抑制SNARE复合物形成的肽及其用途的制作方法

抑制snare复合物形成的肽及其用途
技术领域
1.涉及一种抑制snare复合物形成的肽及其用途。


背景技术：

2.snare复合物是一种包括snap-25、突触融合蛋白(syntaxin)以及vamp2的复合物，其与神经递质的释放相关联。在突触中，神经递质的释放与突触囊泡和神经元质膜(neuronal plasma membrane)的融合相关联，并且需要经共同作用以形成突触融合复合物的多种蛋白质。这种蛋白质被统称为snare蛋白，其包括snap-25、突触融合蛋白以及小突触泡蛋白(synaptobrevin)。小突触泡蛋白也被称作囊泡相关膜蛋白2(vamp2，vesicle-associated membrane protein 2)。vamp2位于突触囊泡膜，而snap-25和突触融合蛋白则与细胞膜结合。钙的释放引起复合物形成，并将所述突触囊泡拉近所述细胞膜，从而使所述细胞膜融合。包括在所述囊泡中的神经递质因所述融合而释放到突触。所述神经递质可以包括乙酰胆碱或去甲肾上腺素等。目前仍需要能够有效抑制snare复合物形成的衍生自vamp2的肽，但是这种snare蛋白因皮肤的保护功能无法有效作用于皮肤。
3.另一方面，在将用于治疗的药物或蛋白质移动到细胞方面，正在尝试利用能够将靶蛋白转运到细胞中的具有载体作用的肽来将药物传递到细胞中。但是，并非所有蛋白质都与蛋白转导结构域形成融合蛋白，从而穿透到细胞中。例如，已发布的论文研究结果显示，与tat转导位点结合的蛋白质被引入到细胞中，但未显示出活性(sengoku，t.et al.experimental neurology188(2004)161-170，falnes p.o.et al.biochemistry 2001apr 10；40(14):4349-4358,以及daniele peroni et al.，neuroscience letters 421(2007)110-114)。即，即使将蛋白转导结构域与不易引入细胞的蛋白质进行融合，也无法断定融合的蛋白质被引入到细胞后显示出灵活的活性。


技术实现要素：

技术问题
4.一方面提供一种肽，其为细胞膜穿透肽与vamp2蛋白或vamp2蛋白的片段融合的肽。
5.另一方面提供一种编码所述肽的多核苷酸及包括其的载体和宿主细胞。
6.另一方面提供一种用于美白皮肤或改善皱纹的组合物或试剂盒，其包括所述肽。
7.另一方面提供一种美白个体的皮肤或改善皱纹的方法，其通过将所述肽施用于个体来实现。
8.另一方面提供一种利用所述肽来制备组合物的方法，所述组合物用于美白皮肤或改善皱纹。
9.另一方面提供所述肽在制备皮肤美白剂或皱纹改善剂方面的用途。
10.另一方面提供用作皮肤美白剂或皱纹改善剂的所述肽。技术方案
11.一方面提供一种肽，其为细胞膜穿透肽与vamp2蛋白或vamp2蛋白的片段融合的肽。
12.vamp2蛋白可以由seq id no：13的氨基酸序列组成。所述片段可以是vamp2蛋白的n末端片段。所述片段可以包括seq id no：7的氨基酸序列(seq id no：13的第30位至第43位的氨基酸序列)。所述片段可以必须由seq id no：7的氨基酸序列组成。所述片段可以由seq id no：7的氨基酸序列组成。所述片段可以包括seq id no：4的氨基酸序列(seq id no：13的第30位至第46位的氨基酸序列)。所述片段可以必须由seq id no：4的氨基酸序列组成。所述片段可以由seq id no：4的氨基酸序列组成。所述氨基酸可以是d-氨基酸或l-氨基酸。
13.术语“包括(comprising)～”与“含有”或“特征在于”相同地使用，在组合物或方法中不排除未提及的另外的组分要素或方法步骤等。术语“由～组成(consisting of)”与“由～构成”相同地使用，其意指排除未另外描述的附加要素、步骤或组分等。术语“必须组成(consisting essentially of)”或“必须构成”意指，在组合物或方法中，包括描述的组分要素或步骤的同时，还包括实际对其基本特性不产生影响的组分要素或步骤等。
