双特异性因子VIII模拟抗体的制作方法

双特异性因子viii模拟抗体
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3.背景
4.在凝血病患者中，诸如在患有a型和b型血友病的人中，凝血级联的各个步骤由于例如功能性凝血因子的缺乏或存在不足而成为功能障碍的。凝血级联的一部分的这种功能障碍导致不充分的血液凝固以及潜在危及生命的出血，或对内部器官如关节的损伤。
5.凝血因子viii(fviii)缺乏症，常被称为a型血友病，是影响全世界约420,000人的先天性出血性病症，其中约有105,000人目前得到诊断。
6.a型血友病患者可以接受凝血因子替代疗法，如外源性fviii。常规治疗由替代疗法组成，其作为出血发作的预防或按需治疗而提供。直到最近，对严重a型血友病患者的预防性治疗包括最多每周三次静脉内注射血浆来源的fviii或重组fviii或其长效变体。
7.然而，这类患者具有生成针对此类外源因子的中和抗体(所谓的抑制物)的风险，从而使得先前有效的疗法变得无效。具有抑制物的a型血友病患者是部分先天性、部分获得性的凝血病的非限制性实例。已经生成fviii抑制物的患者不能用常规替代疗法治疗。外源性凝血因子只可以静脉内施用，这对于患者是相当不便和不适的。
8.由fviii活性降低或缺乏引起的fxa形成不足和凝血酶生成减少是a型血友病患者的出血素质的根本原因。
9.fx向其酶活性形式fxa的蛋白水解转化可以通过包含fixa及其辅因子激活的fviii(fviiia)的内在fx激活复合物来实现。辅因子结合使fixa的酶活性增加约五个数量级，并且据信通过scheiflinger等人(2008)j thromb haemost，6：315-322所概述的多种机制发生。值得注意的是，已发现fviiia使fixa的构象得到稳定，fixa具有增加的对fx的蛋白水解活性(kolkman ja，mertens k(2000)biochemistry，39：7398-7405，t，brandstetter h(2009)biol chem，390：391-400)。基于这一观察结果并意识到抗体是能够模拟多种蛋白质-蛋白质相互作用的通用结合蛋白质，scheiflinger等人对激动性抗fix(a)抗体进行了筛选，这些抗体的特征在于在磷脂表面和钙的存在下，但是在不存在天然辅因子fviiia的情况下，增强fixa对fx的激活的能力，并且从对5280个杂交瘤上清液的筛选中发现有88个产生表现出不同程度的fixa激动活性的抗体，参见ep1220923 b1和ep1660536 b1。最近，一种新药emicizumab也被称为ace910，已被批准用于皮下预防性治疗具有或不具有针对常规替代疗法因子的抑制物的a型血友病。emicizumab是由chugai pharmaceuticals/roche pharmaceuticals开发的用于治疗a型血友病的人源化双特异性抗fix(a)/抗fx(a)单克隆抗体。emicizumab被设计为模拟fviii辅因子功能(参见sampei等人：(2013)plos one，8，e57479和wo2012/067176)。推测每毫升血浆采用30-50μg emicizumab的治疗对应于每分升血浆至少10至15iu的等效因子viii活性(shima等人，n engl j med 2016；374：2044-53)。然而，一些患者已经产生了针对emicizumab的抑制物(抗药物抗体)，从而使采用该化合物的治疗无效。
10.除了以emicizumab为例生成抑制物外，其他抗体性质对于针对患者实现有效的基于抗体的治疗也至关重要。特别是，已经证明了具有高非特异性结合倾向的抗体如何可能导致临床安全性问题。在一些报道中，高水平的非特异性结合导致抗体的循环半衰期缩短数倍，并导致针对患者的给药方案无效且繁琐(参见dobson等人，nature，volume 6，art.no.：38644(2016)和avery等人，mabs 2018，vol.10，no.2，244-255)。
11.wo2018/141863和wo2019/065795还公开了抗fix(a)抗fx(a)双特异性抗体及其作为促凝剂用于治疗血友病的用途。
12.血友病群体中，特别是在患有凝血病的受试者中，仍存在许多尚未得到满足的医疗需求。本发明涉及能够替代fviii并因此可用于治疗凝血病如a型血友病的改进的化合物。


技术实现要素：

13.本发明涉及化合物，其在患有凝血病的患者，特别是缺乏功能性fviii的患者，如a型血友病患者，包括具有抑制物的a型血友病患者中，充当凝血因子viii(fviii)的替代物。
14.本发明的一个方面涉及能够增强fxa的生成并因此使缺乏功能性fviii的患者部分或完全恢复凝血的化合物。
15.在一个方面，所述化合物是抗体或其抗原结合片段。在一个这样的方面，所述化合物是多特异性抗体或其抗原结合片段，如双特异性抗体或其抗原结合片段。
16.在一个具体方面，本发明涉及在缺乏功能性fviii的患者如a型血友病患者中充当fviii的替代物的抗体或其抗原结合片段。
17.在一个这样的方面，所述抗体或其抗原结合片段能够结合fix(a)并增加fixa对fx的酶活性，任选地还能够结合fx。
18.在一个方面，本发明涉及能够结合fix(a)和fx(a)的抗体或其抗原结合片段，包括双特异性抗体或其抗原结合片段，其增加fixa对fx的酶活性。
19.在一个方面，本发明涉及能够结合fix(a)和fx(a)的抗体或其抗原结合片段，其与本领域公开的抗体相比具有改善的性质。在一个这样的方面，与包括emicizumab在内的本领域的双特异性抗体相比，所述抗体或其抗原结合片段具有改善的促凝血性质和/或降低的非特异性结合例如dna和/或胰岛素的倾向，和/或降低的自缔合倾向。
20.本发明的另一方面涉及作为双特异性抗体的一部分的单独组分(中间体)抗体或其抗原结合片段，如特定的抗fix(a)抗体或其抗原结合片段或特定的抗fx(a)抗体或其抗原结合片段。
21.本发明的另一方面涉及本文公开的抗体或其抗原结合片段，其用于预防和/或治疗凝血病、伴随凝血病的疾病或由凝血病引起的疾病。在一个方面，该凝血病是血友病，如具有或不具有抑制物的a型血友病。
22.本发明的又一方面涉及包含本文公开的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其被配制用于递送所述抗体以供预防和/或治疗凝血病，如具有或不具有抑制物的a型血友病，以及具有其内容物的注射装置。
23.本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含(i)本文公开的抗体或其抗原结合片段，如双特异性抗体，和(ii)使用说明书。
24.本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图说明
25.图1a-d显示了代表本文公开的抗fix(a)(图1a和图1b)和抗fx(a)(图1c和图1d)igg抗体的重链和轻链可变域的序列的比对。cdr1、2和3序列在最上方的序列中以粗体和下划线突出显示，并且代表相应的图中的其余序列。
26.序列简述
27.seq id no：1-8和17-88代表本文所述的抗fix(a)和抗fx(a)单克隆抗体(mab)的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)和互补决定区(cdr)的序列。
28.seq id no：89代表人凝血因子ix的氨基酸序列。
29.seq id no：90代表人凝血因子x的氨基酸序列。
30.seq id no：91代表具有s228p和c末端赖氨酸截短的人igg4重链恒定区。
31.seq id no：92代表具有s228p、f405l、r409k和c末端赖氨酸截短的人igg4重链恒定区。
32.seq id no：93代表人κ轻链恒定区。
33.seq id no：94代表具有f405l和c末端赖氨酸截短的人igg1重链恒定区。
34.seq id no：95代表具有k409r和c末端赖氨酸截短的人igg1重链恒定区。
35.seq id no：9-16被有意省略。
36.实施例6中的表格将seq id no关联至本发明的单独(组分)抗fix(a)和抗fx(a)抗体以及双特异性抗体。
37.描述
38.在患有凝血病的受试者中，诸如在患有a型血友病的人中，由于功能性fviii的缺乏或存在不足，凝血级联出现功能障碍。凝血级联的一部分的这种功能障碍导致不充分的血液凝固以及潜在危及生命的出血，或对内部器官如关节的损伤。本发明涉及化合物，其在患有凝血病的患者，特别是缺乏功能性fviii的患者，如a型血友病患者，包括具有抑制物的a型血友病患者中，充当凝血因子viii(fviii)的替代物。在一个方面，这样的化合物是抗体。
39.特别是，本发明的发明人惊奇地鉴定了具有高效力和功效的模拟fviii辅因子活性的抗体。在一个具体方面，本发明涉及在缺乏功能性fviii的患者如a型血友病患者中充当fviii的替代物的抗体。在一个这样的方面，所述抗体结合并增加凝血因子ixa(fixa)对凝血因子x(fx)的酶活性，任选地还结合fx。在一个这样的方面，本发明的抗体是能够与fix/fixa和fx结合的双特异性抗体。
40.本发明的另一方面涉及作为多特异性抗体的一部分的单独组分(中间体)抗体或其抗原结合片段，如特定的抗fix(a)抗体或其抗原结合片段或特定的抗fx(a)抗体或其抗原结合片段。
41.本发明的另一方面涉及如本文公开的抗体或其抗原结合片段及其组分(中间体)的制备。
42.本发明的另一方面涉及与本文公开的抗体或其抗原结合片段竞争结合fix(a)和/或fx(a)的抗体。
43.本发明的另一方面涉及与本文公开的抗体或其抗原结合片段共有fix(a)和/或fx(a)上的表位的抗体或其抗原结合片段。
44.在一个方面，所述抗体是人或人源化抗体，如人或人源化双特异性抗体。
45.本发明的另一方面涉及本文公开的抗体或其抗原结合片段，其用于预防和/或治疗凝血病、伴随凝血病的疾病或由凝血病引起的疾病。在一个方面，该凝血病是具有或不具有抑制物的a型血友病。
46.本发明的又一方面涉及包含本文公开的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其被配制用于递送所述抗体以供预防和/或治疗凝血病，如具有或不具有抑制物的a型血友病，以及具有其内容物的注射装置。
47.本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含(i)本文公开的抗体或其抗原结合片段，如双特异性抗体，和(ii)使用说明书。
48.凝血因子ix
49.凝血因子ix(fix)是与因子vii、凝血酶原、因子x和蛋白c具有结构相似性的维生素k依赖性凝血因子。fix在血浆中作为单链酶原(seq id no：89)循环。循环酶原形式由分为四个不同结构域的415个氨基酸组成，这四个结构域包括n末端富含γ-羧基谷氨酸(gla)的结构域、两个egf结构域和c末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。通过在arg145和arg180处的有限蛋白水解来释放激活肽(seq id no：89的残基146至180)，发生fix的激活。因此，活化的fix(fixa)由seq id no：89的残基1-145(轻链)和seq id no：89的残基181-415(重链)组成。
50.因此，循环fix分子包含fix酶原和活化形式的fix，它们在本文中通常被称为fix和fixa，参考seq id no：1。
51.活化的因子ix被称为因子ixa或fixa。术语“fix(seq id no：1)和/或其活化形式(fixa)”也可被称为“fix/fixa”，或简称为“fix(a)”。
52.fixa是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其通过在凝血过程中产生支持形成适当凝血酶所必需的大多数因子xa作为tenase复合物的一部分而在止血中发挥关键作用。
53.fix在本文中用seq id no：1表示，seq id no：1对应于人fix的ala148等位基因形式(anson等人.embo j.19843：1053-1060；mcgraw等人，proc natl acad sci usa.198582：2847-2851；graham等人.am.j.hum.genet.1988 42：573-580)。在本发明中，fix旨在涵盖fix的所有天然变体，如t148变体(uniprot id p00740)。
54.凝血因子x
55.fx是与因子vii、凝血酶原、fix和蛋白c具有结构相似性的维生素k依赖性凝血因子。fx在血浆中作为双链酶原循环，其包含seq id no：2的残基1-139(轻链)和seq id no：2的残基143-448(重链)。人fx酶原包含四个不同的结构域包括n-末端富含γ-羧基谷氨酸(gla)的结构域(残基1-45)、两个egf结构域：分别为egf1(残基46-82)和egf2(残基85-125)，以及c-末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域(残基195-448)。通过arg194处的有限蛋白水解——这导致激活肽(残基143-194)的释放，发生fx的激活。因此，活化的fx(fxa)由seq id no：2的残基1-139(轻链)和seq id no：2的残基195-448(活化的重链)组成。因此，循环因子x分子包含fx酶原和活化形式的fx，它们在本文中分别被称为fx和fxa，参考seq id no：2。在本发明中，fx旨在涵盖fx的所有天然变体。术语“fx(seq id no：90)和/或其活
化形式(fxa)”也可称为“fx/fxa”或“fx(a)”。
56.抗体
57.本文中的术语“抗体”是指自免疫球蛋白序列衍生的蛋白质，其能够与抗原或其一部分结合。术语抗体包括但不限于任何类别(或同种型)的全长抗体，即iga、igd、ige、igg、igm和/或igy。术语抗体包括但不限于二价的抗体，如双特异性抗体。
58.天然的全长抗体包含至少四条多肽链：通过二硫键连接的两条重链(hc)和两条轻链(lc)。在一些情况下，天然抗体包含少于四条链，如在软骨鱼类(chondrichthyes)中发现的ignar的情况。药学上特别感兴趣的一类免疫球蛋白是igg。在人类中，根据其重链恒定区的序列，igg类别可被分为4个亚类：igg1、igg2、igg3和igg4。根据其序列组成的差异，轻链可被分为两种类型：κ链和λ链。igg分子由两条通过两个或更多个二硫键相互连接的重链和两条各自通过二硫键连接至重链的轻链组成。igg重链可包含一个重链可变域(vh)和最多三个重链恒定(ch)域：ch1、ch2和ch3。轻链可包含轻链可变域(v
