计算出相对肿瘤体积变化，即v/v0(v指测量得出的最终肿瘤体积，v0指初始肿瘤体积)。对小鼠肿瘤体积变化和体重变化绘制折线图。在实验中，我们挑选了约60mm3肿瘤体积的荷瘤小鼠共24只，随机分为4组，每组6只，组1不注射mnps@cls@sb、不施加acmf(空白组)；组2不注射mnps@cls@sb、施加acmf(acmf组)；组3注射mnps@cls@sb、不施加acmf(mnps@cls@sb组)；组4注射mnps@cls@sb、施加acmf(mnps@cls@sb acmf组)。
94.图14a是四组实验小鼠在治疗周期内的体重变化折线图，图14b是四组实验小鼠肿瘤体积在16天治疗周期内与初始体积对比情况，图14c为四组肿瘤体积变化的一些代表性的照片。从图14a中可以看出四组小鼠体重大小在热疗期间没有明显差别，这充分说明了mnps@cls@sb材料具有良好的生物安全性，可应用于生物体内医学研究。从图14b中可以看出，注射了mnps@cls@sb纳米颗粒的小鼠经过多次磁感应热疗后，肿瘤生长得到明显抑制。经过数据统计结果得出，mnps@cls@sb acmf组的肿瘤体积大小仅为初始体积的2倍，相对于对照组具有更好的肿瘤生长抑制能力，说明我们设计的磁性脂质纳米颗粒具有优异的磁感应热疗效果，根据图14c结果可分析得出，mnps@cls@sb纳米颗粒在肿瘤部位酸敏键断裂，暴露胆固醇使得磁性纳米颗粒在肿瘤内的滞留时间延长从而使材料富集量增加，具有长期抑
瘤效应。通过统计实验小鼠生存率(图14d)发现，在mnps@cls@sb介导的磁感应热疗组的小鼠存活率显著提高，存活时间延长到超过41天，而其他组的小鼠存活时间不超过35天。
95.实施例11荷瘤小鼠离体组织切片材料吞噬研究
96.将结束实验的荷瘤小鼠立即处死解剖，获得心、肝、脾、肺、肾、肿瘤离体组织。通过mri与荧光成像结果，已经证明了mnps@cls@sb磁性纳米颗粒不仅可以有效富集于肿瘤部位，且能降低代谢器官的吞噬能力，我们进一步通过肝、脾、肿瘤的离体组织切片进行伊红-核固红-普鲁士蓝染色来检测纳米材料在主要代谢器官及肿瘤部位的分布情况(如图15所示)，结果发现注射了mnps@cls@sb磁性纳米颗粒组的小鼠肿瘤部位相比于mnps@sb与mnps@cls出现更多蓝色斑点，说明mnps@cls@sb的肿瘤富集能力显著大于两外两组，结果与成像结果一致。