针对hiv的广泛中和抗体
技术领域：
：1.本发明涉及针对人类免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点的单克隆人抗体或其结合片段、包含此类单克隆人抗体或其结合片段的药物组合物、包含此类抗体或其结合片段的试剂盒，以及所述单克隆人抗体或其结合片段和所述药物组合物和所述试剂盒用作药物、和用于治疗或预防由人类免疫学缺陷病毒hiv-1导致的疾病的用途。
背景技术：
：：2.靶向hiv-1包膜蛋白(env)的广泛中和抗体(bnab)可以预防动物模型中的感染，并且正在临床试验中对其进行对于被动免疫的研究。此外，已表明bnab在hiv-1感染个体中在中断抗逆转录病毒治疗(art)后抑制病毒血症并延迟病毒反弹。3.虽然这些结果强调了bnab的显著临床潜力，但是先前存在的和重新的hiv-1抗性导致治疗失败并且可能强烈限制bnab在人中的应用。因此，预防和克服病毒逃逸的策略对于有效实施用于hiv-1预防和治疗的bnab介导的方法是至关重要的(gruell,h.,和klein,f.(2018).antibody-mediatedpreventionandtreatmentofhiv-1infection.retrovirology15,73)。4.近年来，已从hiv-1感染的供体中分离出强力的bnab，其靶向hiv-1包膜(env)三聚体上不同的易损表位。这些表位包括cd4结合位点(cd4b)、v1/v2环、v3环聚糖斑(glycanpatch)、膜-近端外部区域、以及gp120和gp41env亚基之间的界面。5.在这些位点中，cd4b是特别感兴趣的，因为cd4起到病毒进入的主要受体的作用。大部分强力的cd4bbnab的特征在于使用免疫球蛋白重链基因片段igvh1-2*02、高体细胞超突变(somatichypermutation)水平、轻链的五残基互补决定区3(cdrl3)、和env-cd4相互作用的模拟物。6.以原型抗体vrc01命名(wu,x.,yang,z.y.,li,y.,hogerkorp,c.m.,schief,w.r.,seaman,m.s.,zhou,t.,schmidt,s.d.,wu,l.,xu,l.,等(2010).rationaldesignofenvelopeidentifiesbroadlyneutralizinghumanmonoclonalantibodiestohiv-1.science329,856-861.)，这些抗体被称作vrc01类bnab。此类的其它成员包括3bnc117、nih45-46、n49-p7、n6、和vrc07-523。7.模拟cd4结合的其它bnab衍生自vh1-46基因片段。然而，与vh1-2衍生的bnab相比，迄今为止报道的vh1-46bnab具有较低的效力和宽度(breadth)，这限制了它们用于临床应用的潜力。例如，这类的最佳抗体之一ch235.12，在针对一大组hiv-1env毒株在体外试验时，与vrc01类bnabn6相比，其广泛性较小且效力低》10倍(bonsignori,m.,zhou,t.,sheng,z.,chen,l.,gao,f.,joyce,m.g.,ozorowski,g.,chuang,g.y.,schramm,c.a.,wiehe,k.,等(2016).maturationpathwayfromgermlinetobroadhiv-1neutralizerofacd4-mimicantibody.cell165,449-463.)。8.因此，已经进入临床试验的所有cd4bbnab都是vrc01类的成员(3bnc117、n6、vrc01、和vrc07-523)。然而，虽然从vrc01逃逸与病毒适应性(viralfitness)的降低有关，vrc01类单一疗法的作用仅是瞬时的，并且在临床试验(scheid,j.f.,horwitz,j.a.,bar-on,y.,kreider,e.f.,lu,c.l.,lorenzi,j.c.,feldmann,a.,braunschweig,m.,nogueira,l.,oliveira,t.,等(2016).hiv-1antibody3bnc117suppressesviralreboundinhumansduringtreatmentinterruption.nature535,556-560.)和hiv-1感染的动物模型(klein,f.,halper-stromberg,a.,horwitzj.a.,gruell,h.,scheidj.f.,bournazoss.,mouqueth.,spatzl.a.,diskinr.,abadira.,等(2012)hivtherapybyacombinationofbroadlyneutralizingantibodiesinhumanizedmice.nature492(7427),118-22)中都与病毒逃逸变体的快速出现相关。9.由于目前正在研究的已知bnab的这些缺点，仍然需要靶向cd4结合位点的hiv抗体，其效力和宽度超过已知经典vh1-2衍生的或vh1-46衍生的bnab，具有针对vrc01类逃逸变体的强力中和活性，并且当在hiv-1感染的生物体中试验时，有效限制病毒逃逸并维持病毒抑制。10.因此，本发明的一个目的是提供针对hiv-1的新的人单克隆抗体，其具有针对广泛选择的不同病毒株的广泛中和活性，并结合有针对此类病毒株的高中和效力。本发明的进一步的目的是提供针对hiv-1的新的人单克隆抗体，其针对表现此类逃逸突变的病毒显示出显著限制逃逸突变的发展并维持有效性。本发明的另一目的是提供针对hiv-1的新的人单克隆抗体，其在感染个体中赋予完全的病毒抑制、而在抗体单一疗法期间无明显的病毒反弹。此外，本发明的一个目的是提供针对cd4结合位点的新的人单克隆抗体，其具有良好的体内药代动力学性质。技术实现要素：11.这些目的通过如下文中说明的本发明的方面得到解决。12.根据本发明的第一方面，提供一种针对人类免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点的单克隆人抗体或其结合片段，其中所述抗体氨基酸序列包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段，其中所述抗体包含a)seqidno.47的重链氨基酸序列和seqidno.48的轻链氨基酸序列，或b)seqidno.49的重链氨基酸序列和seqidno.50的轻链氨基酸序列，其中seqidno.47至seqidno.50任意者中的x可以是任何氨基酸或无氨基酸，或与其为至少80％同一性的抗体序列。13.根据本发明的第一方面的优选实施方案，本发明的第一方面的选项b)的抗体包含fwr1中2aa的缺失。14.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至(upto)25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组(globalreferencepanel)的12种hiv-1分离参考毒株的至少11种毒株、优选所有12种毒株的中和。15.根据本发明的第一方面的仍另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组(multicladeviruspanel)中所包含的假病毒的至少89.9％(119中的107)、优选至少92.4％(119中的110)、更优选至少96.6％(119中的115)的中和。16.根据本发明的第一方面的优选实施方案，所述抗体或其结合片段当以多至25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组的中和毒株，表现小于0.3μg/ml、优选小于0.2μg/ml、更优选小于0.15μg/ml、甚至更优选小于0.1μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml、甚至更优选0.048μg/ml、甚至更优选0.035μg/ml的中和效力(中和毒株的几何平均数ic50)。17.根据本发明的第一方面的优选实施方案，所述抗体或其结合片段当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组的中和毒株，表现小于0.2μg/ml、优选小于0.1μg/ml、更优选小于0.08μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml的中和效力(中和毒株的几何平均数ic50)。18.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对hiv-1假病毒89-f1_2_25(89-f1_2_25env；genbank:hm215349.1)，表现小于0.05μg/ml、优选小于0.02μg/ml、甚至更优选小于0.01μg/ml的中和效力(ic50)。19.根据本发明的第一方面的仍另一优选实施方案，所述抗体或结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，以小于0.1μg/ml、优选小于0.05μg/ml的ic50浓度中和所有yu2假病毒变体，所述变体包含具有包膜突变n279k、n280y、g458d、g459d、或g471r(根据hiv-1hxb2包膜基因；genbank:k03455编码残基)之一的yu2包膜基因(genbank:m93258.1)。20.根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，导致在治疗4周后、优选治疗6周后、甚至更优选治疗8周后测定时，在治疗开始时具有至少5000个拷贝/ml血浆的hiv-1rna载量的经治疗小鼠的至少70％中，血浆中hiv-1rna载量与治疗开始时相比减少至少0.8log10、优选至少1.0log10。21.根据本发明的第一方面的上述实施方案的更优选实施方案，人源化小鼠通过以下预先处理4周：一次初始皮下注射1mg的3bnc117或vrc01或二者的组合，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的3bnc117或vrc01或二者的组合。22.根据本发明的第一方面的优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，不持续至少4周，导致介导对施用的抗体的抗性的cd4结合位点(环d，cd4结合环，β23链，v5环，和β24)中的一种或多种突变的发生。23.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，向nrg小鼠静脉内注射0.5mg的所述抗体或其结合片段导致注射后10天抗体或其结合片段的可检测血清水平为至少50μgigg/ml血清。