l
)和轻链恒定域(c
l
)。vh和v
l
区可进一步细分为被称为互补决定区(cdr)或高变区(hvr)的高变性区域，其中散布有被称为框架区(fr)的更加保守的区域。vh和v
l
域通常由三个cdr和四个fr组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。含有高变区(cdr)的重链和轻链可变域构成能够与抗原相互作用的结构，而抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括但不限于免疫系统的各种细胞(效应细胞)、fc受体和经典补体系统的c1复合物的第一组分，c1q。
59.本发明的抗体可以是单克隆抗体(mab)，这是从它们代表由单个b细胞或由b细胞的克隆群体表达的一组独特的重链和轻链可变域序列这个意义来讲的。本发明的抗体可采用本领域技术人员已知的各种方法来生产并纯化。例如，抗体可从杂交瘤细胞产生。抗体可通过b细胞扩充来产生。抗体或其片段可以在哺乳动物或微生物表达系统中或通过体外翻译来重组表达。抗体或其片段还可通过例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示或核糖体或mrna展示而重组表达为细胞表面结合的分子。
60.本发明的抗体可以是分离的。术语“分离的抗体”是指已经从其产生环境中的其他组分中分离和/或回收的抗体，和/或已经从在其产生环境中存在的组分的混合物中纯化的抗体。
61.抗体的某些抗原结合片段在本发明的情况下可能是合适的，因为已经证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合片段”是指一个或多个保留如本文所述的特异性结合或识别抗原如fix/fixa、fx/fxa或另一种靶分子的能力的抗体片段。抗原结合片段的实例包括(但不限于)fab、fab
′
、fab2、fab
′2、fv(一般为抗体单臂的v
l
和vh域的组合)、单链fv(scfv)；参见例如bird等人，science 1988 242：423-426；和huston等人，pnas 198885：5879-5883)、dsfv、fd(一般为vh和ch1域)；包含单个vh和单个v
l
域两者的单价分子；微体(minibodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和κ体(kappa bodies)(参见例如ill等人(1997)protein eng 10：949-57)；以及一个或多个分离的cdr或功能互补位，其中分离的cdr或抗原结合残基或多肽可以缔合或连接在一起，以形成功能性抗体片段。这些抗体片段可采用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式针对应用性筛选这些片段。
62.抗体的“fab片段”，包括“fab”和“fab’2”片段，可通过分别在连接抗体重链的铰链
半胱氨酸残基的n末端或c末端侧上的铰链区中切割重链而由抗体得到。“fab”片段包括轻链的可变域和恒定域以及重链的可变域和ch1域。“fab'
2”片段包含一对通常通过其铰链半胱氨酸共价连接的“fab”片段。fab
′
通过切割fab
’2中连接重链的铰链二硫键而在形式上衍生自fab
’2片段。除了抗体片段的二硫键连接以外的其他化学偶联也是本领域已知的。fab片段保留了亲本抗体与其抗原结合的能力，潜在地具有更低的亲和力。fab
’2片段能够二价结合，而fab和fab’片段仅能够单价结合。通常，fab片段缺乏恒定ch2和ch3域，即在其中将发生与fc受体和c1q的相互作用的fc部分。因此，fab片段通常缺乏效应子功能。fab片段可以通过本领域已知的方法通过抗体的酶切而产生，例如使用木瓜蛋白酶以获得fab或使用胃蛋白酶以获得fab
’2，包括fab、fab
′
、fab
’2在内的fab片段可以使用本领域技术人员公知的技术重组产生。
[0063]“fv”(片段可变)片段是含有完全抗原识别和结合位点的抗体片段，且通常包含缔合(其在性质上可以是共价的)的一个重链可变域和一个轻链可变域，例如在单链可变域片段(scfv)中。以这种构型，每个可变域的三个高变区相互作用，以在v
h-v
l
二聚体的表面上限定出抗原结合位点。这六个高变区或其亚组共同地对抗体赋予抗原结合特异性。
[0064]“单链fv”或“scfv”抗体包含抗体的vh和v
l
域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，fv多肽进一步在vh和v
l
域之间包含多肽连接体，该连接体使得scfv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，参见pluckthun，1994，in：the pharmacology of monoclonal antibodies，vol.113，rosenburg and moore eds.springer-verlag，new york，pp.269-315。
[0065]“单链fab”或“scfab”抗体包含抗体的vh、ch1、v
l
和c
l
域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，fab多肽还在vh和c
l
或v
l
和ch1域之间包含多肽连接体，该连接体使得scfab能够形成用于抗原结合的所需结构(koerber等人(2015)j mol biol.427：576-86)。
[0066]
术语“双抗体(diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含在同一多肽链(vh和v
l
)中连接至轻链可变域(v
l
)的重链可变域(vh)。通过使用由于过短而无法允许在同一条链上的两个可变域之间配对的连接体，使得这些可变域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。
[0067]
表述“线性抗体”是指如在zapata等人(1995)protein eng.8：1057-1062中描述的抗体。简言之，这些抗体含有一对串联的fd区段(v
h-ch1-v
h-ch1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
[0068]
可采用常规的重组或蛋白质工程技术获得抗体片段，并且可以以与完整抗体相同的方式，针对与fix及其活化形式fx的结合或另一种功能筛选这些片段。
[0069]
本发明的抗体片段可通过截短，例如通过从多肽的n末端和/或c末端去除一个或多个氨基酸来制备。也可以通过一个或多个内部缺失来生成片段。
[0070]
本发明的抗体可以是或者可包含抗体的片段或本文公开的任何抗体的变体。本发明的抗体可以是或者可包含这些抗体之一的抗原结合部分或其变体。例如，本发明的抗体可以是这些抗体之一的fab片段或其变体，或者其可以是衍生自这些抗体之一的单链抗体或其变体。而且，本发明的抗体可以是全长抗体及其片段的组合。
[0071]
如本文所用的术语“单特异性”抗体是指能够与一种特定表位结合的抗体(包括但不限于二价抗体)。
[0072]
如本文所用的术语“双特异性”抗体是指能够与两种不同抗原或相同抗原上的两种不同表位结合的抗体。
[0073]
如本文所用的术语“三特异性”抗体是指能够与三种不同抗原或相同抗原上的三种不同表位或两种不同抗原上存在的三种不同表位结合的抗体。
[0074]
如本文所用的术语“多特异性”抗体是指能够与两种或更多种不同抗原或相同抗原上的两种或更多种不同表位结合的抗体。因此，多特异性抗体包括双特异性和三特异性抗体。
[0075]
全长igg形式的双特异性抗体可以通过两个单独的杂交瘤融合以形成杂合四价体瘤而生成，该四价体瘤产生包括双特异性异二聚化抗体的一部分的抗体混合物(chelius d.等人；mabs.2010年5-6月；2(3)：309-319)。或者，双特异性异二聚化抗体可以通过使用重组技术产生。异二聚化也可以通过改造fc区的二聚化界面以促进异二聚化来实现。其中一个实例是所谓的杵臼(knob-in-hole)突变，其中空间上庞大的侧链(杵)被引入一个fc中，该fc被相对fc上的空间上较小的侧链(臼)匹配，从而产生促进异二聚化的空间互补性。用于工程构建异二聚化fc界面的其他方法是静电互补、与非igg异二聚化结构域融合或利用人igg4的自然fab-臂交换现象来控制异二聚化。异二聚化的双特异性抗体的实例在文献中有充分描述，例如(klein c等人；mabs.2012年11-12月；4(6)：653-663)。必须特别注意异二聚体抗体中的轻链。通过使用共同的轻链可以实现lc与hc的正确配对。再次，lc/hc界面的工程化可用来促进异二聚化或轻链交叉工程化，如crossmabs。在温和还原条件下，在体外从含有适当突变的两个单独igg重装配抗体也可用来产生双特异性抗体(例如，labrijn等人，pnas，110，5145-5150(2013))。还报道了自然fab-臂交换方法以确保正确的轻链配对。
[0076]
基于多特异性抗体的分子也可以重组表达为融合蛋白，该融合蛋白组合了igg的天然模块以形成如文献中描述的多特异性和多价抗体衍生物。融合抗体的实例是dvd-ig、igg-scfv、双抗体、dart等。可以将特异性检测或纯化标签、半衰期延长部分或其他组分并入融合蛋白中。另外的非igg模式也可以并入融合蛋白中。基于fc异二聚化的双特异性全长抗体通常被称为不对称igg，与lc配对方法无关。
[0077]
通常，如brinkmann等人(brinkmann等人.the making of bispecific antibodies.mabs 9，182-212(2017))所综述的，双特异性抗体可以以多种分子形式产生。
[0078]
基于多特异性抗体的分子还可以通过化学缀合或偶联单独的全长igg或偶联igg的片段以形成如文献中描述的多特异性和多价抗体衍生物来产生。实例是化学偶联的fab片段、igg-二聚体等。特异性检测或纯化标签、半衰期延长分子或其他组分可以并入缀合蛋白中。另外的非igg多肽也可以并入融合蛋白中。多特异性分子也可以通过组合重组方法和化学方法来产生，包括上述那些方法。
[0079]
在一个方面，本发明的抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。这样的抗体可以通过使用例如合适的抗体展示或免疫平台或本领域已知的其他合适的平台或方法来产生。如本文所用的，术语“人抗体”旨在包括具有可变域的抗体，在该可变域中，框架区的至少一部分和/或cdr区的至少一部分来源于人种系免疫球蛋白序列。例如，人抗体可具有其中框架区和cdr区均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变域。此外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区或其部分也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞
突变引入的突变)。
[0080]
这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的b细胞，该b细胞从转基因非人类动物例如转基因小鼠获得，具有包含人免疫球蛋白重链和轻链基因区段的所有组成成分的基因组。
[0081]
人抗体可以从基于人种系序列的选择而建立的、用天然和合成序列多样性进一步多样化的序列文库中分离。
[0082]
人抗体可以通过人淋巴细胞的体外免疫及随后用eb病毒转化该淋巴细胞来制备。
[0083]
人抗体可以通过本领域已知的重组方法产生。
[0084]
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，如抗体与另一种物质或抗体的缀合物。
[0085]
如本文所用的，术语“人源化抗体”是指含有来源于非人免疫球蛋白的序列(cdr区或其部分)的人/非人抗体。因此，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中至少来自该接受体的高变区的残基被来自非人类物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的抗体(供体抗体)的高变区的残基所替代，其具有所需的特异性、亲和力、序列组成和功能性。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(fr)残基被相应的非人类残基所替代。这类修饰的一个实例是引入一个或多个所谓的回复突变，该回复突变一般是来源于供体抗体的氨基酸残基。抗体的人源化可采用本领域技术人员已知的重组技术进行(参见，例如，antibody engineering，methods in molecular biology，vol.248，由benny k.lo编著)。对轻链和重链可变域均适合的人类接受体框架可通过例如序列或结构同源性来鉴定。或者，例如，可基于对结构、生物物理学和生物化学性质的了解使用固定的接受体框架。该接受体框架可以是种系衍生的或衍生自成熟的抗体序列。来自供体抗体的cdr区可以通过cdr移植进行转移。可通过确定关键框架位置来进一步在例如亲和力、功能性和生物物理学性质方面优化cdr移植的人源化抗体，在该关键框架位置处再次引入(回复突变)来自供体抗体的氨基酸残基对人源化抗体的性质具有有利影响。除了来源于供体抗体的回复突变外，还可通过在cdr或框架区中引入种系残基、消除免疫原性表位、亲和力成熟等对人源化抗体进行工程化。
[0086]
此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个-一般两个-可变域，其中全部或基本上全部的cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区，并且其中全部或基本上全部的fr残基是人免疫球蛋白序列的fr残基。人源化抗体也可任选地包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(fc)，一般是人免疫球蛋白的相应部分。
[0087]
术语“人源化抗体衍生物”是指人源化抗体的任何修饰形式，如抗体与化学试剂的缀合物或抗体与另一抗体的缀合物。
[0088]
