一种核壳结构上转换纳米粒子、上转换荧光探针及其在尿素检测中的应用

1.本发明涉及一种核壳结构上转换纳米粒子、上转换荧光探针及其在尿素检测中的应用，属于化学与纳米材料科学领域。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，它在作为一道屏障保护人体的同时也向外传递来自内部器官、肌肉、血管和真皮/表皮的生理信号。汗液是通过皮肤表皮的毛孔排出的无色体液，主要由电解质、乳酸、肌酐、尿素和葡萄糖等组成。人体汗液中含有重要的健康信息，其中尿素是一个重要的生物标志物。作为人体内含氮物质代谢的主要最终产物，尿素主要由肾脏通过尿液排出体外，但也同时存在于血液、汗液和唾液等体液中。血尿素氮(bloodureanitrogen，bun)在临床诊断中被作为衡量肾功能的重要指标，其浓度的升高可以反映以下生理问题：肾小球肾炎、慢性肾炎、中毒性肾炎、前列腺肥大、尿石症和膀胱癌等。最近的研究发现，癌症患者尿素循环酶表达的特殊改变会导致含氮物质更多地转化为嘧啶，导致患者体液中的尿素水平降低。因此，有效检测人体内的尿素水平对于疾病的早期诊断以及疾病研究非常重要。
3.对个人健康指标的监测需求不断上升推动了各种生物传感器设备的发展。近年来，可穿戴式传感器由于具有能够直接穿戴在人体皮肤上、具有优异的生物相容性和无创等特点，在医疗和健康监测领域吸引了大量的关注。到目前为止，已经报道了各种可穿戴式传感器用于检测人体运动和生理信号，如关节活动、血压、体温、血氧和ph值等。具有三维网络状结构的水凝胶是作为可穿戴式传感器的理想材料，因为其具有良好的灵活性、可伸展性和生物相容性。基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance,spr)、比色、荧光和电化学等传感策略可以使水凝胶传感器对外界的物理和化学刺激作出响应。在众多传感策略中，比色法和荧光法具有更好的选择性，适合在生物样品的复杂检测环境中实现对目标的检测。比色法在应用于可穿戴传感器时容易受到环境光和肤色的干扰，而荧光法在克服这些缺点的同时拥有更高的灵敏度。然而，目前报道的大多数荧光水凝胶是由短波长激发的，在检测生物样品时容易受到自发荧光和背景荧光的干扰。近年来，上转换纳米粒子(ucnps)在生物检测、生物成像和疾病治疗等生物医学领域的应用得到迅速发展。与传统的荧光材料相比，ucnps的激发和发射波长可以调控到生物透过窗口(biological transmission windows,btw)，有效地减少了组织对光的吸收和散射，使ucnps具有更深的组织穿透力。由于具有良好的光学稳定性、信噪比高、噪声小、无背景荧光干扰、对生物组织几乎无损伤等优点，各种基于ucnps的生物传感方法已经被开发出来。然而，基于上转换发光的可穿戴水凝胶传感器到目前为止还没有报道。


技术实现要素：

4.本发明针对上述现有技术的不足，旨在提供一种核壳结构上转换纳米粒子、上转
换荧光探针及其在尿素检测中的应用。本发明上转换荧光探针能对尿素进行可视化检测，具有较低的检测限。
5.本发明核壳结构上转换纳米粒子是通过包括如下步骤的方法制备获得：
6.步骤1：将3.85mmol氯化钇、1.0mmol氯化镱、0.1mmol氯化铒、0.05mmol氯化铥、30ml油酸和75ml十八烯混合，在氩气环境下于160℃反应60分钟后自然冷却到室温；
7.步骤2：将含有0.50g氢氧化钠和0.74g氟化铵的50ml甲醇逐滴加入步骤1的体系中，在50℃下反应40分钟，随后加热到100℃并在真空下保持20分钟，接着加热到300℃并在氩气环境下保持90分钟；
8.步骤3：反应液自然冷却到室温，加入乙醇后离心，得到nayf4:yb,er/tm核心上转换纳米粒子。使用乙醇洗涤三次后分散于环己烷中备用。
9.步骤4：将1mmol氯化钇、24ml油酸和60ml十八烯混合，并在氩气环境下于160℃反应60分钟，反应液冷却到室温；
10.步骤5：向步骤4的体系中加入步骤3获得的4mmol nayf4:yb,er/tm核心上转换纳米粒子并均匀分散；将含有0.150g氢氧化钠和0.222g氟化铵的15ml甲醇逐滴加入反应体系中，在50℃下反应40分钟；之后，将体系升温至100℃并在真空下保持20分钟，然后加热到300℃并在氩气环境下保持90分钟；