14.所述肽的n末端或c末端的氨基酸可以具有可逆化学修饰。所述修饰可以包括谷氨酸和天冬氨酸的羧基的酯化。氨基酸的负电荷可因所述修饰被去除，并且疏水性得到提高。由此，修饰肽的稳定性、脂溶性等生物利用度得到提高，并使其经血脑屏障和上皮组织容易地通过。另外，所述修饰可以包括氨基酸羧基的酰胺化。所述肽的n末端氨基酸可以被乙酰化。所述肽的c末端氨基酸可以被酰胺化。所述修饰可以在体内或细胞中被酯酶等水解。
15.所述肽可以抑制包括snap-25、突触融合蛋白以及vamp2的snare复合物的形成，从而抑制神经递质的释放。在突触中，神经递质的释放与突触囊泡和神经元质膜(neuronal plasma membrane)的融合相关联，并且需要经共同作用以形成突触融合复合物的多种蛋白质。这种蛋白质被统称为snare蛋白，其包括snap-25、突触融合蛋白以及小突触泡蛋白(synaptobrevin)。小突触泡蛋白(synaptobrevin)也被称作vamp2。vamp2位于突触囊泡膜，而snap-25和突触融合蛋白则与细胞膜结合。钙的释放引起复合物形成，并将所述突触囊泡拉近所述细胞膜，从而使所述细胞膜融合。包括在所述囊泡中的神经递质因所述融合释放到突触。所述神经递质可以包括乙酰胆碱或去甲肾上腺素等。所述肽通过模仿vamp2来抑制snare复合物，从而抑制神经递质释放到突触。由此，所述肽能够使由于所述神经递质释放到突触而引起的各种症状得到弱化或改善。所述肽可以美白皮肤或改善皱纹。另外，所述肽可用于改善或治疗神经元胞吐介导的症状。所述症状可以是痉挛性疾病(spastic ailments)。所述痉挛性疾病可以是肌张力障碍(dystonia)、斜视(strabismus)、抽动(tics)、眼睑痉挛(blepharospasm)或面部脊柱侧凸(facial scoliosis)。
16.所述肽可通过经典的固相化学肽合成方法来得到。另外，所述肽可通过基于重组dna技术的方法来得到。例如，所述方法可以包括将编码所述肽的多核苷酸引入适当的质粒或载体后将其引入宿主细胞，培养所得细胞以使培养物中形成所述肽，然后选择性地纯化所述肽。
17.所述肽可以与细胞膜穿透肽融合。所述细胞膜穿透肽可以提高与其融合的所述肽穿透细胞膜。融合的肽可以是vamp2蛋白或其片段的n末端与细胞膜穿透肽的c末端融合的肽。所述细胞膜穿透肽可以选自由td1、imt-p8、transkin、vp2-2、rbd-1、sn25-2、stx-1以及
tdb-1所组成的组。所述imt-p8可以必须由seq id no：8的氨基酸序列组成。所述imt-p8可以由seq id no：8的氨基酸序列组成。
18.在本说明书中，应理解所述肽不仅包括肽，还包括其盐。所述盐可以是药学上或化妆品学上可接受的所述肽的盐。
19.另一方面提供一种用于美白皮肤或改善皱纹的组合物，其包括作为活性成分的上述肽。
20.所述组合物可以进一步包括药学上或化妆品学上可接受的载体。所述载体可以是稀释剂或赋形剂。所述载体可以是抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料以及香料等。所述稀释剂可以是水、缓冲液或盐水。
21.另外，所述组合物可以进一步包括药学上或化妆品学上可接受的佐剂。
22.所述组合物可以是化妆料或者药学上或食品学上的组合物。
23.所述组合物可以具有任意剂型，例如，可以是溶液、悬浮液、乳剂、糊剂(paste)、凝胶、乳霜、乳液、粉剂、香皂、含有表面活性剂的清洁剂、油、粉底、乳液粉底、蜡粉底以及喷雾剂中的任意一种剂型。
24.当所述剂型为糊剂、乳霜以及凝胶时，可以包括作为载体组分的动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、二氧化硅、滑石以及氧化锌中的至少一种。
25.当所述剂型为粉剂和喷雾剂时，所述载体可以是乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉中的至少一种。特别地，当所述剂型为喷雾剂时，所述组合物可以进一步包括氯氟氰、丙烷/丁烷以及二甲醚等推进剂。
26.当所述剂型为溶液和乳剂时，所述载体可以包括溶剂、增溶剂以及乳化剂中的至少一种。所述载体可以是例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇以及山梨糖醇酐脂肪酸酯中的至少一种。