如本文所用的，术语“嵌合抗体”是指包含来源于两个或更多个物种的抗体的部分的抗体。例如，编码这类抗体的基因包括编码源自两个不同物种的可变域的基因和编码源自两个不同物种的恒定域的基因。例如，编码小鼠单克隆抗体可变域的基因可以连接至编码人源抗体恒定域的基因。
[0089]
抗体的片段可结晶区(“fc区”/“fc域”)是包含铰链和恒定ch2和ch3域的抗体c末端区。fc域可与被称为fc受体的细胞表面受体以及补体系统的一些蛋白质相互作用。fc区使
得抗体能够与免疫系统相互作用。在本发明的一个方面，可对抗体进行工程化以在fc区内包含修饰，一般用来改变其一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、fc受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性，或这些性质的缺乏，等等。此外，可对本发明的抗体进行化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分连接至该抗体)或进行修饰以改变其糖基化，从而再次改变该抗体的一种或多种功能性质。igg1抗体可携带修饰的fc域，该fc域包含一个或多个以及可能全部以下突变，这些突变将分别导致对某些fc-γ受体的亲和力降低(l234a、l235e和g237a)以及c1q介导的补体固定减少(a330s和p331s)(残基根据eu索引编号)。或者，可以使用本领域已知的其他氨基酸置换及其组合以及与以上所述修饰的组合，以导致改变的(减少的或增加的)fc-γ受体结合。
[0090]
本发明抗体的同种型可以是igg，如igg1，如igg2，如igg4。如果需要，抗体的类别可通过已知技术进行“转换”。例如，最初作为igm分子产生的抗体可以类别转换为igg抗体。还可利用类别转换技术将一个igg亚类转换成另一个亚类，例如：从igg1转换成igg2或igg4；从igg2转换成igg1或igg4；或从igg4转换成igg1或igg2。还可以进行通过来自不同igg亚类的区域的组合而生成恒定区嵌合分子的抗体工程化。
[0091]
在一个实施方案中，对抗体的铰链区进行修饰，以使得该铰链区中的半胱氨酸残基数目发生改变，例如增加或减少。该方法在例如bodmer等人的第5,677,425号美国专利中进一步描述。
[0092]
可对恒定区进行修饰以使抗体稳定化，例如，降低二价抗体分离成半抗体的风险。例如，在lgg4恒定区中，残基s228(根据eu编号索引，根据kabat为s241)可突变成脯氨酸(p)残基，以使铰链处的重链间二硫键形成得到稳定(参见，例如，angal等人.mol immunol.1993；30：105-8)。
[0093]
抗体或其片段可按照其互补决定区(cdr)来定义。术语“互补决定区”或“高变区”在本文中使用时是指参与抗原结合的氨基酸残基位于其中的抗体区域。高变区或cdr可被鉴定为在抗体可变域的氨基酸比对中具有最高可变性的区域。数据库如kabat数据库可用于cdr鉴定，例如，cdr被定义为包含轻链可变域的氨基酸残基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)以及重链可变域的31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；(kabat等人.1991；sequences of proteins of immunological interest，第五版，u.s.department of health and human services，nih公开号91-3242)。或者，cdr可被定义为来自“高变环”的那些残基(轻链可变域中的残基26-33(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)以及重链可变域中的26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothia和lesk，j.mol.biol.1987；196：901-917)。通常，该区域中氨基酸残基的编号通过kabat等人(同上)描述的方法进行。本文中诸如“kabat位置”、“kabat残基”和“根据kabat”等短语是指用于重链可变域或轻链可变域的这一编号体系。通过使用kabat编号体系，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少的或额外的氨基酸，这对应于可变域的框架(fr)或cdr的缩短或向其中的插入。例如，重链可变域可包含在cdr h2的残基52后的氨基酸插入(根据kabat的残基52a、52b和52c)以及在重链fr残基82后插入的残基(例如，根据kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列的同源性区域与“标准的”kabat编号的序列进行比对，来确定给定抗体的残基的kabat编号。
[0094]
术语“框架区”或“fr”残基是指如本文定义的不在cdr内的那些vh或v
l
氨基酸残基。
[0095]
术语“促凝血抗体”是指例如通过加速血液凝固过程和/或增加一种或多种凝血因
子的酶活性来增强血液凝固的抗体。
[0096]
术语“促凝血活性”是指化合物如抗体例如通过加速血液凝固过程和/或增加一种或多种凝血因子的酶活性来增强血液凝固的能力。
[0097]
包括双特异性、三特异性和多特异性抗体在内的促凝血抗体的活性可以通过本领域已知的方法来确定。标准测定包括全血-凝血酶-生成试验(tgt)、通过血栓弹性描记术(teg)测量凝血时间和fxa生成试验(参见，例如，wo2018/141863)。
[0098]
术语“刺激fixa的酶活性”是指使用实施例9的方法确定的刺激。
[0099]
术语“抗原”(ag)是指用于对免疫活性脊椎动物进行免疫以产生识别该ag的抗体(ab)的分子实体。在本文中，ag的含义更加广泛，并且通常旨在包括被ab特异性识别的靶分子，因此包括在用于产生ab的免疫过程或其他过程例如噬菌体展示中使用的分子片段或模拟物。
[0100]
本发明包括本发明的抗体或其抗原结合片段的变体，其可以在本文公开的各个序列中包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入。
[0101]
在一方面，“置换”变体涉及将一个或多个氨基酸替换为相同数目的氨基酸。置换可以是，但不限于保守置换。例如，氨基酸可以被置换为具有相似生物化学性质的氨基酸，例如，碱性氨基酸可以被置换为另一个碱性氨基酸(例如赖氨酸置换为精氨酸)，酸性氨基酸可以被置换为另一个酸性氨基酸(例如谷氨酸置换为天冬氨酸)，中性氨基酸可以被置换为另一个中性氨基酸(例如苏氨酸置换为丝氨酸)，带电荷的氨基酸可以被置换为另一个带电荷的氨基酸(例如谷氨酸置换为天冬氨酸)，亲水性氨基酸可以被置换为另一个亲水性氨基酸(例如天冬酰胺置换为谷氨酰胺)，疏水性氨基酸可以被置换为另一个疏水性氨基酸(例如丙氨酸置换为缬氨酸)，极性氨基酸可以被置换为另一个极性氨基酸(例如丝氨酸置换为苏氨酸)，芳香族氨基酸可以被置换为另一个芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸置换为色氨酸)，并且脂族氨基酸可以被置换为另一个脂族氨基酸(例如亮氨酸置换为异亮氨酸)。
[0102]
在另一方面，变体包含出现在本发明的抗体或其抗原结合片段的序列中的氨基酸的结构类似物。
[0103]
术语“结合亲和力”在本文中用作两种分子(例如抗体或其片段和抗原)之间的非共价相互作用的强度的度量。术语“结合亲和力”用来描述单价相互作用。
[0104]
通过测定平衡解离常数(kd)，可以对两种分子(例如抗体或其片段和抗原)之间通过单价相互作用的结合亲和力进行定量。通过测量复合物形成和解离的动力学，例如通过表面等离子体共振(spr)法或等温滴定量热(itc)法，可以测定kd。与单价复合物的结合和解离相对应的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或k
结合
)和解离速率常数kd(或k
解离
)。通过方程式kd＝kd/ka，将kd与ka和kd相关联。
[0105]
按照上面的定义，通过比较各个抗体/抗原复合物的kd值，可以比较与不同的分子相互作用有关的结合亲和力，例如比较不同抗体对给定抗原的结合亲和力。
[0106]
可以通过众所周知的方法直接测定解离常数的值。用来评价诸如抗体等配体与靶标的结合能力的标准试验是本领域已知的，并且包括，例如，elisa、western印迹法、ria和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准试验，如spr，也可以评估抗体的结合动力学和结合亲和力。然而，优选地，等温滴定量热法(itc)可用来测量抗体/靶标相互作用的亲和力以及得到该相互作用的热力学参数。
[0107]
可以进行竞争性结合测定，其中将抗体与靶标的结合跟该靶标的另一种配体如另一种抗体对该靶标的结合进行比较。
[0108]
本发明抗体对其靶标的kd可以小于100μm，如小于10μm，如小于9μm，如小于8μm，如小于7μm，如小于6μm，如小于5μm，如小于4μm，如小于3μm，如小于2μm，如小于1μm，如小于0.9μm，如小于0.8μm，如小于0.7μm，如小于0.6μm，如小于0.5μm，如小于0.4μm，如小于0.3μm，如小于0.2μm，如小于0.1μm。
[0109]
在一个这样的实施方案中，所述抗体是包含抗fx臂的双特异性抗体，该抗fx臂对fx的kd小于100μm，如小于10μm，如小于9μm，如小于8μm，如小于7μm，如小于6μm，如小于5μm，如小于4μm，如小于3μm，如小于2μm，如小于1μm，如小于0.9μm，如小于0.8μm，如小于0.7μm，如小于0.6μm，如小于0.5μm，如小于0.4μm，如小于0.3μm，如小于0.2μm，如小于0.1μm，如小于0.09μm，如小于0.08μm，如小于0.07μm，如小于0.06μm，如小于0.05μm，如小于0.04μm，如小于0.03μm，如小于0.02μm，如小于0.01μm，如小于9nm，如小于8nm，如小于7nm，如小于6nm，如小于5nm，如小于4nm，如小于3nm，如小于2nm，如小于1nm，如小于0.5nm。
[0110]
如本文所述的抗体及其抗体片段可以与本领域已知的其他抗体和抗体片段组合，产生双特异性、三特异性或多特异性抗体分子。先前已经使用靶向fix(a)和fx(a)的抗体产生了模拟fviii辅因子功能的化合物，在一些实施方案中，这些抗体可以潜在地各自替代本文所述的fix(a)或fx(a)抗体。由此可见，本发明的靶向fix(a)和fx(a)的抗体，特别是其抗原结合片段，作为单独的组分(中间体)分子、作为包含至少一个fix(a)和/或fx(a)结合域的双特异性、三特异性或多特异性抗体的一部分具有独立的意义。
[0111]
药物制剂
[0112]
在另一方面，本发明提供了包含本发明化合物，如本文所述抗体的组合物和制剂。例如，本发明提供了包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种本发明抗体的药物组合物。
[0113]
相应地，本发明的一个目的在于提供药物制剂，其包含以0.25mg/ml至250mg/ml的浓度存在的这样的抗体，并且其中所述制剂具有2.0至10.0的ph。该制剂可以进一步包含缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂或表面活性剂及其各种组合中的一种或多种。防腐剂、等渗剂、螫合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员公知的。可参考remington：the science and practice of pharmacy，第19版，1995。
[0114]
在一个实施方案中，所述药物制剂是水性制剂。这样的制剂一般是溶液或悬浮液，但也可以包括胶体、分散体、乳液和多相物质。术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w水的制剂。类似地，术语“水溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，而术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
[0115]
在另一个实施方案中，所述药物制剂是冷冻干燥的制剂，在使用前向其中添加溶剂和/或稀释剂。
[0116]
在进一步的方面，所述药物制剂包含这样的抗体的水溶液和缓冲液，其中该抗体以1mg/ml或以上的浓度存在，并且其中所述制剂的ph为约2.0至约10.0。
[0117]
在一个实施方案中，本发明涉及具有所述组合物作为内含物的注射装置。在一些实施方案中，本发明的药物组合物旨在用于和/或包含在注射装置中。在一些实施方案中，该注射装置是类型的一次性、预填充、多剂量笔(供应商novo nordisk a/s，
丹麦)。在一些实施方案中，该注射装置是单发(single shot)装置。
[0118]
在一些实施方案中，该注射装置是固定剂量装置，如被配置为递送多个预定剂量的药物的装置，有时被称为多固定剂量装置或固定剂量、多发装置。
[0119]
在一个实施方案中，使用包括针规为20或更大的管的注射装置施用本发明的药物组合物。
[0120]
在一个实施方案中，使用包括针规为20或更大的管的注射装置施用根据本文表1的双特异性抗体。
[0121]
在一个实施方案中，使用包括针规为20至36的管的注射装置施用根据本文表1的双特异性抗体。在一个这样的实施方案中，该双特异性抗体选自由bimab1a、bimab2a、bimab3a、bimab4a、bimab5a、bimab6a、bimab7a、bimab8a、bimab1b、bimab2b、bimab3b、bimab4b、bimab5b、bimab6b、bimab7b和bimab8b组成的列表。
[0122]
施用和剂量
[0123]
本发明的化合物，如抗体，可以肠胃外施用，如静脉内施用，如肌肉内施用，如皮下施用。或者，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径如经口或局部施用。本发明的抗体可以预防性地施用。本发明的抗体可以治疗性地施用(根据需要)。
[0124]