24.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段不包含具有16或19个氨基酸长度的cdrh3。25.根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，所述抗体或其结合片段不包含具有18、20或21个氨基酸长度的cdrh3。26.根据本发明的第一方面的优选实施方案，所述抗体或其结合片段不包含如freund等,sci.transl.med.9,eaal2144(2017)中所记载的抗体nc37、nc133、ac40、ac41或ac72的氨基酸序列或不由其组成。27.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段包含来自包括以下的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，特别优选抗体1-18的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列。28.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段包含选自包括以下的组的一种抗体的重链和轻链的组合：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链和轻链的组合，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链和轻链的组合，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链和轻链的组合，特别优选抗体1-18的重链和轻链的组合。29.根据本发明的第二方面，提供一种药物组合物，其包含根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。30.根据本发明的第二方面的优选实施方案，所述药物组合物是用于人类受试者的疫苗组合物。31.根据本发明的第三方面，提供一种试剂盒，其包含根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、和容器。32.根据本发明的第四方面，提供根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、根据本发明的第二方面所述的药物组合物、或根据本发明的第三方面所述的试剂盒用作药物、优选地用作疫苗。33.根据本发明的第五方面，提供根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、根据本发明的第二方面所述的药物组合物、或根据本发明的第三方面所述的试剂盒用于治疗或预防人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病的用途，优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的用途。附图说明34.图1显示本发明的抗体在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对具有不同包膜氨基酸序列的一组12种全球性参考假病毒毒株(如decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的)的中和活性。测试的抗体表现针对中和毒株的高效力，并且中和至少92％(11/12)和多至所有测试的假病毒。35.图2显示在用增加量的竞争抗体(x轴)预培养后，竞争elisa中抗体1-18(图2a)、1-55(图2b)、和2-12(图2c)针对bg505sosip.664的hiv-1env蛋白的结合。在用cd4结合位点靶向抗体3bnc117、vrc01和n6预培养后，测试的抗体显示减少的与bg505sosip.664包膜蛋白的结合，表明抗体共有与cd4结合位点重叠的表位。36.图3显示在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，抗体针对具有不同hiv-1包膜氨基酸序列的119种假病毒的多进化枝组(如schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的)的中和活性(ic50)。显示了抗体1-18、1-55、和2-12、临床试验晚期的vh1-2衍生的cd4结合位点抗体(3bnc117、vrc01、和n6)、和v3环-靶向抗体(10-1074、pgt121)的数据。37.图4显示与其它vh1-46衍生的hiv-1中和抗体相比，抗体1-18、1-55、2-12的中和活性，对于针对一组总计62种hiv-1假病毒的结果可获得于抗体中和数据库catnap(yoon等,2015)。38.图5显示如通过tzm-bl细胞假病毒试验测定的，抗体针对具有不同包膜氨基酸序列的假病毒的选择的抗体的中和活性。39.图6显示如左图所示和如tzm-bl细胞假病毒中和试验中测定的，抗体1-18、1-55、和2-12针对一组具有不同包膜序列(cd40结合位点中单氨基酸突变)的hiv-1yu2假病毒的中和活性，显示了与cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、n6、和vh1-46衍生的抗体8anc131的比较。根据hiv-1hxb2参考毒株对突变的包膜残基进行编号。40.图7显示感染hiv-1yu2(具有替换为yu2的包膜基因的包膜基因的nl4-3病毒)的人源化小鼠中hiv-1rna血浆拷贝数(顶部)和它们的log10变化(底部，与基线(第-1天的hiv-1rna血浆拷贝数)相比较)。用每抗体1mg负载剂量(loadingdose)皮下处理小鼠，然后每3-4天皮下注射每抗体0.5mg。用已知的cd4b抗体3bnc117、vrc01、或两种抗体的组合处理的小鼠显示出病毒血症的短暂降低，随后是迅速的病毒反弹。相反，用单独的本发明的抗体1-18处理的小鼠在8周的治疗期间显示出病毒血症的持续降低。黑色虚线表示平均log10变化。41.图8显示在4周的抗体治疗后，通过对图7所示的所选小鼠进行单基因组测序而从血浆获得的hiv-1序列。对应于图7的小鼠id示于左侧。序列与yu2野生型序列的比对示于顶部。与yu2野生型序列一致的氨基酸序列由点表示，与yu2野生型序列相比的突变或缺失分别由氨基酸单字母代码或虚线来表示。在用已知cd4b抗体3bnc117、vrc01、或其组合处理的小鼠中，与yu2野生型序列相比的cd4结合位点表位(环d，β23链，v5环)中的突变与病毒反弹相关，而单独地用本发明的抗体1-18治疗4周后没有观察到此类突变。42.图9显示用cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、或二者的组合预处理(如图7所示)的感染hiv-1yu2(nl4-3/yu2)的人源化小鼠中hiv-1rna血浆拷贝数(顶部)和它们的log10变化(底部，与基线(第28天的hiv-1rna血浆拷贝数)相比)。治疗4周后，将抗体1-18增加至先前的治疗方案中，并继续治疗方案。皮下施用1mg负载剂量的1-18，然后每3天至4天施用0.5mg。尽管在用其它cd4结合位点抗体预处理和循环具有cd4结合位点中的突变的病毒变体后病毒反弹(见图8)，用抗体的1-18处理导致18/19小鼠中维持的病毒抑制。43.图10显示在第0天单次静脉内注射0.5mg的抗体后(箭头所示)，通过elisa测定的nrg小鼠中人igg的血清浓度。与已知cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、和45-46g54w相比，本发明的抗体1-18、1-55、和2-12显示抗体浓度的较慢的降低，这更类似于v3环靶向抗体10-1074，其在人体内具有比3bnc117更长的半衰期(mendoza等,2018)。44.图11显示如在tzm-bl细胞假病毒试验中确定的，抗体针对具有不同包膜氨基酸序列的假病毒的选择的中和活性(ic50)。选择假病毒组作为全球性hiv-1大流行病的多样性的代表(decamp等,2014)。将本发明的抗体与vh1-46衍生的cd4结合位点抗体8anc131进行比较。45.图12显示如在tzm-bl细胞假病毒试验中确定的，抗体分别针对6545.v4.c1和89-f1_2_25hiv-1假病毒株的中和活性(ic50)。将本发明的抗体与hiv-1中和cd4结合位点抗体n6、3bnc117、vrc01、vrc07、vrc07-523-ls、8anc131、nih45-46和nih45-46g54w相比较。46.图13显示与基线(第0天)相比，感染hiv-1bal(具有替换为hiv-1毒株bal的包膜基因的包膜基因的nl4-3病毒)的人源化小鼠中hiv-1rna血浆拷贝数log10变化。用每抗体1mg负载剂量皮下处理小鼠，然后每3-4天皮下注射每抗体0.5mg。用cd4结合位点抗体3bnc117或vrc01处理的小鼠表现出病毒血症的适度短暂降低，随后是快速的病毒反弹。相反，用本发明的抗体1-18处理的小鼠在6周的治疗期间显示出病毒血症的持续降低。未处理对照小鼠。黑色条纹线表示与基线相比的平均log10变化。数字通过各自的id表示单个小鼠。右边的表表示对于各个治疗组观察到的最大平均log10hiv-1rna变化、第21天log10hiv-1rna变化、和第42天log10hiv-1rna变化。具体实施方式47.本发明人已致力于解决本发明的问题并成功地发现了新的且有用的针对hiv-1的人单克隆抗体，其克服了已知抗体的缺点和不足。48.本文中，发明人描述了新的vh1-46和vκ3-20衍生的cd4结合位点抗体，其效力和宽度超过经典vh1-46和vh1-2衍生的bnab。观察到的高活性的结构基础被认为是由共同的结构性质引起的。这些性质是基于vh1-46和vκ3-20衍生的序列类似物的组合，其由显示对于它们的活性至关重要的残基的共有序列所限定。49.特别感兴趣的是，与两种最临床试验晚期的cd4bbnab3bnc117和vrc01相比，当在hiv-1感染的人源化小鼠中测试时，根据本发明的抗体有效限制病毒逃逸并保持针对vrc01类逃逸变体的中和活性和完全的病毒抑制。因此，本发明的抗体包括用于有效治疗和预防hiv-1感染的抗体介导策略为非常有希望的候选物。50.因此，本发明提供一种单克隆人抗体或其结合片段，其针对人类免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点，其中所述抗体序列包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段，其中所述抗体包含：a)重链序列[0051][0052]和轻链序列[0053][0054]或b)重链序列[0055][0056]和轻链序列[0057][0058]其中seqidno.47至seqidno.50任意者中的x可以是任何氨基酸或无氨基酸，或与其为至少80％同一性的抗体氨基酸序列。