27.当所述剂型为悬浮液时，所述载体可以是水、乙醇以及丙二醇等液体稀释剂，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯以及聚氧乙烯山梨坦酯等悬浮剂，微晶纤维素、氢氧化铝氧化物(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂以及黄蓍胶中的至少一种。
28.所述肽的含量可以是用于美白皮肤或改善皱纹的有效量。所述含量可以是例如，基于所述组合物重量的0.001％至95％、0.001％至70％、0.001％至50％或0.01％至50％。
29.另一方面提供一种用于美白皮肤或改善皱纹的试剂盒，其包括上述肽。
30.所述试剂盒可以进一步包括选自由载体和佐剂组成的组中的至少一种。另外，所述试剂盒可以进一步包括说明书，所述说明书中描述将所述肽用于美白皮肤或改善皱纹的过程。
31.另一方面提供一种美白个体的皮肤或改善皱纹的方法，其包括将用于美白皮肤或改善皱纹有效量的上述肽施用于个体。
32.所述肽可具有自身形式或上述组合物的形式。
33.所述施用可以通过任意途径施用。所述施用可以是口服施用或肠胃外施用。所述施用可以是施用于鼻腔、黏膜或皮肤。所述个可以是人类或非人类动物，例如，哺乳动物。所述方法可以是化妆方法。
34.另一方面提供一种多核苷酸，其编码上述肽。
35.另一方面提供一种载体，其包括所述多核苷酸。所述载体可以包括任意的用于传递所述多核苷酸的物质。所述载体可以包括核酸构建体、质粒或病毒衍生的载体。所述载体可以是表达载体，例如，能够在哺乳动物中表达的表达载体。
36.另一方面提供一种重组宿主细胞，其包括所述多核苷酸。所述宿主细胞可以是细菌或动物细胞。所述动物细胞可以是诸如中国仓鼠卵巢细胞(cho，chinese hamster ovary cell)等已知动物细胞。
37.另一方面提供一种用于抑制snare复合物形成的组合物，其包括作为活性成分的上述肽，所述snare包括snap-25、突触融合蛋白以及vamp2。所述组合物可以进一步包括载体或佐剂。所述组合物可以是化妆料，药学上或食品学上的组合物。
38.所述组合物可用于改善或治疗神经元胞吐介导的症状。所述症状可以是痉挛性疾病(spastic ailments)。所述痉挛性疾病可以是肌张力障碍(dystonia)、斜视(strabismus)、抽动(tics)、眼睑痉挛(blepharospasm)或面部脊柱侧凸(facial scoliosis)。
39.所述肽的含量、载体或佐剂如上所述。
40.另一方面提供一种用于抑制snare复合物形成的试剂盒，其包括上述肽，所述snare包括snap-25、突触融合蛋白以及vamp2。所述试剂盒可以进一步包括载体和佐剂中的至少一种。
41.另一方面提供一种抑制个体中形成snare复合物的方法，所述方法包括将上述肽施用于个体。
42.所述方法可用于改善或治疗神经元胞吐介导的症状。所述症状可以是痉挛性疾病(spastic ailments)。所述痉挛性疾病可以是肌张力障碍(dystonia)、斜视(strabismus)、抽动(tics)、眼睑痉挛(blepharospasm)或面部脊柱侧凸(facial scoliosis)。
43.所述肽可具有肽的形式或包括肽的组合物的形式。所述肽的施用量可以是能够抑制个体中形成snare复合物的有效量。
44.另一方面提供一种用于美白皮肤或改善皱纹的组合物的制备方法，其包括将所述肽与选自由稀释剂、赋形剂、载体以及佐剂所组成的组中的至少一种进行混合。
45.另一方面提供所述肽在制备皮肤美白剂或皱纹改善剂方面的用途。
46.另一方面提供用作皮肤美白剂或皱纹改善剂的所述肽。有益效果
47.根据一方面的肽，其可用于美白皮肤或改善皱纹。
48.根据一方面的编码所述肽的多核苷酸以及包括其的载体和宿主细胞，其可用于生产所述肽。
49.根据一方面的包括所述肽的组合物或试剂盒，其可用于美白皮肤或改善皱纹，或者改善或治疗神经元胞吐介导的症状。
50.根据一方面的方法，其可以有效美白个体的皮肤或改善皱纹，或者有效改善或治疗神经元胞吐介导的症状。
附图说明
51.图1是显示7种融合肽对pc12细胞中的去甲肾上腺素分泌影响的图。
52.图2是显示融合肽c2-p4和p4对pc12细胞中的去甲肾上腺素分泌影响的图。
53.图3是显示c2-p4的细胞毒性实验结果的图。
54.图4是显示c2-p4对皮肤刺激影响的检测结果的图。
55.图5是显示c2-p4对细胞中黑色素水平影响的检测结果的图。