待递送的化合物的剂量可以是每天约0.01mg至500mg化合物，优选每天约0.1mg至250mg，更优选每天、每周、每两周或每月约0.5mg至约250mg作为负荷和维持剂量，这取决于病况的严重程度。基于该化合物的性质，包括其体内半衰期或平均停留时间及其生物活性，还可以针对特定化合物调整合适的剂量。例如，在一个实施方案中，待递送的化合物可以每周施用一次，或者在另一个实施方案中每隔一周施用一次，或者在另一个实施方案中每月施用一次，并且在所述实施方案的任一个中，以例如0.005、0.0075、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg体重的剂量施用。
[0125]
可以施用含有本文公开的化合物的组合物以用于预防性处置和/或在一些实施方案中用于治疗性处置。在治疗性应用中，将组合物以足以治愈、减轻或部分阻止疾病及其并发症的量施用于已经患有疾病如上述任何出血性病症的受试者。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。如本领域技术人员将会理解的，对于该目的有效的量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。
[0126]
实施方案
[0127]
通过以下实施方案进一步描述本发明：
[0128]
1.能够与根据seq id no：89的因子ix(fix)和/或其活化形式(fixa)结合的抗体或其抗原结合片段。
[0129]
2.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是fab。
[0130]
3.根据实施方案1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
[0131]
由seq id no：25表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：29表示的轻链可变域的cdr序列；或者
[0132]
由seq id no：33表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：37表示的轻链可变
域的cdr序列；或者
[0133]
由seq id no：41表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：45表示的轻链可变域的cdr序列；或者
[0134]
由seq id no：49表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：53表示的轻链可变域的cdr序列；或者
[0135]
由seq id no：57表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：61表示的轻链可变域的cdr序列；或者
[0136]
由seq id no：65表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：69表示的轻链可变域的cdr序列；或者
[0137]
由seq id no：73表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：77表示的轻链可变域的cdr序列；或者
[0138]
由seq id no：81表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：85表示的轻链可变域的cdr序列。
[0139]
4.根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
[0140]
由seq id no：25表示的重链可变域和由seq id no：29表示的轻链可变域；或者
[0141]
由seq id no：33表示的重链可变域和由seq id no：37表示的轻链可变域；或者
[0142]
由seq id no：41表示的重链可变域和由seq id no：45表示的轻链可变域；或者
[0143]
由seq id no：49表示的重链可变域和由seq id no：53表示的轻链可变域；或者
[0144]
由seq id no：57表示的重链可变域和由seq id no：61表示的轻链可变域；或者
[0145]
由seq id no：65表示的重链可变域和由seq id no：69表示的轻链可变域；或者
[0146]
由seq id no：73表示的重链可变域和由seq id no：77表示的轻链可变域；或者
[0147]
由seq id no：81表示的重链可变域和由seq id no：85表示的轻链可变域。
[0148]
5.能够与fx(seq id no：90)和/或其活化形式(fxa)结合的抗体或其抗原结合片段。
[0149]
6.根据实施方案5所述的抗体，其中所述抗体是fab。
[0150]
7.根据实施方案5或6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
[0151]
由seq id no：1表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：5表示的轻链可变域的cdr序列；
[0152]
或者
[0153]
由seq id no：17表示的重链可变域的cdr序列和由seq id no：21表示的轻链可变域的cdr序列。
[0154]
8.根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
[0155]
由seq id no：1表示的重链可变域和由seq id no：5表示的轻链可变域；或者
[0156]
由seq id no：17表示的重链可变域和由seq id no：21表示的轻链可变域。
[0157]
9.能够与根据seq id no：89的fix或其活化形式(fixa)和fx(seq id no：90)或其活化形式(fxa)结合的多特异性抗体或其抗原结合片段。
[0158]
10.根据实施方案9所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
[0159]
11.根据实施方案9所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案5-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
[0160]
12.根据实施方案9所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和根据前述实施方案5-8中任一项所述的抗原结合片段。
[0161]
13.根据实施方案9-12中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其包含
[0162]
由seq id no：28表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0163]
由seq id no：32表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0164]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0165]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0166]
由seq id no：28表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0167]
由seq id no：32表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0168]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0169]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0170]
由seq id no：36表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0171]
由seq id no：40表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0172]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0173]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0174]
由seq id no：36表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0175]
由seq id no：40表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0176]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0177]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸
置换和/或缺失和/或插入；或者
[0178]
由seq id no：44表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0179]
由seq id no：48表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0180]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0181]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0182]
由seq id no：44表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0183]
由seq id no：48表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0184]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0185]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0186]
由seq id no：52表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0187]
由seq id no：56表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0188]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0189]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0190]
由seq id no：52表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0191]
由seq id no：56表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0192]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0193]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0194]
由seq id no：60表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0195]
由seq id no：64表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0196]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0197]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0198]
由seq id no：60表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0199]
由seq id no：64表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0200]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0201]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0202]
由seq id no：68表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0203]
由seq id no：72表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0204]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0205]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0206]
由seq id no：68表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0207]
由seq id no：72表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0208]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0209]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0210]
由seq id no：76表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0211]
由seq id no：80表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0212]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0213]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0214]
