一种有丝分裂抑制剂、使用方法及制备四倍体金银花的方法与流程

1.本发明涉及植物培育技术领域，尤其涉及一种有丝分裂抑制剂、使用方法及制备四倍体金银花的方法。


背景技术：

2.金银花是人们非常熟悉的一种中药，为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花。金银花在医药制剂上应用得越来越广泛，证明它的药用价值是非常高的，充分说明金银花具有广泛的药材市场、空间等待着人们去开发。金银花适应性非常广，经过人工培育后的金银花苗，不仅有着非常强的抗逆性，而且还具有非常强的环境适应性，因此它能够在全国各地大部分地区种植。
3.金银花产量高，金银花苗在经过人工培育后，它的生长速度和产量都有了极为明显的提升，尤其是它的花蕾，经过培育后变得非常大。
4.金银花的经济价值很高，除了它是一种药用价值非常高的中药材，还可以用来制作盆景，制作化妆品和饮料。因此提高金银花的产量和质量是目前金银花发展的一个重要的瓶颈，通过对自然植物多倍体的挖掘与生长、生化特征的研究，人们认识到多倍体特别是异源多倍体具有营养器官变大、新陈代谢加快、次生代谢成分增加、抗逆性增强等许多明显的优势，因此，我们必须利用人工的手段对金银花染色体加倍，加倍后可使金银花植株的器官表现出巨型性，能增大植株的营养器官，增强生态适应性和对逆境的抗耐性。才能够满足药材市场的需求，获得有效成分含量高的金银花新品种，因而深入的利用各种方法使金银花的染色体加倍，并且从中选择效率高，简单的诱变技术，使金银花的多倍体加倍更有目的的进行，育成的多倍体不仅促进了物种间的遗传物质交流，丰富了物种多样性，而且为多倍体育种奠定了基础，对中药材新品种的选育具有重要的理论意义和应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种有丝分裂抑制剂、使用方法及制备四倍体金银花的方法，本发明采用秋水仙素 风油精处理二倍体金银花的幼芽，能阻碍有丝分裂中期纺锤丝的生成，形成染色体组加倍的细胞并得到四倍体金银花植株。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种有丝分裂抑制剂，包括秋水仙素溶液和风油精；所述秋水仙素溶液和风油精的体积比为30～50：50～30。
8.优选的，所述秋水仙素溶液的体积浓度为0.005～0.015％。
9.本发明还提供了一种有丝分裂抑制剂的使用方法，包括如下步骤：
10.(1)将有丝分裂抑制剂滴加到棉团中，然后用棉团包裹植物的花芽，密封；
11.(2)每隔8～12h向包裹着植物的花芽的棉团中补加一次有丝分裂抑制剂，重复5～9次。
12.优选的，步骤(1)每个植物花芽有丝分裂抑制剂的用量为0.6～1.2ml。
13.优选的，步骤(2)每次补加有丝分裂抑制剂的用量为0.1～0.3ml。
14.本发明还进一步提供了一种制备四倍体金银花的方法，包括如下步骤：
15.(1)使用有丝分裂抑制剂对金银花的花芽进行处理，剪下带有处理后花芽的枝条，清洗后接入分化培养基中分化培养，得金银花处理苗；
16.(2)将步骤(1)得到的金银花处理苗接种于生根培养基生根培养得到四倍体金银花苗。
17.优选的，步骤(1)所述分化培养的时间为18～22d，温度为18～20℃，光强为800～1200lux。
18.优选的，步骤(2)所述生根培养的时间为18～22d，温度为23～25℃，光强为2800～3200lux。
19.优选的，步骤(1)所述分化培养基为ms 1～2mg/l头孢。
20.优选的，步骤(2)所述生根培养基为ms 1.5～2.5mg/l iba。
21.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
22.1、本发明提供的有丝分裂抑制剂组分简单，处理效果好，处理二倍体金银花的幼芽，能阻碍有丝分裂中期纺锤丝的生成，形成染色体组加倍的细胞并得到四倍体金银花植株。
23.2、一般的秋水仙药物预处理的作用主要是阻止纺锤体的形成和导致染色体的收缩，使染色体变短，风油精和秋水仙素一样，也能起到阻止纺锤体的形成，获得分散好的染色体，可能是风油精的成分比较复杂所致，比如含有薄荷脑，水杨酸甲酯，桉叶油，樟脑等这些药物组合在一起对细胞产生一定的毒性，本发明就是利用对细胞的麻醉和毒害作用，另外还可使纺锤丝活动受阻。秋水仙素和风油精单个药品都有作用，风油精也可作为一种新的植物染色体预处理药物。但两者混在一起使用，现有技术未有记载，本发明是利用风油精中的油脂(按叶油)的吸附作用和低浓度处理可使染色体产生异常的结果，秋水仙素 风油精两个药物互补会收到意想不到的结果。四倍体的金银花比二倍体叶片厚，花大、花蕾的壁也厚，比二倍体长出1cm，这样采摘起来也快，因为金银花全部都是人工采摘，花大釆摘起来比较快，一人每天可采18-20公斤比二倍体要多7、8公斤，提高了采摘效率，根据多倍体的特点也是最重要的一点，四倍体金银花的绿原酸和木犀草苷的含量提高了。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