[0059]在本发明的上下文中，在本文产生和描述的抗体可以作为完整的单克隆人抗体或其任何功能性片段或结合片段使用和要求保护。优选地，所述单克隆人抗体或其任何类型的功能性片段或结合片段应当至少包含所述人单克隆抗体的重链的互补决定区(cdr)1至3和轻链的cdr1至3。[0060]本文所述的抗体序列的cdr区优选根据imgt的编号方案定义，imgt是chothia的编号方案的改编(immunogeneticsinformationlefranc等,nar27:209-212(1999)；http://www.imgt.org)。[0061]在一个优选实施方案中，抗体是保持结合特异性和中和传染性病原体的能力的单克隆抗体或其片段。在一个优选实施方案中，抗体是lgg1、lgg2、lgg3、或lgg4抗体。例如，抗体可以是包含任何人igg同种型(例如，lgg1、lgg2、lgg3、或lgg4)的fc结构域的抗体。[0062]任选地，抗原结合化合物由fab、fab'、fab'-sh、f(ab)2、fv、双特异抗体(diabody)、单链抗体片段、或含有多种不同抗体片段的多特异性抗体组成、或包含fab、fab'、fab'-sh、f(ab)2、fv、双特异抗体、单链抗体片段、或含有多种不同抗体片段的多特异性抗体。[0063]在本发明中，针对hiv-1的cd4结合位点的抗体或结合片段是指与不相关表位、蛋白或蛋白区域相比，抗体以至少10倍、更优选至少50倍、特别优选至少100倍增加的亲和力与hiv-1的gp120包膜糖蛋白内的cd4结合位点区域结合。通常，本文的术语cd4结合位点是指hiv-1的gp120包膜糖蛋白内的cd4结合位点区域。[0064]此外，在本发明中，包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段的抗体氨基酸序列分别是指基于所述基因片段和/或衍生自所述基因片段的抗体氨基酸序列。本领域中通常已知如何确定哪个vh或vκ基因片段用于组装抗体氨基酸序列。尽管所述基因片段的突变通常发生在天然抗体的组装中，但通过要求使用vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段用于组成特定抗体，本领域技术人员容易地看出记载哪些一级序列需求。[0065]因此，单克隆抗体或其结合片段应优选理解为包含可天然衍生自vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段的组合的序列。这优选包括所述基因片段的天然发生程度的突变形成。[0066]为了理解这两个片段对所要求保护的抗体的整体结构基础的意义和影响，应注意，vh1-46负责根据共有序列no.1的重链中总计131个氨基酸中的104个氨基酸，和负责根据共有序列no.3的重链中总计126个氨基酸中的96个氨基酸。[0067]类似地，vκ3-20占根据共有序列no.2的轻链中总计108个氨基酸中的96个氨基酸，和占根据共有序列no.4的轻链中总计111个氨基酸中的98个氨基酸。[0068]基于发明人能够鉴定的功能性抗体的数量，还可以配制两组共有序列用于包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段且针对hiv-1的cd4结合位点的抗体。这两组似乎代表不同的一级序列途径，以实现与cd4结合位点的高度有效结合、限制病毒逃逸以及病毒中和的宽度和效力。[0069]第一组序列由用于重链的根据seqidno.47的共有序列no.1和用于轻链的根据seqidno.48的共有序列no.2组成。本文已经研究了许多符合这些共有序列的个体化序列，由此获得的结果使得共有序列与给定片段的组合给出有效的结构指导以获得一组功能性抗体是合理的。此外，与第一组序列相符的抗体组的两个代表是抗体1-18和1-55，它们已经被更详细地研究。[0070]第二组序列由用于重链的根据seqidno.49的共有序列no.3和用于轻链的根据seqidno.50的共有序列no.2组成。同样，本文已经研究了许多个体化序列作为第二组共有序列的实例，由此获得的结果也使得这些共有序列与给定片段的组合给出有效的结构指导以获得功能性抗体是合理的。此外，与第二组序列相符的抗体组的一个代表是抗体2-12，其也已经被更详细地研究。[0071]关于本文所述的共有序列，氨基酸序列中的x或xaa可以代表任何氨基酸或无氨基酸。然而，基于所要求保护的抗体应当包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段的附加要求，本领域技术人员已明确，选择更受到形成了各个抗体的基础的这些基因片段的限制。[0072]通常，本文所述的单克隆人抗体或其结合片段进一步包含与如上定义的序列为至少80％同一性的抗体氨基酸序列，只要它们仍针对人免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点即可。这意味着包含具有抗体氨基酸序列的不干扰结构折叠和抗体对cd4结合位点的亲和力的不重要(trivial)突变的序列。[0073]对于技术人员来说，基于上述或公知常识来确定表现一定程度的同一性的抗体是否针对人免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点是一项微不足道的任务。[0074]根据本发明的两条序列之间的同一性百分数的确定是通过使用karlin和altschul(proc.natl.acad.sci.usa(1993)90:5873-5877)的数学算法完成的。这种算法是altschul等(j.mol.biol.(1990)215:403-410)的blastn和blastp程序的基础。用blastn程序进行blast核苷酸检索。为了获得用于比较目的的空位对齐，如altschul等(nucleicacidsres.(1997)25:3389-3402)所述使用gappedblast。当使用blast和gappedblast程序时，使用相应程序的默认参数。[0075]根据本发明的优选实施方案，抗体氨基酸序列形成本发明的一部分，其由与如上定义的和本文公开的序列为至少85％同一性、更优选至少90％同一性、甚至更优选至少95％同一性的核酸序列组成、或包含与如上定义的和本文公开的序列为至少85％同一性、更优选至少90％同一性、甚至更优选至少95％同一性的核酸序列。[0076]根据本发明的优选实施方案，本发明第一方面的选项b)的抗体包含fwr1中2aa的缺失。[0077]根据本发明的另一优选实施方案，单克隆人抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组的12种hiv-1分离参考毒株的至少11种毒株、优选所有12种毒株的中和。[0078]tzm-bl细胞假病毒中和试验是本领域和本发明所属
技术领域：
：中常用的高度标准化试验，用于分析抗体针对各种hiv-1毒株的中和效力。简言之，在添加tzm-bl靶细胞之前，将抗体和病毒株一起培养。这些细胞在成功感染的情况下表现出荧光素酶活性，导致细胞裂解后、在荧光素的存在下的可检测的发光信号。中和抗体能够防止感染并因此防止发光的产生。中和抗体的效力通过将病毒感染性降低特定量所需的抗体浓度来确定。[0079]在sarzotti-kelsoe等；jimmunolmethods.2014july；0:131–146.doi:10.1016/j.jim.2013.11.022中公开并详细记载了建立和使用该试验的标准化方法。本说明书单独地和与常见的现有技术相结合，使得本领域技术人员能够建立和确定本文所用的tzm-bl细胞假病毒中和试验的结论性读出(readout)。[0080]在decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中记载的全球性参考组包括12种hiv-1病毒变体的代表性选择。通常认为用该12种病毒组观察到的hiv-1血清中和活性的谱与用亚型匹配的病毒观察到的活性非常接近。此外，该组对于许多已知的广泛中和抗体的检测是高度灵敏的。用该组进行的研究允许可靠地预测给定抗体的中和宽度和/或效力。[0081]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组中所包含的假病毒的至少89.9％(119中的107)、优选至少92.4％(119中的110)、更优选至少96.6％(119中的115)的中和。[0082]根据schoofs等,2019或schoofs等,2019中引用的更全面的组用于通过测试大量的不同假病毒(即hiv-1毒株)来精确地鉴定宽度和效力。该大组通常被认为是所有主要循环hiv-1进化枝的代表，并且提供了关于所检测的抗体的中和能力的详细信息。[0083]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段当以多至25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组的中和毒株，表现小于0.3μg/ml、优选小于0.2μg/ml、更优选小于0.15μg/ml、甚至更优选小于0.1μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml、甚至更优选0.048μg/ml、甚至更优选0.035μg/ml的中和效力(几何平均数ic50)。[0084]本文所定义的中和效力优选仅考虑那些可以明确地确定为由相应抗体中和的病毒变体。基于明确中和的变体的选择，在中和的毒株中确定几何平均数ic50。[0085]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组的中和毒株，表现小于0.2μg/ml、优选小于0.1μg/ml、更优选小于0.08μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml的中和效力(几何平均数ic50)。[0086]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，抗体或其结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对hiv-1假病毒89-f1_2_25(89-f1_2_25env基因，genbank:hm215349.1)，表现小于0.05μg/ml、优选小于0.02μg/ml、更优选至多0.01μg/ml、甚至更优选小于0.01μg/ml的中和效力(ic50)。