由seq id no：76表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0215]
由seq id no：80表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0216]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸
置换和/或缺失和/或插入，和
[0217]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0218]
由seq id no：84表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0219]
由seq id no：88表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0220]
由seq id no：20表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0221]
由seq id no：24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0222]
由seq id no：84表示的抗fix(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0223]
由seq id no：88表示的抗fix(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0224]
由seq id no：4表示的抗fx(a)抗体重链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0225]
由seq id no：8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入。
[0226]
14.根据实施方案9-13中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其包含
[0227]
分别由seq id no：26、27和28表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0228]
分别由seq id no：30、31和32表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0229]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0230]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0231]
分别由seq id no：26、27和28表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0232]
分别由seq id no：30、31和32表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0233]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0234]
分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0235]
分别由seq id no：34、35和36表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0236]
分别由seq id no：38、39和40表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包
含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0237]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0238]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0239]
分别由seq id no：34、35和36表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0240]
分别由seq id no：38、39和40表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0241]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0242]
分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0243]
分别由seq id no：42、43和44表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0244]
分别由seq id no：46、47和48表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0245]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0246]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0247]
分别由seq id no：42、43和44表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0248]
分别由seq id no：46、47和48表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0249]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0250]
分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0251]
分别由seq id no：50、51和52表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0252]
分别由seq id no：54、55和56表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0253]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0254]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0255]
分别由seq id no：50、51和52表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0256]
分别由seq id no：54、55和56表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0257]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0258]
分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0259]
分别由seq id no：58、59和60表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0260]
分别由seq id no：62、63和64表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0261]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0262]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0263]
分别由seq id no：58、59和60表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0264]
分别由seq id no：62、63和64表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0265]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0266]
分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0267]
分别由seq id no：66、67和68表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0268]
分别由seq id no：70、71和72表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0269]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0270]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0271]
分别由seq id no：66、67和68表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0272]
分别由seq id no：70、71和72表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0273]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdrl-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0274]
分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0275]
分别由seq id no：74、75和76表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包
含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0276]
分别由seq id no：78、79和80表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0277]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0278]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0279]
分别由seq id no：74、75和76表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0280]
分别由seq id no：78、79和80表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0281]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0282]
分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0283]
分别由seq id no：82、83和84表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0284]
分别由seq id no：86、87和88表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0285]
分别由seq id no：18、19和20表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0286]
分别由seq id no：22、23和24表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入；或者
[0287]
分别由seq id no：82、83和84表示的抗fix(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0288]
分别由seq id no：86、87和88表示的抗fix(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和
[0289]
分别由seq id no：2、3和4表示的抗fx(a)抗体重链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入，和分别由seq id no：6、7和8表示的抗fx(a)抗体轻链cdr1-3序列，其任选地包含1、2或3个氨基酸置换和/或缺失和/或插入。
[0290]
15.根据实施方案14所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是能够特异性结合fix(a)和fx(a)的双特异性抗体，其中所述结合域是由以下mab组成的mab对的结合域：
[0291]
mab1/maba、mab2/maba、mab3/maba、mab4/maba、mab5/maba、mab6/maba、mab7/maba，mab8/maba，mab1/mabb、mab2/mabb、mab3/mabb、mab4/mabb、mab5/mabb、mab6/mabb、mab7/mabb或mab8/mabb。
[0292]
16.根据实施方案9-15中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是促凝血抗体。
[0293]
17.根据实施方案9-16中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所
述抗体或其抗原结合片段能够增加fixa对fx的酶活性。
[0294]