56.图6是显示c2-p4对培养基中黑色素水平影响的检测结果的图。
57.图7显示在有c2-p4和α-msh时的mitf基因的mrna表达水平。
具体实施方式
58.以下，通过实施例进一步详细描述本发明。但是，这些实施例仅用于示例性描述，本发明的范围并不限于此。
59.实施例和比较例：选择具有神经递质分泌抑制能力的候选肽和用于比较的肽
60.从构成snare复合物的蛋白snap-25、突触融合蛋白1a以及vamp2中选择7个肽片段。表1显示7种候选肽和用于比较的肽。p1是阿基瑞林(argireline)的氨基酸序列。
61.表1
62.如表1所示，p1至p7的肽为由6个至17个均衍生自人类snap-25、突触融合蛋白1a以及vamp2氨基酸序列的氨基酸所组成的肽。在表1中，括号内的数字表示所述肽的第一个氨基酸和最后一个氨基酸在每个蛋白质的氨基酸序列中的位置。另外，制备所述p1至p7的肽的n末端与细胞膜穿透肽的c末端连接的融合肽。具体地，所述细胞膜穿透肽使用由seq id no：8的氨基酸序列所组成的imt-p8肽。将这些融合肽命名为c2-p1，c2-p2，c2-p3，c2-p4，c2-p5，c2-p6以及c2-p7。所述p1至p7中的肽委托韩国lugen sci co，ltd进行化学合成。另外，c2-p1，c2-p2，c2-p3，c2-p4，c2-p5，c2-p6以及c2-p7的融合肽同样委托韩国lugen sci co，ltd通过化学合成方法来制备(c2-p4：seq id no：14，c2-p7：seq id no：15)。实验例1：检测神经递质的抑制能力
63.确认7中融合肽是否通过抑制snare复合物的形成来抑制神经递质分泌。所述神经递质选择了去甲肾上腺素。
64.(1)在神经细胞中，7种融合肽对去甲肾上腺素分泌的影响
65.在涂有基质胶的t-75培养瓶中，将pc12细胞(korean cell line bank)在rpmi 1640培养基中以37℃培养72小时，所述rpmi 1640培养基包括10％马血清和抗生素antibiotic-antimycotic(gibco，penicillin 10000units/ml，streptomycin 10000μg/ml，(amphotericin b 25μg/ml)。pc12细胞是衍生自发生在白鼠肾上腺髓质(adrenal medulla)中的嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)的细胞株。由于在肾上腺髓质中发挥儿茶酚胺分泌作用的嗜铬细胞(chromaffin cells)已分化而不会分裂，因此为了研究嗜铬细胞，通常使用可培养的pc12细胞。
66.用胰蛋白酶-edta从培养瓶中分离培养终止的pc-12细胞后，在1500rpm下离心3分钟并收集细胞。将收集的细胞以1
×
105cell/well的浓度接种到1ml的rpmi 1640培养基中，然后在涂有基质胶的48-孔板、37℃下培养24小时，所述rpmi 1640培养基包括10％马血清和所述抗生素。然后，将每个实验组的肽，即，7种融合肽以20um的浓度添加至未添加任何物质的所述rpmi 1640培养基中培养2小时。每个实验组利用krebs缓冲液(118mm nacl、1.2mm mgso4、2.5mm cacl2、5mm kcl、24mm nahco2、2mm kh2po4、11mm的右旋糖、ph7.4)洗涤两次，并在含有高钾离子的krebs缓冲液(56mm nacl、1.2mm mgso4、2.5mm cacl2、68mm kcl、24mm nahco3、2mm kh2po4、11mm的右旋糖、ph7.4)中以37℃孵育30分钟以诱导去极化。被诱导去极化的样品使用去甲肾上腺素elisa试剂盒(abnova cat#ka1891)进行酶联免疫吸附剂测定(elisa)，从而检测去甲肾上腺素的分泌量。具体地，洗涤被诱导去极化的试样后，培养基从板的孔中被去除进而只留有细胞。为了使细胞去极化，将含有钾离子的krebs缓冲液放入板中从而人为地释放神经递质，通过elisa检测从细胞中释放到krebs缓冲液的神经递质。
67.其结果示于图1。图1是显示7种融合肽对pc12细胞中的去甲肾上腺素分泌影响的图。如图1所示，相较于未处理组，确认在处理c2-p4肽合c2-p7肽时，神经递质的分泌率分别被抑制在35％和56％水平。在7种融合肽中，c2-p4肽对神经递质分泌的抑制作用最大。