[0087]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，抗体或其结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对hiv-1假病毒6546.v4.c1(6546.v4.c1env基因，genbank:hm215332.1)，表现小于10μg/ml、优选小于1μg/ml、更优选小于0.5μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml、甚至更优选至多0.01μg/ml、特别优选小于0.01μg/ml的中和效力(ic50)。[0088]hiv-1假病毒89-f1_2_25似乎是最难以由已知cd4结合位点抗体中和的毒株之一。事实上，还没有先前已知的靶向cd4结合位点的抗体被证明以低于0.194μg/ml的ic50值成功中和所述假病毒。然而，根据本发明所述的抗体能够以高得多的效力中和所述毒株。[0089]hiv-1假病毒6545.v4.c1也似乎是极其难以由已知cd4结合位点抗体中和的毒株。还没有先前已知的靶向cd4结合位点的抗体被证明以低于0.091μg/ml的ic50值成功中和所述假病毒。然而，根据本发明所述的抗体能够以高得多的效力中和所述毒株。[0090]根据本发明的一个优选实施方案，抗体或结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，以小于0.1μg/ml、优选小于0.05μg/ml的ic50浓度中和所有yu2假病毒变体，所述变体包含具有包膜突变n279k、n280y、g458d、g459d、或g471r(根据hiv-1hxb2包膜基因；genbank:k03455编码残基)之一的yu2包膜基因(genbank:m93258.1)。[0091]突变n279k、n280y、g458d、和g459d已与hiv-1感染的体内模型中用cd4结合位点抗体治疗期间的病毒反弹的发展相关(即治疗失败)，并且表明针对施用的cd4结合位点抗体的病毒抗性的发生(klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43)。再次，根据本发明所述的抗体优于现有技术的已知cd4结合位点抗体，因为上述提及的yu2包膜基因中的突变不消除中和作用并且不起到针对根据本发明所述的抗体的逃逸突变的作用。[0092]根据本发明的另一优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，导致在治疗4周后、优选治疗6周后、甚至更优选治疗8周后测定时，在治疗开始时具有至少5000个拷贝/ml血浆的hiv-1rna载量的经治疗小鼠的至少70％中，血浆中hiv-1rna载量与治疗开始时相比减少至少0.8log10、优选至少1.0log10。[0093]根据本发明的另一优选实施方案，向感染hiv-1nl4-3/bal的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，导致在治疗4周后、甚至更优选治疗6周后测定时，在治疗开始时具有至少30,000个拷贝/ml血浆的hiv-1rna载量的经治疗小鼠的至少60％中，血浆中hiv-1rna载量与治疗开始时相比减少至少1.0log10、优选至少1.5log10、甚至更优选至少1.75log10。[0094]根据前述实施方案的更优选实施方案，人源化小鼠通过以下预先处理4周：一次初始皮下注射1mg的3bnc117或vrc01或二者的组合，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的3bnc117或vrc01或二者的组合。[0095]感染hiv-1nl4-3/yu2(nl4-3骨架中yu2env，如zhang等,jvirol,2002；76:6332–6343中所记载的)的人源化小鼠在本领域提供了良好建立的模型以研究体内中和hiv-1抗体的抗病毒活性。这些小鼠可以维持稳定的病毒血症水平(即血浆中的hiv-1rna拷贝数)，并显示出与在人中观察到的相似的env基因中hiv-1序列多样性的比率(klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22)。[0096]该模型还用于研究用cd4结合位点抗体的单一疗法的效果(freund等,plospathog,2015,oct30；11(10):e1005238；klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43；freund等,scitranslmed,2017jan18；9(373).pii:eaal2144)。作为单一疗法给药的根据本发明所述的抗体在治疗的小鼠中导致维持的hiv-1病毒载量(load)的抑制，因此优于在抗体单一治疗期间仅观察到hiv-1病毒载量的短暂降低的其它的研究的cd4结合位点抗体。此外，1-18的体内活性优于其它cd4结合位点抗体，在这方面，在小鼠在用cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、或两者的组合预先治疗期间发生病毒反弹之后，也实现维持的病毒抑制。[0097]根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，不持续至少4周，导致介导对施用的抗体的抗性的cd4结合位点表位(环d，cd4结合环，β23链，v5环，和β24链)中的一种或多种突变的发生。[0098]优选地，对如用于先前实施方案的上下文中的施用的抗体的抗性可定义为，当测试由含有该突变的病毒序列产生的hiv-1假病毒时，在tzm-bl中和假病毒试验中，导致施用的抗体的ic50为至少2.5μg/ml。[0099]在其它cd4结合位点抗体的抗体单一疗法研究中已证实了导致抗体抗性和/或与病毒反弹(即治疗失败)相关的逃逸突变的发展(freund等,plospathog,2015,oct30；11(10):e1005238；klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43；freund等,scitranslmed,2017jan18；9(373).pii:eaal2144)。与这些cd4结合位点抗体相比，本发明的抗体的优势在于它们防止cd4结合位点表位中突变的发展，因此可以防止治疗失败并维持抗病毒活性。[0100]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，向nrg小鼠静脉内注射0.5mg的所述抗体或其结合片段导致注射后10天抗体或其结合片段的可检测血清水平为至少50μgigg/ml血清。[0101]hiv-1中和抗体的药代动力学性质可变化。在人中，目前已知的cd4结合位点抗体似乎具有比靶向v3环的抗体更短的半衰期(mendoza等,nature,2018sep；561(7724):479-484)，在小鼠模型中也进行了观察(klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43)。与其它cd4结合位点抗体相比，本发明的抗体是优越的，因为它们在体内较长时间维持较高的血清水平。[0102]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段不包含具有16或19个氨基酸长度的cdrh3和/或其中抗体或其结合片段包含具有18、20或21个氨基酸长度的cdrh3。[0103]根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，抗体或其结合片段不包含如freund等,sci.transl.med.9,eaal2144(2017)中所记载的抗体nc37、nc133、ac40、ac41或ac72的氨基酸序列或不由其组成。[0104]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段包含来自包括以下的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，特别优选抗体1-18的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列。[0105]根据本发明的具体的优选实施方案，抗体或其结合片段包含选自包括以下的组的一种抗体的重链和轻链的组合：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链和轻链的组合，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链和轻链的组合，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链和轻链的组合，特别优选抗体1-18的重链和轻链的组合。[0106]在本技术的说明书中，可使用抗体命名。需要指出的是，抗体由重链和轻链组成，所述重链和轻链也构成本说明书的一部分。如果通过抗体的命名对抗体进行引用或对seqidno.进行引用，应理解，这些引用方式是可互换的。[0107]本发明进一步涉及一种药物组合物，其包含如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。优选地，所述药物组合物是用于人类受试者的疫苗组合物。[0108]本发明还包括一种试剂盒，其包含如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段和容器。[0109]在一方面，本发明还涉及如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段、如本文所描述的药物组合物和试剂盒用作药物、优选地用作疫苗。[0110]在另一方面，本发明还涉及如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段、如本文所描述的药物组合物和试剂盒用于治疗或预防人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病的用途，优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的用途。[0111]在另一方面，本发明还涉及治疗患有人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病的患者的方法，优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的用途，其中向所述患者施用有效量的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段或本发明的药物组合物。