18.根据实施方案9-17中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够功能性地代替fviii和/或fviiia。
[0295]
19.根据实施方案9-18中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
[0296]
20.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体同种型是igg1、igg2、igg3或igg4或其组合，如包含igg1 fc区和igg4 fc区的抗体，并且任选地在ch3域中包含1或2个置换。
[0297]
21.药物组合物，其包含根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及可选的一种或多种药学上可接受的载体。
[0298]
22.包含根据实施方案21所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其用于治疗凝血病或凝血障碍，如具有或不具有抑制物的a型血友病。
[0299]
23.根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或组合物，其用于凝血病或凝血障碍的治疗方法，如按需治疗或预防性治疗。
[0300]
24.根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或组合物，其用于治疗具有或不具有抑制物的a型血友病，如按需治疗或预防性治疗。
[0301]
25.治疗患有凝血病或凝血障碍的受试者的方法，其包括向所述受试者施用根据前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或组合物。
[0302]
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述凝血病或凝血障碍是a
[0303]
型血友病或具有抑制物的a型血友病。
[0304]
27.根据实施方案1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或组合物在制备用于治疗有需要的受试者如按需治疗或预防性治疗的药物中的用途。
[0305]
28.根据实施方案1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或组合物在制备用于治疗具有或不具有抑制物的a型血友病如按需治疗或预防性治疗的药物中的用途。
[0306]
29.真核细胞，其表达根据实施方案1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
[0307]
30.试剂盒，其包含根据实施方案1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或组合物以及使用说明书。
[0308]
31.根据实施方案1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是供多特异性抗体如促凝血双特异性抗体使用的组分(中间体)。
[0309]
32.根据实施方案1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是用于制备多特异性抗体如促凝血双特异性抗体的组分(中间体)。
[0310]
33.根据实施方案9-20中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，如促凝血双特异性抗体，其中所述抗体的促凝血活性与wo2018/141863和wo2019/065795中公开的多特异性抗体相比得到改善。
[0311]
34.根据实施方案33所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述改善使用如本文公开的测定如ha-ppp tgt测定(如本文实施例7中所述)来确定。
[0312]
35.根据实施方案9-20中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中在根据本文实施例7的tgt测定(在ha-ppp中)中化合物浓度为700nm时，所述抗体或其抗原结合片段能够提供如下的平均峰值凝血酶(单位为nm)：
[0313]
a)当使用组织因子作为触发物时，至少为80、81、82、83、84、95、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110，或者
[0314]
b)当使用fxia作为触发物时，至少为350、355、360、365、370、375、380、385或390。
[0315]
36.根据实施方案9-20中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中如根据本文实施例8所测定的，所述抗体或其抗原结合片段具有等效的fviii活性，其相对于emicizumab以及wo2018/141863和wo2019/065795(均通过引用并入本文)中公开的多特异性抗体得到改善。
[0316]
37.根据实施方案9-20中任一项所述的抗体，其中抗体同种型是igg4，任选地在一个ch3域中包含1或2个置换。
[0317]
38.注射装置，其包含根据实施方案9-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或组合物。
[0318]
39.根据实施方案38所述的注射装置，其中所述装置是一次性和/或预填充和/或多剂量装置，例如笔。
[0319]
40.根据实施方案39所述的注射装置，其中所述装置是预填充笔。
[0320]
41.根据实施方案39-40所述的注射装置，其中所述装置是多剂量笔。
[0321]
42.根据实施方案38-41中任一项所述的注射装置，其中所述注射装置包括针规为20至36的管。
[0322]
43.根据实施方案13或14所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述置换是保守置换。
[0323]
在一个实施方案中，当本发明的多特异性抗体如双特异性抗体以临床相关剂量用于治疗a型血友病时，所述抗体不干扰施用于a型血友病患者的fviii如重组fviii的作用。
[0324]
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段当以43.64μg/ml血浆存在时，在罹患a型血友病的患者中，相当于至少20-50，如20-40，如25-35，如至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40iu的等效因子viii活性/分升血浆。
[0325]
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段当以30μg/ml血浆存在时，在罹患a型血友病的患者中，相当于至少10-50，如15-40，如15-30，如15-20，如至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50iu的等效因子viii活性/分升血浆。
[0326]
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段当以15μg/ml血浆存在时，在罹患a型血友病的患者中，相当于至少10-50，如15-40，如15-30，如15-20，如至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50iu的等效因子viii活性/分升血浆。
[0327]
在一个实施方案中，与本领域的促凝血抗体相比，本发明的抗体或其抗原结合片段具有降低的免疫原性。
[0328]
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段用于预防性治疗具有或不具有抑制物的a型血友病。
[0329]
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够刺激fixa对fx的酶活性。
[0330]
在一个实施方案中，实施例6表2中列出的抗fix(a)抗体或其抗原结合片段能够刺激fixa对fx的酶活性。
[0331]
在优选的实施方案中，本发明的抗体具有igg4/κ形式，任选地在fc恒定区中包含一个或多个置换。
[0332]
重链恒定域区域(ch1-ch2-ch3)用于具有s228p(eu-编号)置换并具有c末端赖氨酸截短的抗fix(a)臂人igg4：
[0333][0334]
在一个实施方案中，重链恒定域区域(ch1-ch2-ch3)用于这样的抗fx(a)臂人igg4，其具有s228p置换，并且在ch3域中具有两个另外的置换：f405l和r409k(eu编号)，以促进重链的异二聚化(在实施例4中描述)，并且具有c末端赖氨酸的截短：
[0335][0336]
并且，轻链恒定区(cl)是人κ：
[0337][0338]
在另一个实施方案中，抗体也可以以igg4形式表达，其具有用于带有s228p、f405l和r409k置换的抗fix(a)臂的重链恒定域区域(ch1-ch2-ch3)，以及用于带有s228p置换、具有或不具有c末端赖氨酸缺失的抗fx(a)臂的重链恒定域区域。
[0339]
在一个实施方案中，抗体也可以以igg1/κ形式表达。在这种情况下，抗fix(a)臂的重链恒定域区域是人igg1 f405l，其具有c末端赖氨酸的截短：
[0340][0341]
并且抗fx(a)臂的重链恒定域区域是人igg1 k409r，其具有c末端赖氨酸的截短：
[0342][0343][0344]
抗体也可以以igg1形式表达，其具有用于带有k409r置换的抗fix(a)臂的重链恒定域区域(ch1-ch2-ch3)，以及用于带有f405l置换、具有或不具有c末端赖氨酸缺失的抗fx(a)臂的重链恒定域区域。
[0345]
恒定域区域可以进一步包含另外的置换或其他修饰，例如，以便调节效应子功能、半衰期或其他性质。
[0346]
在一个实施方案中，能够与fix(a)和fx(a)结合的双特异性抗体的效力，例如但不限于本文公开的那些双特异性抗体的效力，可以在包含以下成分的显色效力测定中测定：a)在纤维蛋白聚合抑制剂的存在下冻干的人因子x，b)人因子ixa，c)人凝血酶，d)钙，和e)合成磷脂，f)因子xa(sxa-11)特异性的显色底物(hyphen biomed)和待评估的抗fix/抗fx双特异性抗体。对于任何稀释，可以使用合适的缓冲液，如tris-bsa。在这样的测定中，fx激活的水平取决于双特异性抗体的效力。活化的fx(fxa)水解显色底物，由此释放pna，从而允许得到405nm处的分光光度测量读数(photospectometric readout)(例如使用tecan sunrise elisa酶标仪)。该读数取决于fxa浓度，因此与被测双特异性抗体的效力成比例。应包括具有预定效力的双特异性参考抗体。
[0347]
本公开还提供了试剂盒，其包含适合于本文所述治疗的如本文公开的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，试剂盒包含(i)如本文公开的抗体，如双特异性抗体或其抗原结合片段，或药物组合物，或编码核酸或载体，或其组合，以及(ii)使用说明书。技术人员将容易地认识到，如本文公开的抗体、双特异性分子(例如，双特异性抗体)和药物组合物，或编码核酸或载体，或其组合，可以容易地并入一种本领域公知的已建立的试剂盒格式
中。
[0348]
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均在此通过引用并入本文，其程度如同单独地且特别地指出每篇参考文献均通过引用而并入并且在本文中以其全文进行阐述。
实施例
[0349]
缩写列表
[0350]
acn：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
乙腈
[0351]
bimab：
ꢀꢀꢀ
双特异性单克隆抗体
[0352]
cdr：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
互补决定区
[0353]
lc-ms
ꢀꢀꢀꢀ
液相色谱-质谱法
[0354]
facs：
ꢀꢀꢀꢀ
荧光激活细胞分选
[0355]
fix：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
凝血因子ix
[0356]
fixa：
ꢀꢀꢀꢀ
凝血因子ixa
[0357]
fx：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
凝血因子x
[0358]
fxa：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
凝血因子xa
[0359]
ha：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
a型血友病
[0360]
ha-ppp：
ꢀꢀ
ha诱导的人贫血小板血浆
[0361]
hfixa：
ꢀꢀꢀ
人凝血因子ixa
[0362]
hplc：
ꢀꢀꢀꢀ
高效液相色谱法
[0363]
mab：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
单克隆抗体
[0364]
macs：
ꢀꢀꢀꢀ
磁激活细胞分选
[0365]
pcr：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
聚合酶链反应
[0366]
sec：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
大小排阻色谱法
[0367]
sia：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
序列相同类似物
[0368]
spr：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
表面等离子体共振
[0369]
实施例1：抗fix(a)和抗fx(a)抗体的开发
[0370]
使用各种抗体开发方法鉴定如本文公开的fix(a)和fx(a)结合抗体。为了生成一组多样化的抗体，进行了小鼠和兔的免疫，并且还采用了噬菌体展示和adimab酵母抗体表达平台。
[0371]