68.(2)比较c2-p4和p4在神经细胞中的神经递质分泌抑制能力
69.在涂有基质胶的t-75培养瓶中，将pc12细胞(korean cell line bank)在rpmi 1640培养基中以37℃培养72小时，所述rpmi 1640培养基包括10％马血清和抗生素antibiotic-antimycotic(gibco，penicillin 10000units/ml，streptomycin 10000μg/ml，(amphotericin b)25μg/ml)。pc12细胞是衍生自发生在白鼠的肾上腺髓质(adrenal medulla)中的嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)的细胞株。由于在肾上腺髓质中发挥儿茶酚胺分泌作用的嗜铬细胞(chromaffin cells)已分化而不会分裂，因此为了研究嗜铬细胞，通常使用可培养的pc12细胞。
70.用胰蛋白酶-edta从培养瓶中分离培养终止的pc-12细胞后，在1500rpm下离心3分钟并收集细胞。将收集的细胞以1
×
105cell/well的浓度接种到1ml的rpmi 1640培养基中，然后在涂有基质胶的48-孔板、37℃下培养24小时，所述rpmi 1640培养基包括10％马血清和所述抗生素。然后，分别将p4和c2-p4融合肽以20um的浓度添加至未添加任何物质的所述rpmi 1640培养基中培养2小时。每个实验组利用krebs缓冲液(118mm nacl、1.2mm mgso4、2.5mm cacl2、5mm kcl、24mm nahco2、2mm kh2po4、11mm的右旋糖、ph7.4)洗涤两次，并在含有高钾离子的krebs缓冲液(56mm nacl、1.2mm mgso4、2.5mm cacl2、68mm kcl、24mm nahco3、2mm kh2po4、11mm的右旋糖、ph7.4)中以37℃孵育30分钟以诱导去极化。被诱导去极
化的样品使用去甲肾上腺素elisa试剂盒(abnova cat#ka1891)进行酶联免疫吸附剂测定(elisa)，从而检测去甲肾上腺素的分泌量。具体地，洗涤被诱导去极化的试样后，培养基从板的孔中被去除进而只留有细胞。为了使细胞去极化，将含有钾离子的krebs缓冲液放入板中从而人为地释放神经递质，通过elisa检测从细胞中释放到krebs缓冲液的神经递质。
71.其结果示于图2。图2是显示融合肽c2-p4和p4对pc12细胞中的去甲肾上腺素分泌影响的图。如图2所示，相较于未处理组，p4和c2-p4的神经递质分泌率分别在75％和41％水平。即，融合细胞膜穿透肽的c2-p4的神经递质分泌率比未融合细胞膜穿透肽的p4低34％。
72.实验例2：确认选择的肽的毒性
73.(1)原料物质毒性实验：mtt分析
74.在96-孔板中，将从korean cell line bank购买的b16-f10细胞以1
×
104cell/well的浓度接种到100ul的含有10％fbs的dmem培养基中培养48小时。b16-f10细胞是衍生自小鼠的鼠黑色素瘤(melanoma)细胞株。该细胞是粘附性(adherent)的并具有上皮形态(epithelial morphology)。然后，用dmem培养液分别以12.5um、25um以及50um浓度稀释c2-p4肽并进行替换后培养48小时。将板以1000rpm离心10分钟后去除培养液。用pbs洗涤2次每个孔，然后添加0.5mg/ml的用dmem培养基稀释而成的mtt溶液。在37℃、5％co2培养机中培养2小时。将板以1000rpm离心10分钟后去除mtt溶液。用pbs洗涤2次每个孔，然后添加150ul的dmso以溶解生产的甲臜。将所述板放入spectra max i3仪器，检测每个孔中的试样在590nm下的吸光度。
75.其结果示于图3。图3是显示c2-p4的细胞毒性实验结果的图。如图3所示，在mtt分析法中，相较于作为乱序肽(scrambled peptide)的阴性对照组，c2-p4显示出相似的细胞存活率，并且无细胞毒性。
76.(2)皮肤刺激度实验