[0112]在另一方面，本发明还涉及根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段或本发明的药物组合物在制备用于治疗人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病、优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的药物中的用途。[0113]如本文所描述的本发明的所有实施方案被认为可以以任意组合组合，除非本领域技术人员认为这种组合不具有任何技术意义。[0114]实施例[0115]a)实验方法[0116]单克隆抗体序列的分离[0117]根据由科隆大学的机构审查委员会批准的方案(方案13-364和16-054)获得血液和白细胞清除样品，参与者提供书面知情同意书。通过密度梯度离心分离外周血单核细胞(pbmc)，并于-150℃下贮存在90％fbs和10％dmso中。通过磁性细胞分离从pbmc分离b细胞，并在冰上用抗人cd19-af700、抗人igg-apc、dapi(bd)和hiv-1env诱饵蛋白标记30分钟。hiv-1env诱饵蛋白是bg505sosip.664-gfp(sliepen等,2015)或生物素化(ez-linksulfonhsbiotingandlabelingkit,thermofisher)yu2gp140(yang等,2000)，由链霉亲和素-pe标记。如先前所述分选env-反应性cd19 igg dapi-单细胞(ehrhardt等,2019)。在65℃下用随机六聚体引物np-40、和无rnase的h2o培养分选的细胞1分钟。然后，在rt缓冲液、dntp、dtt、h2o、rnasin、和rnaseout的存在下，使用superscriptiv产生cdna。使用taq聚合酶和先前描述的引物cg_rt(ozawa等,2006,firstpcr)、igg_internalrt(tiller等,2008,secondpcr)、和opt5/opr-primermix(kreer等,2019,bothpcrs)、通过半巢式pcr扩增抗体序列用于单细胞分析。[0118]抗体序列分析[0119]用igblast(ye等,2013)注释具有平均phred评分≥28和240个核苷酸的最小长度的第二pcr产物的序列，并从可变区的框架区(fwr)1修剪至j基因的末端。屏蔽phred评分《16的碱基判读(basecall)，并将具有大于15个屏蔽的核苷酸、移码、或终止密码子的序列排除在进一步的分析之外。为了分析序列的潜在克隆性，将所有的生产重链序列按相同的v基因分组，并确定它们的cdrh3的成对莱文斯坦(levenshtein)距离。当单个序列共享相同的v基因并且具有75％的最小cdrh3同一性时，它们被分为克隆。在随机输入序列10轮之后，选择产生最少数量的未分配(非克隆)序列的结果用于进一步的分析。研究人员手动重新验证所有克隆以便鉴定共有的突变。随后将最初分配给不同克隆但共用相同的vdj基因和氨基酸和/或沉默核苷酸突变的序列分成亚克隆。使用igblast计算与种系的核苷酸序列同一性。[0120]单克隆抗体生产[0121]为了克隆单细胞衍生的抗体，使用单细胞-pcr的第一pcr产物作为模板、并使用q5高保真聚合酶(highfidelitypolymerase)和具有用于随后不依赖于序列和连接的克隆(slic)的表达载体突出端的、类似于v区和j区各自的核苷酸序列的特异性正向引物和反向引物(tiller等,2008)进行扩增。将pcr产物通过如先前所述的slic组装(vonboehmer等,2016)克隆至人抗体表达载体(igg1，κ、或λ链)。通过使用聚乙烯亚胺转染而在hek293-6e细胞中产生抗体。5-7天后，从蛋白g培养和随后的使用0.1m甘氨酸(ph＝3.0)从层析柱中洗脱的上清液中纯化抗体。缓冲液中和后，将缓冲液更换为pbs，并过滤-灭菌，将抗体贮存在4℃下。[0122]假病毒生产[0123]如先前所述，通过与psg3δenv质粒共转染而在hek293t细胞中产生假病毒(doria-rose等,2017；sarzotti-kelsoe等,2014；hraber等,2017；seaman等,2010)。为了产生yu2假病毒突变体组，使用定点诱变将点突变引入编码yu2包膜基因的质粒中。[0124]tzm-bl细胞中和试验[0125]如先前所述进行中和试验(sarzotti-kelsoe等,2014；seaman等,2010)。小鼠白血病病毒(mulv)-假型病毒用于确定非特异性活性。一式两份地测试抗体。对于假病毒突变体和全球性参考组的试验，在添加荧光素/裂解缓冲液后确定生物发光(tris-hcl中10mmmgcl2、0.3mmatp、0.5mm辅酶a、17mmigepal(全部sigma-aldrich)、和1mmd-荧光素(goldbio))。[0126]hiv-1感染的人源化小鼠[0127]如先前所述(klein等,2012)并进行了修改，产生人源化小鼠。nod.cg-rag1tm1momil2rgtm1wjl/szj(nrg)小鼠在出生5天内和亚致死辐射后3-6小时、通过肝内注射人cd34 造血脐带血和/或胎盘组织干细胞而人源化。使用从转染的hek293t细胞的上清液收获的能够复制的重组hiv-1yu2(nl4-3骨架中yu2env(zhang等,2002))或hiv-1bal(nl4-3骨架中balenv)，通过腹膜内攻击感染人源化小鼠。[0128]hiv-1病毒载量测定[0129]使用包括柱上dnasei消化步骤的minelutevirusminispin试剂盒从edta血浆样品提取血浆rna。病毒载量通过使用先前所述的pol-特异性引物的定量实时pcr来确定(horwitz等,2013)。使用taqmanrna-to-ct1-step试剂盒在lightcycler480ii上进行qpcr。病毒载量通过包含每次qpcr运行中衍生自已知拷贝数的样品的标准曲线来定量。确定qpcr的精确度的极限值为384个拷贝/ml。假定拷贝数为383个拷贝/ml来计算病毒载量《384个拷贝/ml的log10变化。[0130]hiv-1感染的人源化小鼠的抗体治疗[0131]皮下注射稀释于pbs中的抗体。在1mg负载剂量后，每3-4天注射0.5mg的剂量。[0132]人源化小鼠中hiv-1的单基因组测序[0133]为了确定在hiv-1感染的人源化小鼠的抗体治疗期间hiv-1env基因中潜在逃逸突变的发展，提取的血浆rna用于使用superscriptiv和反义引物yb383产生cdna(horwitz等,2017)，随后进行rnaseh培养。然后，使用taq聚合酶和引物yb383和yb50用于第一pcr、和引物yb49和yb52用于第二pcr，进行有限稀释巢式pcr以扩增单基因组envcdna(schoofs等,2019)。如先前所述(kryazhimskiy等,2014；schoofs等,2016)并进行了修改，对稀释度《30％pcr效率的阳性pcr反应使用illumina染料测序进行测序。在标记(tagmentation)、通过有限循环pcr来添加标签(indices)和接头、以及纯化之后，在illuminamiseq上测序pcr产物并组装读出(gaebler等,2019)。分析了具有少于10个模糊度(读出中《75％核苷酸同一性)的全长env序列。[0134]确定对于hiv-1env结合的竞争的elisa[0135]使用ezlinksulfonhs生物素和标记试剂盒(thermofisher)，根据制造商的说明，将抗体1-18、1-55和2-12生物素化，然后将缓冲液更换为pbs。在4℃下用2μg/ml的抗-6xhis标签抗体将高结合elisa板包被过夜。在37℃下用pbs中3％bsa封闭孔60分钟，在37℃下用pbs中2μg/ml的bg505sosip.664-his(sanders等,2013)培养60分钟。在室温下以起始于pbs中32μg/ml的浓度以1:3稀释培养竞争抗体60分钟。将感兴趣的生物素化抗体在pbs中3％bsa中稀释为0.5μg/ml，并在室温下培养60分钟，然后过氧化物酶-链霉亲和素在pbs中在1％bsa/0.05％tween20中1:5,000稀释。在添加abts溶液后，在微孔板读板机上确定415nm处的吸光度。在各个步骤之间用pbs中0.05％tween20洗涤板。[0136]体内抗体药代动力学分析[0137]用200μlpbs中0.5mg的抗体静脉内注射nrg小鼠。如先前所述(klein等,2012)并进行了略微的修改，通过elisa确定人igg的总血清浓度。简言之，在室温下以2.5μg/ml的浓度用抗人igg将高结合elisa板包被过夜。然后，用封闭缓冲液(pbs中2％bsa、1μmedta、和0.1％tween20)封闭孔。在室温下培养人igg1κ标准物(一式两份)和pbs中血清样品的系列稀释90分钟，随后在室温下用封闭缓冲液中1:1,000稀释的hrp-缀合的抗人igg培养90分钟。在添加abts之后，使用微孔板读板机确定415nm处的光密度。在各个步骤之间用pbs中0.05％tween20洗涤板。在抗体注射前获得的血清样品用于确证基线不存在人血清igg。[0138]b)本发明的抗体的具体实例[0139]实施例i-来自hiv-1感染的精英中和剂(eliteneutralizer)的广泛且强力的vh1-46衍生的hiv-1中和抗体的分离[0140]从先前在体外试验中鉴定为具有优异的针对hiv-1的血清中和活性的hiv-1感染个体分离出对hiv-1包膜蛋白具有反应性的人b细胞。[0141]为此，用荧光染料标记的可溶性hiv-1env蛋白(yu2gp140或bg505sosip.664)培养分离的b细胞，并进行单细胞分选(ehrhardt等,2019)。该方法使得随后能够通过pcr从单个hiv-1env-反应性b细胞扩增重抗体基因片段和轻抗体基因片段。这允许将pcr产物克隆至表达载体中用于重组生产由单个b细胞编码的相应抗体，使得能够进行抗体的功能试验。[0142]从对hiv-1-env反应性b细胞的序列的分析，可以鉴定扩增的vh1-46衍生的b细胞克隆。这些克隆之一的特征在于6个氨基酸(aa)插入重链cdr1区，该克隆表示为重链(seqid:47)和轻链(seqid:48)的共有序列。鉴定了三种另外的b细胞克隆，它们彼此之间以及与前述克隆之间共有相似性。这些另外的克隆不携带6aacdrh1插入，但在其轻链的框架区1中显示2aa缺失。这些克隆表示为重链(seqid:49)和轻链(seqid:50)的分别的共有序列。[0143]产生了代表所鉴定的vh1-46衍生的b细胞克隆的总计23种抗体作为单克隆抗体。为了确定它们的整体中和效力和宽度，在tzm-bl细胞中和试验中，针对称作“全球性组”的12种hiv-1假病毒株的参考组，测试这些抗体的中和活性(图1)。该假病毒组先前设计为全球性hiv-1流行病的多样性的代表，并且使得能够进行中和抗体的活性的标准化评价。