adimab酵母抗体平台
[0372]
adimab平台是一种酵母抗体表达系统，其包括完全人类幼稚lgg1/κ文库，多样性为10
10
。使用基于macs和facs的方法指导抗体选择过程，所述方法允许实时监测所应用的选择标准。由于选择基于macs和facs，因此需要标记的抗原(例如生物素)。使用生物素标记的活性位点抑制的hfixa(fixa-egr-生物素)或抗体介导的hfixa固定进行选择活动。使用bio-layer干涉测量法(octet fortebio系统)评价命中物(hit)的结合。
[0373]
噬菌体展示
[0374]
所使用的抗体噬菌体展示平台是专有的完全人类fab展示文库。该文库的大小为10
10
，并且通过利用轻链以及重链cdr1和cdr2的化学合成并辅以从人外周血单核细胞中pcr
125rpm)下在潮湿培养箱中于37℃孵育。转染后一天，向转染的细胞补充5ml expifectamine 293转染增强剂(transfection enhancer)1和50ml expifectamine 293转染增强剂2。一般在转染后4-5天通过离心和随后的过滤收获细胞培养上清液。
[0383]
实施例3：fab和抗体的纯化和表征
[0384]
所有纯化步骤均在4℃下进行。对于实验室规模，使用milli-q水进行缓冲液制备。用于se-hplc分析的hplc系统是aglient 1100。针对qc评估了聚集和lc/ms。
[0385]
在1
×
pbs(10mm na2hpo4，1.8mm kh2po4，137mm nacl，2.7mm kcl)(ph 7.4)中使用结合缓冲液，用hitrap protein g hp亲和色谱法进行fab的捕获。用0.1m甘氨酸(ph 2.8)进行一步洗脱。终产物通过52ml ge hiprep 16脱盐柱脱盐至ph 7.4的配制缓冲液(25mm hepes，150mm nacl)中，并通过离心超滤器(30kd c.o.)浓缩，在-80℃下储存。
[0386]
为了评估纯化的fab的质量，进行了sds-page和高效大小排阻色谱(se-hplc)分析。通过大小排阻色谱法进一步纯化不符合质量标准的批次(例如，根据se-hplc，＜95％单体)。进行lc/ms以验证fab蛋白的身份。显示所有fab的分子量(mw)分别与重链和轻链的理论mw一致。
[0387]
抗体纯化和表征
[0388]
使用蛋白a mabselect sure树脂(ge healthcare，目录号17-5438-01)，通过亲和色谱法进行抗体的纯化。对于小规模抗体生产，在96孔板上进行基于蛋白a的纯化，而对于较大规模的生产，则使用色谱系统(ge healthcare，目录号18-1112-41)。用于亲和纯化步骤的缓冲液体系是1)由20mm磷酸钠ph 7.2、150mm nacl组成的平衡缓冲液，和2)由10mm甲酸ph 3.5组成的洗脱缓冲液，以及3)由0.4m磷酸钠ph 9.0组成的ph调节缓冲液。将细胞上清液无需任何调整直接加样至预平衡的mabselect sure柱上。用大约10倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，并用大约2-5倍柱体积的洗脱缓冲液等度洗脱抗体。在洗脱后立即使用所述ph调节缓冲液将合并的级分的ph调节至中性。
[0389]
使用不同的方法，如sds-page/考马斯、大小排阻高压液相色谱法(se-hplc)和液相色谱质谱(lc-ms)分析，表征纯化的抗体。使用nupage 4-12％bis-tris凝胶(invitrogen，目录号np0321box)进行sds-page/考马斯分析。在此，所有抗体都显示出预期的轻链和重链组分。在agilent 6210仪器和脱盐柱massprep(waters，目录号usrm10008656)上使用液相色谱电喷雾离子化飞行时间质谱法设置进行完整分子量测定。使用的缓冲液体系是由在lc-ms级-h2o中的0.1％甲酸组成的平衡缓冲液和由在lc-ms级-acn中的0.1％甲酸组成的洗脱缓冲液。使用和不使用n-糖苷酶f(roche diagnostics，目录号11365177001)和还原剂(即，巯基乙醇或dtt)进行分析。所有抗体均显示出符合序列和一个重链n-聚糖的预期完整分子量。基于se-hplc测定纯度。基于在agilent lc 1100/1200系统上的se-hplc方法设置并使用biosep-sec-s3000 300
×
7.8mm柱(phenomenex，目录号00h-2146-k0)和由200mm磷酸钠ph 6.9、300mm nacl和10％异丙醇组成的运行缓冲液分析最终蛋白质纯度。uv280和荧光(激发280nm/发射354nm)检测器用于检测。抗体作为单一对称峰洗脱下来，保留时间反映抗体的大小。不同抗体的纯度估计值均在95-99％之间。为了测定最终蛋白质浓度，使用nanodrop分光光度计(thermo scientific)以及对于每种抗体的比消光系数。
[0390]
实施例4：通过体外装配制备的双特异性抗体
[0391]
对于双特异性人igg1抗体通过描述的(labrijn等人.pnas 2013，vol.110，pp.5145-5150)方法(genmab)，而对于双特异性人igg4抗体使用略微修饰的变体，通过体外装配第一和第二抗体产生双特异性抗体，如以下所详述。
[0392]
对于igg1，第一抗体的重链恒定区是人igg1 k409r(抗fix/fixa)，第二抗体的重链恒定区是人igg1 f405l(抗fx/fxa)。如前所述，igg1可以是具有降低的效应子功能的igg1变体。
[0393]
对于人igg4，第一抗体的重链恒定区是igg4 s228p(抗fix/fixa)，第二抗体的重链恒定区是igg4 s228p f405l r409k(抗fx)。这两种亲本抗体如实施例1-3所述产生。fab臂交换反应在使用75mm 2-巯基乙胺(2-mea)的还原条件下在hepes缓冲液(ph 7.4)中进行，并在30℃下孵育4小时。
[0394]
实施例5：单价(单臂)抗体的制备
[0395]
为了避免与常规单特异性和二价抗体相关的任何潜在的亲合力效应，例如，在fxa生成试验(实施例9)中，使用单价单臂(oa)抗体形式，如martens等人：a novel one-armed anti-c-met antibody inhibits glioblastoma growth in vivo.clin.cancer res.12，6144-6152(2006)所述，其中完整重链、截短的重链(缺少fab区)和轻链共表达。并非共表达martens等人描述的三条链，而是如针对双特异性抗体所述(实施例4)，使用原理制备本发明的单价抗体。因此，通过混合完整的单特异性和二价抗体和截短的重链二聚体(在形式上通过去除fab区而由完整抗体衍生而来)并允许在与实施例4所述相同的实验条件下进行链交换来制备单价抗体。单价抗体的形成需要抗体和截短的重链二聚体携带适当的互补突变以促进异二聚化，即，用于人lgg1的f405l/k409r和用于人igg4的f405l r409k/wt，如实施例4所述。
[0396]
在igg1亚型的单价抗体的情况下，重链的截短可以是从n末端到cys 220与上面的铰链cys 226之间的位置(eu编号)。截短的人igg1重链的一个具体实例是残基1-220被截短的igg1重链。
[0397]
在人igg4亚型的单价抗体的情况下，重链的截短可以是从n末端到cys 200与上面的铰链cys 226之间的位置(eu编号)。截短的人igg4重链的一个具体实例是残基1-214被截短的igg4重链。
[0398]
实施例6：双特异性抗体(组分)id和seq id no的概述
[0399]
表1：双特异性抗体组分和相应vh/vl seq id no的概述
[0400]
[0401]
[0402]
[0403]
[0404]
[0405][0406]
实施例7：双特异性抗fix(a)/fx(a)抗体在人a型血友病样贫血小板血浆中的凝血酶生成试验(tgt)中的活性
[0407]
双特异性抗体bimab6b、bimab5b、bimab4b、bimab3b、bimab2b、bimab1b、bimab8b、bimab7b、bimab1a、bimab2a、bimab3a、bimab4a、bimab5a、bimab6a、bimab7a和bimab8a的促凝血活性根据hemker等人(pathophysiol haemost thromb，2002；32：249-253)描述的原理基于它们在促凝血合成磷脂膜的存在下促进凝血酶生成的能力来确定。包括emicizumab序列相同类似物(sia)以供比较。使用补充有中和抗fviii多克隆抗体的正常人贫血小板血浆(nhp)(下文称为ha-ppp)，在凝血酶生成试验(tgt)中测试每种双特异性抗体(测试化合物)。
[0408]
材料与方法
[0409]
凝血酶生成试验
[0410]
在补充有绵羊抗人fviii多克隆抗体(pab，haematologic technologies inc.，vt，usa)的nhp(来自健康志愿者)中的凝血酶生成试验(tgt)使用96孔板荧光计(fluoroscan ascent fl，thermolabsystems，赫尔辛基，芬兰)通过标准校准的自动凝血曲线法(thrombography)进行。反应混合物包含与0.1μg/ml抗fviii pab预孵育的36μl nhp、4μl测试化合物稀释液(在20mm hepes、140mm nacl(ph7.4)、2％bsa中稀释)、10μl的1pm组织因子(tf，ppplow，来自thrombinoscope bv，maastricht，荷兰)或8.3u/ml人因子xia(enzyme reseach laboratories，in，usa)和10μl fluca底物(thrombinoscope bv，maastricht，荷兰)。使用凝血酶校准物(thrombinoscope bv，maastricht，荷兰)校准tgt，其中10μl凝血酶校准物与同0.1μg/ml抗fviii pab预孵育的36μl nhp、4μl缓冲液(20mm hepes，140mm nacl，ph 7.4，2％bsa)混合。tgt在8种浓度的测试化合物(0.32、0.96、2.88、8.64、25.9、77、233和700nm，最终血浆浓度)或仅添加缓冲液(20mm hepes，140mm nacl，ph 7.4，2％bsa)(代表ha对照)下进行。在来自相同储备液的ha-ppp中的至少三个独立实验中测试浓度范围。仅使用添加了nhp的缓冲液(20mm hepes，140mm nacl，ph7.4，2％bsa)测量tgt中的正常对照水平。使tgt进行总共60分钟，并通过thrombinoscope软件(thrombinoscope bv)分析tgt参数峰值凝血酶高度(nm)。
[0411]
结果与讨论
[0412]
表4和表5显示了在分别用组织因子和人fxia触发的ha-ppp中测试的浓度下，对每种双特异性抗体测得的峰值凝血酶生成速率。数据显示，所有测试化合物均使峰值凝血酶形成增加至高于在不存在抗体时观察到的水平，即表现出促凝血活性。另外，当bimab浓度高于8.64nm且使用1pm组织因子触发物时，bimab6b、bimab5b、bimab4b、bimab3b、bimab2b、bimab1b、bimab8b、bimab1a、bimab2a、bimab3a、bimab4a、bimab5a、bimab6a和bimab8a均表现出比针对emicizumab sia所观察到的更高的浓度依赖性凝血酶生成速率，从而显示出更优的效力。bimab7b在2.88至233nm bimab时优于emicizumab sia。
[0413]
此外，当用8.3mu/il人fxia触发凝血时，在所有测试浓度下，bimab6b、bimab5b、bimab4b、bimab3b、bimab2b、bimab1b、bimab8b、bimab7b、bimab1a、bimab2a、bimab3a、bimab4a、bimab5a、bimab6a、bimab7a和bimab8a均表现出比针对emicizumab sia所观察到的更高的凝血酶生成潜力。
[0414]
表4：用组织因子触发的ha-ppp中的凝血酶生成试验(tgt)
[0415]
双特异性抗体bimab6b、bimab5b、bimab4b、bimab3b、bimab2b、bimab1b、bimab8b、bimab7b、bimab1a、bimab2a、bimab3a、bimab4a、bimab5a、bimab6a、bimab7a和bimab8a的凝
血酶生成试验(tgt)在用人组织因子(ppplow)触发的诱导a型血友病血浆(ha-ppp)中进行了测试。在ha-ppp中至少三次独立实验中，在每种测试化合物浓度下测得的平均峰值凝血酶生成水平
±
标准偏差。如果由于数据质量差而放弃测量，则省略标准偏差。
[0416]
[0417]
[0418]
[0419]
[0420][0421]
实施例8：双特异性抗体的等效fviii活性
[0422]
为了在体外估计bimab的等效fviii活性，建立了基于血浆的凝血酶生成试验，以
允许使用峰值凝血酶水平对1至100iu/dl的重组b结构域截短的fviii产生广泛的剂量响应。重组b结构域截短的fviii的剂量响应曲线用作标准曲线，用于分析从bimab生成凝血酶，以估计等效fviii活性。
[0423]
方法：
[0424]
如实施例7中所述测量凝血酶生成，然而使用1u/ml人因子xia(enzyme research laboratories，in，usa)作为触发物。另外，包括从100iu/dl向下两倍稀释的重组b结构域截短的fviii(novoeight，novo nordisk a/s)的8点稀释系列作为fviii标准曲线。
[0425]
双特异性抗体的fviii等效活性的测定：
[0426]
使用graphpad prism版本8.0.2的非线性分析函数，将重组b结构域截短的fviii的剂量响应数据拟合到“[激动剂]对响应(三个参数)”(方程式1)：
[0427]
方程式1.峰值凝血酶＝底部 [fviii]*(顶部-底部)/(ec50 [fviii])
[0428]
其中[fviii]是以iu/ml为单位的fviii浓度，ec50是产生50％活性的fviii浓度，底部和顶部是该拟合的平台部分(plateau)。
[0429]
通过求解[fviii]，可使用修改后的方程式(方程式2)来估计生成与特定双特异性抗体相同的凝血酶峰值的fviii浓度：
[0430]
方程式2.