25.图1为实施例3正在长芽的叶苞；
26.图2为对实施例3生长的顶芽进行处理；
27.图3为实施例3用浸满秋水仙素和风油精的棉花团覆盖于叶芽上，用塑料袋包上，减少蒸发；
28.图4为用浸满秋水仙素和风油精的棉花团覆盖于叶芽上，用塑料袋包上，减少蒸发(重复实验)；
29.图5为实施例3将处理过后的叶芽用剪刀剪下来放入无菌水中清洗，然后放入事先配好的ms培养基中(培养基中含有1mg/l抗生素)；
30.图6为实施例3获得的四倍体金银花染色体4n＝36；
31.图7为对照组染色体2n＝18；
32.图8为实施例3金银花的生根培养过程；
33.图9为实施例3移栽后的金银花苗；
34.图10为实施例3金银花四倍体的花；
35.图11为对照组二倍体的花。
具体实施方式
36.本发明提供了一种有丝分裂抑制剂，包括秋水仙素溶液和风油精；所述秋水仙素溶液和风油精的体积比为30～50：50～30；优选为34～46：46～34；进一步优选为38～42：42～38；更优选为1：1。
37.在本发明中，所述秋水仙素溶液的体积浓度为0.005～0.015％；优选为0.007～0.013％；进一步优选为0.009～0.011％；更优选为0.01％。
38.在本发明中，所述风油精为春蕾康抑菌液，购买于宿州市春尔康日用洗化有限公司。
39.本发明还提供了一种有丝分裂抑制剂的使用方法，包括如下步骤：
40.(1)将有丝分裂抑制剂滴加到棉团中，然后用棉团包裹植物的花芽，密封；
41.(2)每隔8～12h向包裹着植物的花芽的棉团中补加一次有丝分裂抑制剂，重复5～9次；优选为每隔9～11h向包裹着植物的花芽的棉团中补加一次有丝分裂抑制剂，重复6～8次；进一步优选为每隔10h向包裹着植物的花芽的棉团中补加一次有丝分裂抑制剂，重复7次。
42.在本发明中，步骤(1)每个植物花芽有丝分裂抑制剂的用量为0.6～1.2ml优选为0.7～1.1ml；进一步优选为0.8～1.0ml；更优选为0.9ml。
43.在本发明中，步骤(2)每次补加有丝分裂抑制剂的用量为0.1～0.3ml优选为0.2ml。
44.本发明还进一步提供了一种制备四倍体金银花的方法，包括如下步骤：
45.(1)使用有丝分裂抑制剂对金银花的花芽进行处理，剪下带有处理后花芽的枝条，清洗后接入分化培养基中分化培养，得金银花处理苗；
46.(2)将步骤(1)得到的金银花处理苗接种于生根培养基生根培养得到四倍体金银花苗。
47.在本发明中，步骤(1)所述分化培养的时间为18～22d；优选为19～21d；进一步优选为20d。
48.在本发明中，步骤(1)所述分化培养的温度为18～20℃；优选为19℃。
49.在本发明中，步骤(1)所述分化培养的光强为800～1200lux；优选为900～1100lux；进一步优选为1000lux。
50.在本发明中，步骤(2)所述生根培养的时间为18～22d；优选为19～21d；进一步优选为20d。
51.在本发明中，步骤(2)所述生根培养的温度为23～25℃；优选为24℃。
52.在本发明中，步骤(2)所述生根培养的光强为2800～3200lux；优选为2900～3100lux；进一步优选为3000lux。
53.在本发明中，步骤(1)所述分化培养基为ms 1～2mg/l头孢；优选为ms 1.5mg/l头孢。
54.在本发明中，步骤(2)所述生根培养基为ms 1.5～2.5mg/l iba；优选为ms 2mg/liba。
55.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
56.本发明所述风油精为春蕾康抑菌液，购买于宿州市春尔康日用洗化有限公司。
57.实施例1
58.一种四倍体金银花的培育方法，步骤如下：
59.(1)将体积浓度为0.005％的秋水仙素溶液和风油精按体积比为30：50混合，得有丝分裂抑制剂；
60.(2)将步骤(1)得到的有丝分裂抑制剂滴加0.6ml到棉团中，然后用棉团包裹金银花的花芽，密封；
61.(3)每隔8h向包裹着金银花的花芽的棉团中补加一次有丝分裂抑制剂0.1ml，重复5次；