[0144]值得注意的是，所有分离的vh1-46衍生的抗体针对12种hiv-1参考毒株的至少11种表现出高中和活性(图1)。由seqid47和48表示的vh1-46衍生的抗体证明了针对所有测试毒株的活性。除了它们的中和宽度以外，测试的vh1-46衍生的抗体也表现出高的中和效力。中和效力通常由50％抑制浓度(ic50)表示。当针对“全球性组”进行试验时，所有测试的vh1-46衍生的抗体针对中和的病毒株具有高活性，几何平均数ic50为0.2μg/ml以下(图1)。[0145]实施例ii-cd4结合位点作为本发明的抗体的靶标的鉴定[0146]为了确定根据本发明抗体的表位，研究了在已知特异性的抗体的存在下，代表性抗体1-18、1-55、和2-12对bg505sosip.664的hiv-1包膜三聚体的结合。检测了cd4结合位点抗体3bnc117、n6和vrc01的干扰(图2)。这表明本发明的抗体靶向cd4结合位点以及与cd4结合位点结合的其它抗体的表位重叠的表位。[0147]实施例iii-抗体1-18、1-55、和2-12的高效力和宽度[0148]为了证实分离的vh1-46衍生的hiv-1抗体的中和效力和宽度，如schoofs等,2019中先前试验的，针对119种hiv-1假病毒的扩展组单个地测试了代表性抗体1-18、1-55和2-12。该假病毒组代表了在seaman等,2010中详细描述的假病毒组的发展。它提供了hiv-1env变体的遗传和全球多样性的代表。它包括不同进化枝或亚型的hiv-1变体，包括分离自传播/初始病毒和难以中和病毒的变体。[0149]值得注意的是，在对119-假病毒多进化枝组进行试验时，测试的本发明的vh1-46衍生的抗体表现出高的中和效力和宽度(图3)。特别地，当以多至20μg/ml的抗体浓度测试时，抗体1-18中和了96.6％的测试的假病毒，并针对中和的假病毒显示0.048μg/ml的几何平均数ic50(图3)。该宽度和效力高于其它同样靶向cd4结合位点的hiv-1中和抗体，所述抗体衍生自vh1-2-基因片段，并处于临床试验的晚期(3bnc117和vrc01)(图3)。而且，119-多进化枝组中抗体1-18的效力高于临床试验中另一种vh1-2衍生的cd4结合位点抗体n6的效力(图3)。[0150]另外，当与其它靶向cd4结合位点的vh1-46衍生的hiv-1中和抗体相比较时，对于针对总计62种相同hiv-1假病毒的结果为可获得的(yoon等,2015)，本发明的代表性vh1-46衍生的抗体表现出更高的效力和宽度(图4)。[0151]实施例iv-针对其它cd4结合位点抗体不良中和的假病毒的中和活性[0152]尽管cd4结合位点抗体可实现高水平的中和宽度(即，具有针对大量不同hiv-1env变体的活性)，但存在抗体抗性hiv-1变体。因此，鉴定针对此类hiv-1变体为高活性的新的cd4结合位点抗体是重要的。[0153]与在临床试验的晚期阶段中的cd4结合位点抗体(n6、3e3nc117、vrc01)相比，本发明的抗体以高得多的效力(即它们具有较低的ic50)中和几种毒株(代表性成员1-18、1-55和2-12示于图5)。[0154]例如，当以多至20μg/ml的浓度在tzm-bl假病毒中和试验中测试时，包括病毒株89-f1_2_25的hiv-1env蛋白的假病毒不被临床试验中的cd4结合位点抗体(n6、3bnc117、vrc01)中和(即，这些抗体没有达到针对该特定病毒的ic50)(图5)。此外，中和抗体数据库catnap(yoon等,2015)中列出的30种cd4结合位点igg抗体中，89.7％(26/29)的抗体根本不能中和该病毒(即ic50》20μg/ml)。在中和该病毒的三种抗体中，nc37的ic50为17.7μg/ml，vrc16的ic50为3.12μg/ml，vh1-69基因衍生的抗体vrc13的ic50为0.19μg/ml。相反，本发明的代表性抗体(1-18、1-55、和2-12)以非常高的效力(ic50分别为0.007、0.014、和0.006μg/ml)中和hiv-1假病毒89-f1_2_25，本发明的所有其它抗体也是如此(所有抗体的ic50在0.006和0.025μg/ml之间，参见图12)。对共同的cd4结合位点抗体为高度抗性的另一病毒株是毒株6545.v4.c1。该毒株对75％的中和抗体数据库catnap(yoon等,2015)中列出的43种cd4结合位点igg抗体具有抗性。最重要的是，处于晚期的cd4结合位点抗体都不能够有效(ic50《10μ/ml)中和该毒株(n6的ic50：16.23；3bnc117的ic50：》20；vrc01的ic50：》20；vrc07-523-ls的ic50：》20)。相反，本发明的所有抗体以0.008和9.37μg/ml之间的ic50强力中和该毒株(图12)。[0155]因此，本发明的抗体提供了通过cd4结合位点抗体对病毒89-f1_2_25和6545.v4.c1的不良中和的解决方案。当针对89-f1_2_25进行试验时，本发明的抗体比前述的针对该病毒的最佳cd4结合位点抗体更强力约1log10。[0156]实施例v-针对具有赋予对其它cd4结合位点抗体抗体的抗性的cd4结合位点突变的假病毒的中和活性[0157]由cd4结合位点逃逸突变的发展介导的抗体抗性导致hiv-1感染的抗体治疗的治疗失败(klein等,2012)。因此，关键是鉴定不受这些逃逸突变影响的cd4结合位点抗体以提供用于携带这些突变的hiv-1变体的治疗选择。[0158]在tzm-bl细胞中和试验中，针对具有特定cd4结合位点突变的yu2假病毒变体组测试cd4结合位点抗体(图6)。cd4结合位点中的突变影响先前已知的cd4结合位点抗体的活性(图6)。例如，cd4结合位点抗体vrc01和8anc131针对野生型yu2假病毒的ic50分别为0.107μg/ml和0.256μg/ml，但是针对任何测试的环d突变体没有观察到中和(即，在多至2.5μg/ml的测试抗体浓度下无ic50)。另一种cd4结合位点抗体n6受到突变n279k的影响(图6)。相反，测试的本发明的代表性抗体(1-18、1-55和2-12)针对测试的yu2假病毒变体维持高中和活性(图6)。[0159]因此，本发明提供了对针对具有cd4结合位点中突变的病毒变体的cd4结合位点抗体的抗性的解决方案。[0160]实施例vi-hiv-1感染的体内模型中通过抗体单一疗法维持病毒抑制[0161]感染hiv-1yu2(zhang等,2002)的人源化小鼠提供了一种研究体内中和hiv-1抗体的抗病毒活性的模型。为了产生人源化小鼠，出生后的第一天内对免疫缺陷型nrg小鼠进行照射，并肝内注射人造血cd34 干细胞。这导致可被能够复制的hiv-1感染的人淋巴细胞的发育。这些小鼠可维持稳定的病毒血症水平(即血浆中hiv-1rna拷贝数)，并显示出与在人中观察到的类似的hiv-1序列多样性的比率(klein等,2012)。该小鼠模型先前已经用于确定作为体内单一疗法给药的几种cd4结合位点抗体的抗病毒活性(179nc75：freund等,2015；3bnc117：horwitz等,2013；45-46g54w：klein等,2012；nc37：freund等,2017)。在所有这些研究中，仅观察到对病毒载量的短暂效果，并且病毒反弹(即病毒血症恢复至基线水平)迅速发展。此外，这种病毒反弹与抗体靶位点中的突变的发展有关。因此，需要在作为单一疗法给药时能够维持病毒抑制的新的cd4结合位点抗体。[0162]当用cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、或其组合治疗hiv-1yu2感染的人源化小鼠时(皮下(s.c.)给药每抗体1mg负载剂量，随后每3-4天皮下给药0.5mg)，仅观察到hiv-1rna拷贝数的短暂减少，并且在大多数小鼠中，病毒血症在2-3周内恢复至基线水平(图7)。相反，当根据相同的给药方案用本发明的代表性抗体1-18治疗小鼠时，在8周的治疗期间、在所有治疗的小鼠中，观察到与治疗开始时的病毒拷贝数相比较的病毒抑制(图7)。在≥80％的小鼠中，hiv-1rna血浆拷贝数降低至低于所用试验的精确度极限(384个拷贝/ml)的水平。[0163]因此，本发明的抗体即使在作为单一疗法给药时，能够在hiv-1yu2感染的人源化小鼠中有效维持病毒抑制。[0164]而且，当如上所述用cd4结合位点抗体3bnc117或vrc01治疗hiv-1bal感染的人源化小鼠时，仅观察到hiv-1rna拷贝数的略微且短暂的减少，并且在大多数小鼠中，在2周内病毒血症恢复至基线水平(图13)。相反，当根据相同的给药方案用本发明的代表性抗体1-18治疗小鼠时，在6周的治疗期间、在所有治疗的小鼠中，观察到与治疗开始时的病毒拷贝数相比较的病毒抑制(图13)。[0165]因此，本发明的抗体即使在作为单一疗法给药时，能够在hiv-1bal感染的人源化小鼠中有效维持病毒抑制。[0166]实施例vii-防止抗体单一治疗期间cd4结合位点中病毒突变的发展[0167]由cd4结合位点抗体的抗体单一治疗期间的病毒反弹通常与抗体靶位点中病毒序1-specificbcellresponses.j.exp.med.[0180]ehrhardtetal.,(2019)polyclonalandconvergentantibodyresponsetoebolavirusvaccinervsv-zebov.natmed.25,1589-1600.[0181]freund,n.t.,etal.(2015).anewglycan-dependentcd4-bindingsiteneutralizingantibodyexertspressureonhiv-1invivo.plospathog.11,:e1005238.[0182]freund,n.t.,etal.(2017).coexistenceofpotenthiv-1broadlyneutralizingantibodiesandantibody-sensitivevirusesinaviremiccontroller.scitranslmed.9,eaal2144[0183]gaebler,c.,etal.(2019).combinationofquadruplexqpcrandnext-generationsequencingforqualitativeandquantitativeanalysisofthehiv-1latentreservoir.j.exp.med.[0184]horwitz,j.a.,etal.(2013).hiv-1suppressionanddurablecontrolbycombiningsinglebroadlyneutralizingantibodiesandantiretroviraldrugsinhumanizedmice.proc.natl.acad.sci.usa110,16538-16543.[0185]horwitz,j.a.,etal.