11.步骤6：反应液自然冷却到室温，加入乙醇后离心，得到nayf4:yb,er/tm@nayf4核壳结构上转换纳米粒子。使用乙醇洗涤三次后分散于环己烷中备用。
12.所述核心上转换纳米粒子的平均粒径为25nm；所述核壳结构上转换纳米粒子的平均粒径为31nm。
13.本发明上转换荧光探针，是基于所述核壳结构上转换纳米粒子制备获得，具体包括如下步骤：
14.将1mmol核壳结构上转换纳米粒子加入50ml盐酸溶液(ph＝1)中超声处理60分钟，随后通过高速离心获得亲水性上转换纳米粒子；在30μm的盐酸水溶液中加入亲水性上转换纳米粒子，使其最终浓度为4mm；随后加入p-dmac，使其浓度为10mm；超声混合均匀，得到上转换荧光探针溶液。
15.本发明上转换荧光探针的应用，是以所述上转换荧光探针作为检测试剂，用于尿素的检测。
16.所述上转换荧光探针对于不同浓度的尿素会产生荧光和比色的有序变化，从而实现对尿素的可视化定量检测。
17.具体的检测方法包括：
18.步骤1：标准曲线的绘制
19.以尿素标准溶液与所述上转换荧光探针混合配制得到复合荧光探针体系，通过荧光分析法拟合出尿素浓度的标准曲线。
20.复合荧光探针体系成分如下：100μl亲水性上转换纳米粒子溶液，200μl浓度为100mm的p-dmac乙醇溶液，50μl 1.2mm的盐酸水溶液，美司那以及超纯水。最终复合荧光探针体系的体积为2ml，其中尿素的浓度为0-1.4mm。
21.进一步地，分别配制尿素浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4μm的复合荧光探针体系，以尿素浓度和荧光强度比值i
540
/i
654
作线性拟合
获得标准曲线。
22.步骤2：以步骤1的检测条件对未知的待测尿素溶液进行检测，通过测试获得其荧光强度值，与步骤1获得的标准曲线进行比对得到待测尿素溶液的浓度数据。
23.此外，还可以通过所述上转换荧光探针制备水凝胶传感贴片，用于尿素的可视化定量检测，具体包括如下步骤：
24.将3g丙烯酰胺、0.05g n,n
’‑
亚甲基双(丙烯酰胺)和0.05g k2s2o8溶解在30ml去离子水中，然后加入10ml先前合成的上转换荧光探针溶液，超声混合均匀；随后，用移液器将50μl temed加入到上述溶液中，然后注入模具中，待水凝胶成型后脱模即可获得尿素传感水凝胶。
25.所述尿素传感水凝胶对于不同浓度的尿素会产生荧光和比色的有序变化，通过设备或软件铺货发光照片并获得相应的rgb值，即可实现对尿素的可视化定量检测。
26.具体地：通过拟合尿素浓度和g/r比值即可得到标准曲线，进而实现对未知的待测尿素溶液浓度的检测。
27.本发明核壳上转换纳米粒子在近红外980nm波长激发下能够呈现红色和绿色荧光。其中绿色荧光发射峰位于540nm，红色荧光发射峰位于654nm。
28.本发明的技术方案包括核壳结构上转换纳米粒子的制备、上转换荧光探针的设计与合成，最终实现尿素的现场可视化即时检测。由于p-dmac可以和尿素反应生成红色化合物，其吸收光谱与上转换发射光谱重叠并猝灭上转换绿色发光，从而产生荧光和比色的有序变化。设计的传感器能够可视化检测汗液和血清中的尿素浓度。
29.相对于现有技术，本发明的有益效果体现在：
30.1、本发明方法操作简单，上转换纳米粒子合成制备简单，荧光探针的构建在一般化学实验室即可完成；
31.2、本发明的尿素传感器与现有的尿素检测技术相比，优点在于设计的比率荧光探针具有明显直观的色度变化，可以精确测定尿素水平。可以根据荧光颜色的不同判断样品中尿素的浓度，实现了可视化检测；
32.3、本发明作为可穿戴式设备实现了现场即时检测，在一定程度上避免了大型仪器的使用，检测结果可以为人体的健康状况提供参考；
33.4、本发明的传感器对尿素具有出色的选择性，能够有效避免样品中其他杂质的干扰。在生物样品中对常见的无机盐、氨基酸、和其他生理代谢物具有较好的抗干扰性。此外由于近红外激发的上转换发光，可以避免生物样品的背景荧光干扰，同时避免了肤色和环境光线的干扰，显著提高了传感器的灵敏度和准确性。
附图说明
34.图1是本发明所得的上转换纳米粒子的透射电镜照片。其中图a为核心上转换纳米粒子、图b为核壳结构上转换纳米粒子。从图1中可以看出合成的上转换纳米粒子呈球形且具有均一的尺寸。