[0431]
其中y是测得的峰值凝血酶。
[0432]
结果：
[0433]
fviii剂量-响应曲线的非线性拟合产生以下常数：ec50＝20.3
±
2.73，顶部＝476
±
18.7且底部＝-22.6
±
10.1。使用方程式2，对于实施例6中描述的双特异性抗体估计了等效fviii活性，参见以下表6。
[0434]
表6：双特异性抗体的等效fviii活性。
[0435]
在四种不同的bimab浓度(10、30、100和300nm，分别对应于1.45、4.36、14.55和43.64μg/ml)下测试的bimab的估计fviii等效活性。fviii当量(iu/dl)的结果表示为平均值
±
sd(n＝3)。
[0436][0437][0438]
实施例9：单价抗fix(a)抗体在fxa生成试验中的活性
[0439]
为了避免由于常规igg抗体形式的二价性而产生的任何潜在的亲合力效应，在重新格式化为单价单臂(oa)抗体形式后，确定抗fix(a)抗体对于fixa针对fx的酶活性的刺激活性(实施例5)。所测试的抗体列于以下表7中。包括抗fixa抗体ace910的单价oa形式以供比较。
[0440]
在固定浓度的磷脂酰丝氨酸(ps)：磷脂酰胆碱(pc)磷脂囊泡(终浓度为500μm；haematologic technologies inc，usa)和血浆来源的fixa(终浓度为0.025或0.1nm；haematologic technologies inc，usa)下，在测定缓冲液(50mm hepes，100mm nacl，5mm cacl2，0.1％(w/v)peg8000，ph 7.3 1mg/ml bsa)中测定oa抗体的刺激活性。选择fixa的浓度以确保少于15％的底物fx转化为fxa。在单价oa抗体(表7中列出的终浓度)的存在下预孵育后，加入100nm血浆来源的fx(haematologic technologies inc，usa)以达到50μl的最终反应体积，并使激活在室温下进行20min。然后通过加入25μl猝灭缓冲液(50mm hepes，100mm nacl，60mm edta，0.1％peg8000，ph 7.3 1mg/ml bsa)猝灭反应，并且通过进一步添加25μl 2mm s-2765生色底物(chromogenix，瑞典)，并在酶标仪中通过405nm处的吸光度测量(δod/min)测定生色底物转化，来确定生成的fxa的量。通过减去在除了将fixa和抗体替换为测定缓冲液外相同的试验中测得的信号来针对背景活性校正测得的活性，然后根据该试验中存在的fixa的浓度([fixa]
总
)进行归一化。将该数值除以在不存在抗体的情况下类
似归一化的fxa生成速率(a
fixa，归-化
)，计算抗体刺激指数，提供该抗体在所用浓度下对fixa活性的刺激倍数。由于游离fixa产生fxa的速度缓慢，如上所述但在5、10或20nm fixa的存在下进行在不存在抗体的情况下的激活反应。然后对测得的活性进行背景减除，并根据该试验中的fixa浓度进行归一化。为了计算刺激指数，使用游离fixa的三个归一化活性的平均值。
[0441]
刺激指数的确定
[0442]
总之，刺激指数的计算可以描述如下
[0443]
方程式3刺激指数＝((a
fixa oa-a
背景
)/[fixa]
总
)/a
fixa，归-化
[0444]
其中a
fixa oa
是在oa抗体的存在下测得的活性，a
背景
是在不存在fixa和oa抗体的情况下测得的背景活性，[fixa]
总
是该试验中的fixa浓度，而a
fixa，归一化
是游离fixa的平均归一化活性。
[0445]
fixa饱和度的确定
[0446]
在该试验中用oa抗体饱和的fixa的分数通过fixa和oa抗体的浓度以及控制其相互作用的平衡解离常数(kd)来确定。后者可以通过本领域已知的技术如等温滴定量热法(itc)来测量。
[0447]
由于刺激指数将随着oa抗体浓度的增加而增加，直至达到fixa饱和，因此应选择该试验中oa抗体的浓度以确保该试验中fixa的饱和度至少为80％，以提供完全fixa饱和时刺激指数的适当测定值。
[0448]
平衡时与oa抗体结合的fixa的分数(f
fixa oa
)可以使用如krishnaswamy等人(1992)j.biol.chem.，267：23696-23706描述并在以下方程式4和5中详述的二次结合方程式，从该试验中fixa([fixa]
总
)和oa抗体([oa]
总
)的总浓度以及针对其相互作用的平衡解离常数(kd)来计算，在所述方程式中
[0449]
[fixa oa]
试验
表示在试验中平衡时fixa-oa抗体复合物的计算浓度
[0450]ffixa oa
表示在试验中平衡时与oa抗体结合的fixa的计算分数(以百分比表示)
[0451]
方程式4
[0452][0453]
方程式5
[0454]
表7中提供了每种oa抗体的刺激指数。在oa emicizumab抗体的情况下，在八种不同的抗体浓度下测定了fixa刺激，其允许使用如上所概述的二次结合方程式估算完全fixa饱和时的刺激指数。这也为emicizumab与fixa的相互作用提供了1.1μm的估计平衡解离常数(kd)，该值与kitazawa等人(2017)thromb haemost，117：1348-1357报道的1.52μm的值非常吻合。对于其余抗体，fixa饱和度未知，因此列出的刺激指数代表在fixa饱和度为80％或更高时所获得的刺激的保守估计值。对于测试的抗体，发现测得的刺激指数高于对oa emicizumab抗体所测得的刺激指数。
[0455]
表7：单价单臂(oa)抗fixa抗体对fixa活性的刺激
[0456]
抗fix mab id是指用于重新格式化为oa形式的抗体的id。标记为“oa抗体浓度(nm)”和“刺激指数”的列列出了该试验中使用的oa抗体的浓度(nm)以及相对于游离fixa测得的fixa活性的相应刺激。在emicizumab的情况下，提供了在完全fixa饱和时的估计刺激指数。
[0457]
抗fix mab idoa抗体浓度(nm)刺激指数emicizumab饱和1372mab115999841mab2564014228mab37498649mab4121710537mab5146311241mab6354713510mab78518727mab8127610089
[0458]
实施例10：非特异性结合的sec-hplc分析
[0459]
低非特异性结合是药物抗体的重要特征。非特异性结合的高倾向可导致诸如体内半衰期缩短(i.等人，mabs，2012和avery，l.b.，mabs，2018)和溶解度降低(kohli，n.，mabs，2015和wolf perez，a.m.，mabs，2019)等问题。为了评价以下表8中列出的抗fix(a)mab的非特异性结合，我们使用了sec-hplc方法，其中mab-柱相互作用导致延迟的洗脱。因此，延长的保留时间是非特异性结合的度量。我们使用了先前描述(wolf perez，a.m.，mabs，2019)并且与(dobson，c.l.，sci rep，2016；6：38644)中描述的方法高度相似的方法。对于bimab1-8，相对于如实施例4所述制备的emicizumab vh/vl sia，非特异性结合减少，参见表8。
[0460]
材料与方法
[0461]
使用hplc系统(型号1200，agilent technologies)和tsk g3000 swxl sec柱(5μm，7.8
×
300mm；tosoh bioscience)进行大小排阻色谱hplc(sec-hplc)分析。流动相由122mm na2hpo4、78mm nah2po4、300mm nacl和4％2-丙醇组成，ph为6.8。每次分析运行24min，流速为0.8ml/min，柱温为28℃。将15μl蛋白质溶液注入柱上，然后用280nm吸光度追踪洗脱。使用astra v.7(wyatt technology)进行数据处理。
[0462]
表8：保留时间的变化
[0463]