(2017).non-neutralizingantibodiesalterthecourseofhiv-1infectioninvivo.cell170,637-648e610.[0186]hraber,p.,etal.(2017).panelsofhiv-1subtypecenvreferencestrainsforstandardizedneutralizationassessments.j.virol.91.[0187]klein,f.,etal.(2012).hivtherapybyacombinationofbroadlyneutralizingantibodiesinhumanizedmice.nature492,118-122.[0188]kreer,c.,etal.(2019).openprimerformultiplexamplificationofhighlydiversetemplates.biorxiv.https://doi.org/10.1101/847574[0189]kryazhimskiy,s.,etal.(2014).microbialevolution.globalepistasismakesadaptationpredictabledespitesequence-levelstochasticity.science344,1519-1522.[0190]mendoza,p.,etal.(2018).combinationtherapywithanti-hiv-1antibodiesmaintainsviralsuppression.nature561,479-484.[0191]pietzsch,j.,etal.(2010).humananti-hiv-neutralizingantibodiesfrequentlytargetaconservedepitopeessentialforviralfitness.j.exp.med.207,1995-2002.[0192]sanders,r.w.,etal.(2013).anext-generationcleaved,solublehiv-1envtrimer,bg505sosip.664gp140,expressesmultipleepitopesforbroadlyneutralizingbutnotnon-neutralizingantibodies.plospathog.9,e1003618.[0193]sarzotti-kelsoe,m.,etal.(2014).optimizationandvalidationofthetzm-blassayforstandardizedassessmentsofneutralizingantibodiesagainsthiv-1.j.immunol.methods409,131-146.[0194]schoofs,t.,etal.(2016).hiv-1therapywithmonoclonalantibody3bnc117elicitshostimmuneresponsesagainsthiv-1.science352,997-1001.[0195]seaman,m.s.,etal.(2010).tieredcategorizationofadiversepanelofhiv-1envpseudovirusesforassessmentofneutralizingantibodies.j.virol.84,1439-1452.[0196]sliepen,k.,etal.(2015).engineeringandcharacterizationofafluorescentnative-likehiv-1envelopeglycoproteintrimer.biomolecules5,2919-2934.[0197]tiller,t.,etal.(2008).efficientgenerationofmonoclonalantibodiesfromsinglehumanbcellsbysinglecellrt-pcrandexpressionvectorcloning.j.immunol.methods329,112-124.[0198]vonboehmer,l.,etal.(2016).sequencingandcloningofantigen-specificantibodiesfrommousememorybcells.nat.protoc.11,1908-1923.[0199]yang,x.,etal..(2000).characterizationofstable,solubletrimerscontainingcompleteectodomainsofhumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteins.j.virol.74,5716-5725.[0200]ye,j.,etal.(2013).igblast:animmunoglobulinvariabledomainsequenceanalysistool.nucleicacidsres.41,w34-40.[0201]yoon,h.,etal.(2015).catnap:atooltocompile,analyzeandtallyneutralizingantibodypanels.nucleicacidsres.43,w213-219.[0202]zhang,y.j.,etal.(2002).envelope-dependent,cyclophilin-independenteffectsofglycosaminoglycansonhumanimmunodeficiencyvirustype1attachmentandinfection.j.virol.76,6332-6343.当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及针对人类免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点的单克隆人抗体或其结合片段、包含此类单克隆人抗体或其结合片段的药物组合物、包含此类抗体或其结合片段的试剂盒，以及所述单克隆人抗体或其结合片段和所述药物组合物和所述试剂盒用作药物、和用于治疗或预防由人类免疫学缺陷病毒hiv-1导致的疾病的用途。
背景技术：
：：2.靶向hiv-1包膜蛋白(env)的广泛中和抗体(bnab)可以预防动物模型中的感染，并且正在临床试验中对其进行对于被动免疫的研究。此外，已表明bnab在hiv-1感染个体中在中断抗逆转录病毒治疗(art)后抑制病毒血症并延迟病毒反弹。3.虽然这些结果强调了bnab的显著临床潜力，但是先前存在的和重新的hiv-1抗性导致治疗失败并且可能强烈限制bnab在人中的应用。因此，预防和克服病毒逃逸的策略对于有效实施用于hiv-1预防和治疗的bnab介导的方法是至关重要的(gruell,h.,和klein,f.(2018).antibody-mediatedpreventionandtreatmentofhiv-1infection.retrovirology15,73)。4.近年来，已从hiv-1感染的供体中分离出强力的bnab，其靶向hiv-1包膜(env)三聚体上不同的易损表位。这些表位包括cd4结合位点(cd4b)、v1/v2环、v3环聚糖斑(glycanpatch)、膜-近端外部区域、以及gp120和gp41env亚基之间的界面。5.在这些位点中，cd4b是特别感兴趣的，因为cd4起到病毒进入的主要受体的作用。大部分强力的cd4bbnab的特征在于使用免疫球蛋白重链基因片段igvh1-2*02、高体细胞超突变(somatichypermutation)水平、轻链的五残基互补决定区3(cdrl3)、和env-cd4相互作用的模拟物。6.以原型抗体vrc01命名(wu,x.,yang,z.y.,li,y.,hogerkorp,c.m.,schief,w.r.,seaman,m.s.,zhou,t.,schmidt,s.d.,wu,l.,xu,l.,等(2010).rationaldesignofenvelopeidentifiesbroadlyneutralizinghumanmonoclonalantibodiestohiv-1.science329,856-861.)，这些抗体被称作vrc01类bnab。此类的其它成员包括3bnc117、nih45-46、n49-p7、n6、和vrc07-523。7.模拟cd4结合的其它bnab衍生自vh1-46基因片段。然而，与vh1-2衍生的bnab相比，迄今为止报道的vh1-46bnab具有较低的效力和宽度(breadth)，这限制了它们用于临床应用的潜力。例如，这类的最佳抗体之一ch235.12，在针对一大组hiv-1env毒株在体外试验时，与vrc01类bnabn6相比，其广泛性较小且效力低》10倍(bonsignori,m.,zhou,t.,sheng,z.,chen,l.,gao,f.,joyce,m.g.,ozorowski,g.,chuang,g.y.,schramm,c.a.,wiehe,k.,等(2016).maturationpathwayfromgermlinetobroadhiv-1neutralizerofacd4-mimicantibody.cell165,449-463.)。8.因此，已经进入临床试验的所有cd4bbnab都是vrc01类的成员(3bnc117、n6、vrc01、和vrc07-523)。然而，虽然从vrc01逃逸与病毒适应性(viralfitness)的降低有关，vrc01类单一疗法的作用仅是瞬时的，并且在临床试验(scheid,j.f.,horwitz,j.a.,bar-on,y.,kreider,e.f.,lu,c.l.,lorenzi,j.c.,feldmann,a.,braunschweig,m.,nogueira,l.,oliveira,t.,等(2016).hiv-1antibody3bnc117suppressesviralreboundinhumansduringtreatmentinterruption.nature535,556-560.)和hiv-1感染的动物模型(klein,f.,halper-stromberg,a.,horwitzj.a.,gruell,h.,scheidj.f.,bournazoss.,mouqueth.,spatzl.a.,diskinr.,abadira.,等(2012)hivtherapybyacombinationofbroadlyneutralizingantibodiesinhumanizedmice.nature492(7427),118-22)中都与病毒逃逸变体的快速出现相关。9.