35.图2是本发明所得的核心和核壳上转换纳米粒子的粒径分布。从图2中可以看出，包覆的壳层厚度约为3nm。
36.图3是本发明纳米传感器检测机理示意图。
37.图4是纳米传感器对不同浓度尿素的荧光和比色响应。其中图a为探针对尿素的荧光响应、图b为荧光强度比和尿素浓度之间的线性关系、图c为探针对尿素的比色响应、图d为吸收值和尿素浓度之间的线性关系。从图4中可以看出探针对尿素具有明显的荧光和比色响应。
38.图5是本发明所制作的尿素传感贴片。其中图a是传感贴片的结构示意图、图b为扫描电镜图和实物图。
39.图6是利用便携式传感平台对尿素进行可视化定量检测。其中图a为检测尿素的便携式传感平台的组成、图b和图c展示了传感平台对不同型号手机的兼容性。
具体实施方式
40.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
41.实施例1：
42.1、核壳结构上转换纳米粒子的制备
43.将3.85mmol氯化钇、1.0mmol氯化镱、0.1mmol氯化铒、0.05mmol氯化铥、30ml油酸和75ml十八烯混合，在氩气环境下于160℃加热60分钟后自然冷却到室温。将含有0.50g氢氧化钠和0.74g氟化铵的50ml甲醇逐滴加入上述溶液，在50℃下加热40分钟，随后加热到100℃在真空下保持20分钟，接着加热到300℃并在氩气环境下保持90分钟。将溶液自然冷却到室温，加入乙醇后离心得到nayf4:yb,er/tm核心上转换纳米粒子。使用乙醇洗涤三次后分散于环己烷中备用。将1mmol氯化钇、24ml油酸和60ml十八烯混合，并在氩气环境下于160℃加热60分钟后将溶液冷却到室温。加入上一步合成的4mmolnayf4:yb,er/tm核心纳米粒子并均匀分散。然后，将含有0.150g氢氧化钠和0.222g氟化铵的15ml甲醇逐滴加入上述溶液中，在50℃下加热40分钟。之后，将溶液加热到100℃并在真空下保持20分钟，然后加热到300℃并在氩气环境下保持90分钟。溶液自然冷却到室温后加入乙醇后离心得到nayf4:yb,er/tm@nayf4核壳结构上转换纳米粒子。使用乙醇洗涤三次后分散于环己烷中备用。
44.2、上转换荧光探针的制备
45.将先前制备的1mmol核壳上转换纳米粒子加入到50ml的盐酸溶液(ph＝1)中超声处理60分钟，随后通过高速离心获得亲水性上转换纳米粒子。在30μm的盐酸水溶液中加入亲水性上转换纳米粒子，使其最终浓度为4mm。随后加入p-dmac，使其浓度为10mm。超声五分钟后混合均匀，得到探针溶液。
46.3、尿素标准溶液的配制
47.取6.006g分析纯尿素，加入去离子水溶解并定容1000ml，得到浓度为0.1m的尿素标准溶液。
48.4、定量检测校准曲线的绘制
49.取探针溶液2ml，加入0-28μl尿素标准溶液充分反应后测试荧光光谱。通过拟合尿素浓度和荧光强度比i
540
/i
654
得到校准曲线。
50.5、定量检测溶液中的尿素
51.取探针溶液2ml，加入10μl待检测溶液充分反应后测试荧光光谱。记录荧光强度比i
540
/i
654
并根据校准曲线计算得到待检测溶液中尿素的浓度。
52.实施例2：
53.1、核壳结构上转换纳米粒子的制备
54.本步骤的制备过程同实施例1。
55.2、上转换荧光探针的制备
56.本步骤的制备过程同实施例1。
57.3、尿素传感贴片的制备
58.将3g丙烯酰胺、0.05g n,n
’‑
亚甲基双(丙烯酰胺)和0.05g k2s2o8溶解在30ml去离子水中，然后加入10ml先前合成的上转换荧光探针溶液，并通过超声混合均匀。随后，用移液器将50μl temed加入到上述溶液中，然后注入模具中。待水凝胶成型后脱模获得尿素传感水凝胶。
59.4、定量检测校准曲线的绘制
60.将不同浓度的尿素溶液和水凝胶传感贴片反应后，使用便携式传感平台和智能手机捕获其上转换发光，并进行rgb识别记录数值。通过拟合尿素浓度和g/r比值得到校准曲线。
61.5、定量检测汗液中的尿素
62.将水凝胶传感贴片佩戴在皮肤上，待运动出汗后通过智能手机捕获水凝胶上转换发光照片，并通过智能手机上安装的应用程序进行rgb识别。记录g/r比值并根据校准曲线计算得到汗液中尿素的浓度。