77.将1xpbs和5％sds均匀涂布于从tego science(韩国)购买的人工皮肤(neoderm-ed)，从而分别制成阴性对照组和阳性对照组。将20ul的100ug/ml c2-p4肽均匀涂布于实验组。将其置于室温中反应15分钟，然后转移到12-孔培养板的孔中并在37℃、5％co2培养机中培养15分钟。用pbs洗涤2次反应终止的人工皮肤，然后将其转移到12-孔培养板的孔中并培养42小时。培养终止后添加2ml的0.3mg/ml mtt溶液并培养3小时细胞。在所述板的每个孔中的试样中添加0.04n hcl-异丙醇进行脱色后放入spectra max i3，然后检测每个孔中的试样在580nm下的吸光度。
78.其结果示于图4。图4是显示c2-p4对皮肤刺激影响的检测结果的图。如图4所示，c2-p4细胞存活率为约85％，是无刺激性的。其中，相较于阴性对照组，细胞存活率大于或等于50％时定为无刺激。
79.实验例3：确认选择的肽的美白效果
80.(1)检测处理c2-p4后细胞内部黑色素的量
81.在24-孔板中，将从korean cell line bank购买的b16-f10细胞以1
×
104cell/well的浓度接种到1ml的含有10％fbs的dmem培养基中，并在37℃、5％co2培养机中培养48小时，已形成细胞单层。然后，用添加10％fbs和5um以及10um的c2-p4肽的dmem(phenol-red free)培养基替换所述培养基，并在37℃、5％co2培养机中培养48小时。用pbs洗涤2次培养终止的实验组，从而用胰蛋白酶-edta得到细胞。在每个孔中的细胞单层中放入添加有10％
dmso的1n naoh溶液，并在95℃下孵育20分钟以溶解黑色素和细胞，然后将其放入spectra max i3仪器中检测每个孔中的试样在490nm下的吸光度。
82.其结果示于图5。图5是显示c2-p4对细胞中黑色素水平影响的检测结果的图。如图5所示，相较于阴性对照组，在有5um、10um的c2-p4时为180％和250％，显著提高细胞中的黑色素水平。
83.(2)检测处理c2-p4后培养基中黑色素的量
84.另外，在(1)中培养48小时后去除细胞的培养物中，放入添加有10％dmso的1n naoh溶液，并在95℃下使黑色素和细胞溶解20分钟后，检测其在490nm下的吸光度。
85.其结果示于图6。图6是显示c2-p4对培养基中黑色素水平影响的检测结果的图。如图6所示，相较于阴性对照组，在有5um、10um的c2-p4时为107％和105％，培养基中的黑色素水平未提高。
86.根据图5和图6，在有c2-p4的情况下细胞内部的黑色素水平提高，但培养基中的黑色素水平未提高，因此表明黑色素向细胞外部的分泌由于c2-p4而受到抑制。
87.(3)检测处理c2-p4后的mitf基因活性
88.在6-孔板中，将从korean cell line bank购买的b16-f10细胞以1
×
105cells/well的浓度接种到3ml的含有10％fbs的dmem培养基中，并在37℃、5％co2培养机中培养24小时，已形成细胞单层。阴性对照组替换为dmem培养基，肽处理实验组和α-msh实验组分别替换为10um的肽以及含有50nm的α-msh的dmem培养基后培养48小时。每个实验组用pbs洗涤1次并利用胰蛋白酶-edta得到细胞，然后在1500rpm下离心5分钟仅得到细胞。利用trizol从得到的细胞中提取rna，并利用逆转录酶分别合成1000ng的cdna。利用100ng分别合成的cdna，通过实时(real-time)pcr确认gapdh和α-msh的表达量。用于实时pcr的引物为seq id no：9和seq id no：10，或seq id no：11和seq id no：12的多核苷酸组。
89.其结果示于图7和表2。图7显示在有c2-p4和α-msh时的mitf基因的mrna表达水平。
90.[表2]
[0091]
如图7和表2所示，证实在b16-f10细胞中，因c2-p4肽引起的黑色素生成无明显变化，与此相反，细胞的黑色素分泌因c2-p4肽而受到限制。已知小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor，mift)可调节人类黑素细胞(melanocyte)中正常黑色素合成所必要的各种基因的表达。如图7和表2所示，c2-p4肽对于较大地影响黑色素形成的mift基因的表达无较大影响。这表示c2-p4肽通过抑制向细胞外部分泌而不是提高黑色素生成，使黑色素在细胞内部积累。