62.(4)剪下带有处理后花芽的枝条，清洗后接入分化培养基中分化培养，得金银花处理苗；
63.(5)将步骤(1)得到的金银花处理苗接种于生根培养基生根培养得到四倍体金银花苗；
64.所述分化培养的时间为18d，温度为18℃，光强为800lux；
65.所述生根培养的时间为18d，温度为23℃，光强为2800lux；
66.所述分化培养基为ms 1mg/l头孢；
67.所述生根培养基为ms 1.5mg/l iba。
68.实施例2
69.一种四倍体金银花的培育方法，步骤如下：
70.(1)将体积浓度为0.015％的秋水仙素溶液和风油精按体积比为50：30混合，得有丝分裂抑制剂；
71.(2)将步骤(1)得到的有丝分裂抑制剂滴加1.2ml到棉团中，然后用棉团包裹金银花的花芽，密封；
72.(3)每隔12h向包裹着金银花的花芽的棉团中补加一次有丝分裂抑制剂0.3ml，重复9次；
73.(4)剪下带有处理后花芽的枝条，清洗后接入分化培养基中分化培养，得金银花处理苗；
74.(5)将步骤(1)得到的金银花处理苗接种于生根培养基生根培养得到四倍体金银花苗；
75.所述分化培养的时间为22d，温度为20℃，光强为1200lux；
76.所述生根培养的时间为22d，温度为25℃，光强为3200lux；
77.所述分化培养基为ms 2mg/l头孢；
78.所述生根培养基为ms 2.5mg/l iba。
79.实施例3
80.一种四倍体金银花的培育方法，步骤如下：
81.(1)将体积浓度为0.01％的秋水仙素溶液和风油精按体积比为1：1混合，得有丝分裂抑制剂；
82.(2)将步骤(1)得到的有丝分裂抑制剂滴加0.9ml到棉团中，然后用棉团包裹金银花的花芽，密封；
83.(3)每隔10h向包裹着金银花的花芽的棉团中补加一次有丝分裂抑制剂0.2ml，重复7次；
84.(4)剪下带有处理后花芽的枝条，清洗后接入分化培养基中分化培养，得金银花处理苗；
85.(5)将步骤(1)得到的金银花处理苗接种于生根培养基生根培养得到四倍体金银花苗；
86.所述分化培养的时间为20d，温度为19℃，光强为1000lux；
87.所述生根培养的时间为20d，温度为24℃，光强为3000lux；
88.所述分化培养基为ms 1.5mg/l头孢；
89.所述生根培养基为ms 2mg/l iba。
90.实验例1
91.染色体鉴定
92.对照组：与实施例3相比，仅未经有丝分裂抑制剂处理，其他方法与实施例3完全相同，得到的金银花根尖作为对照组，其染色体鉴定方法也与实施例3相同。
93.(1)从实施例3和对照组得到的组培瓶中选择分裂旺盛的根尖，用镊子将根尖取下，放入事先配好装在1ml离心管的饱和对二氯代苯溶液中，暗处理3小时(温度18℃)。
94.(2)将处理液倒掉，倒入事先配好的固定液里(3甲醇：1冰乙酸)固定2小时以上。
95.(3)清洗三次，每次5min。
96.(4)将根尖放入事先配好0.1n hcl的0.2ml的离心管里，45℃处理30min。
97.(5)将盐酸溶液倒掉，用蒸馏水洗4次，直至无盐酸存在，否则对后面的染色有一定的影响。
98.(6)将清洗好的根尖放入事先配好的卡宝品红染色液里染色过夜。
99.(7)压片：用镊子小心从染料中取出根尖置于载玻片上，用刀片截除根冠和伸长区部分，只留1mm长的分生区，用镊子取少量染料到载玻片的材料上，盖22mm
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22mm盖片后马上用右手食指指甲在材料处轻敲一下，于显微镜下检查材料中是否有分裂相，如果有则可进行以下操作。左手中指和食指戴上指套(也可戴乳胶手套)，用左手中指和食指轻轻压住盖片左边两角，以免盖片错动，将双面刀片轻轻插入盖片的右上角，这样染料左右就形成一个斜面，用竹签的尖端轻轻敲击盖片有材料的地方，使材料逐渐散开，直到看不到大的组织块为止，轻轻把刀片取出，左手按紧盖片左边两角，再次用竹签尖端敲击盖片所有的部分，盖片上加一片滤纸用右手食指先轻轻用力然后逐渐加力垂直按压吸出多余染料，最后用大
拇指将盖片压实。
100.(8)镜检及显微摄影。在显微镜下仔细进行镜检，选择分散良好的完整细胞，用ccd拍照(图6，图7)。
101.(9)将染色体鉴定获得的四倍体材料移栽到基质土里(基质土为市场买的丹麦营养土3份 蛭石1份)见图9。
102.(10)待小苗成活后可以移植到大花盆里或移栽到土里。
103.(11)获得的四倍体材料叶片比较大、厚，花也比较大(见图10和图11)。
104.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。