由于目前正在研究的已知bnab的这些缺点，仍然需要靶向cd4结合位点的hiv抗体，其效力和宽度超过已知经典vh1-2衍生的或vh1-46衍生的bnab，具有针对vrc01类逃逸变体的强力中和活性，并且当在hiv-1感染的生物体中试验时，有效限制病毒逃逸并维持病毒抑制。10.因此，本发明的一个目的是提供针对hiv-1的新的人单克隆抗体，其具有针对广泛选择的不同病毒株的广泛中和活性，并结合有针对此类病毒株的高中和效力。本发明的进一步的目的是提供针对hiv-1的新的人单克隆抗体，其针对表现此类逃逸突变的病毒显示出显著限制逃逸突变的发展并维持有效性。本发明的另一目的是提供针对hiv-1的新的人单克隆抗体，其在感染个体中赋予完全的病毒抑制、而在抗体单一疗法期间无明显的病毒反弹。此外，本发明的一个目的是提供针对cd4结合位点的新的人单克隆抗体，其具有良好的体内药代动力学性质。技术实现要素：11.这些目的通过如下文中说明的本发明的方面得到解决。12.根据本发明的第一方面，提供一种针对人类免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点的单克隆人抗体或其结合片段，其中所述抗体氨基酸序列包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段，其中所述抗体包含a)seqidno.47的重链氨基酸序列和seqidno.48的轻链氨基酸序列，或b)seqidno.49的重链氨基酸序列和seqidno.50的轻链氨基酸序列，其中seqidno.47至seqidno.50任意者中的x可以是任何氨基酸或无氨基酸，或与其为至少80％同一性的抗体序列。13.根据本发明的第一方面的优选实施方案，本发明的第一方面的选项b)的抗体包含fwr1中2aa的缺失。14.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至(upto)25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组(globalreferencepanel)的12种hiv-1分离参考毒株的至少11种毒株、优选所有12种毒株的中和。15.根据本发明的第一方面的仍另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组(multicladeviruspanel)中所包含的假病毒的至少89.9％(119中的107)、优选至少92.4％(119中的110)、更优选至少96.6％(119中的115)的中和。16.根据本发明的第一方面的优选实施方案，所述抗体或其结合片段当以多至25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组的中和毒株，表现小于0.3μg/ml、优选小于0.2μg/ml、更优选小于0.15μg/ml、甚至更优选小于0.1μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml、甚至更优选0.048μg/ml、甚至更优选0.035μg/ml的中和效力(中和毒株的几何平均数ic50)。17.根据本发明的第一方面的优选实施方案，所述抗体或其结合片段当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组的中和毒株，表现小于0.2μg/ml、优选小于0.1μg/ml、更优选小于0.08μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml的中和效力(中和毒株的几何平均数ic50)。18.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对hiv-1假病毒89-f1_2_25(89-f1_2_25env；genbank:hm215349.1)，表现小于0.05μg/ml、优选小于0.02μg/ml、甚至更优选小于0.01μg/ml的中和效力(ic50)。19.根据本发明的第一方面的仍另一优选实施方案，所述抗体或结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，以小于0.1μg/ml、优选小于0.05μg/ml的ic50浓度中和所有yu2假病毒变体，所述变体包含具有包膜突变n279k、n280y、g458d、g459d、或g471r(根据hiv-1hxb2包膜基因；genbank:k03455编码残基)之一的yu2包膜基因(genbank:m93258.1)。20.根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，导致在治疗4周后、优选治疗6周后、甚至更优选治疗8周后测定时，在治疗开始时具有至少5000个拷贝/ml血浆的hiv-1rna载量的经治疗小鼠的至少70％中，血浆中hiv-1rna载量与治疗开始时相比减少至少0.8log10、优选至少1.0log10。21.根据本发明的第一方面的上述实施方案的更优选实施方案，人源化小鼠通过以下预先处理4周：一次初始皮下注射1mg的3bnc117或vrc01或二者的组合，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的3bnc117或vrc01或二者的组合。22.根据本发明的第一方面的优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，不持续至少4周，导致介导对施用的抗体的抗性的cd4结合位点(环d，cd4结合环，β23链，v5环，和β24)中的一种或多种突变的发生。23.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，向nrg小鼠静脉内注射0.5mg的所述抗体或其结合片段导致注射后10天抗体或其结合片段的可检测血清水平为至少50μgigg/ml血清。24.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段不包含具有16或19个氨基酸长度的cdrh3。25.根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，所述抗体或其结合片段不包含具有18、20或21个氨基酸长度的cdrh3。26.根据本发明的第一方面的优选实施方案，所述抗体或其结合片段不包含如freund等,sci.transl.med.9,eaal2144(2017)中所记载的抗体nc37、nc133、ac40、ac41或ac72的氨基酸序列或不由其组成。27.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段包含来自包括以下的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，特别优选抗体1-18的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列。28.根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，所述抗体或其结合片段包含选自包括以下的组的一种抗体的重链和轻链的组合：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链和轻链的组合，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链和轻链的组合，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链和轻链的组合，特别优选抗体1-18的重链和轻链的组合。29.根据本发明的第二方面，提供一种药物组合物，其包含根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。30.根据本发明的第二方面的优选实施方案，所述药物组合物是用于人类受试者的疫苗组合物。31.根据本发明的第三方面，提供一种试剂盒，其包含根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、和容器。32.根据本发明的第四方面，提供根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、根据本发明的第二方面所述的药物组合物、或根据本发明的第三方面所述的试剂盒用作药物、优选地用作疫苗。33.根据本发明的第五方面，提供根据本发明的第一方面所述的单克隆人抗体或其结合片段、根据本发明的第二方面所述的药物组合物、或根据本发明的第三方面所述的试剂盒用于治疗或预防人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病的用途，优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的用途。附图说明34.图1显示本发明的抗体在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对具有不同包膜氨基酸序列的一组12种全球性参考假病毒毒株(如decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的)的中和活性。测试的抗体表现针对中和毒株的高效力，并且中和至少92％(11/12)和多至所有测试的假病毒。35.图2显示在用增加量的竞争抗体(x轴)预培养后，竞争elisa中抗体1-18(图2a)、1-55(图2b)、和2-12(图2c)针对bg505sosip.664的hiv-1env蛋白的结合。在用cd4结合位点靶向抗体3bnc117、vrc01和n6预培养后，测试的抗体显示减少的与bg505sosip.664包膜蛋白的结合，表明抗体共有与cd4结合位点重叠的表位。36.图3显示在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，抗体针对具有不同hiv-1包膜氨基酸序列的119种假病毒的多进化枝组(如schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的)的中和活性(ic50)。显示了抗体1-18、1-55、和2-12、临床试验晚期的vh1-2衍生的cd4结合位点抗体(3bnc117、vrc01、和n6)、和v3环-靶向抗体(10-1074、pgt121)的数据。37.图4显示与其它vh1-46衍生的hiv-1中和抗体相比，抗体1-18、1-55、2-12的中和活性，对于针对一组总计62种hiv-1假病毒的结果可获得于抗体中和数据库catnap(yoon等,2015)。38.图5显示如通过tzm-bl细胞假病毒试验测定的，抗体针对具有不同包膜氨基酸序列的假病毒的选择的抗体的中和活性。39.图6显示如左图所示和如tzm-bl细胞假病毒中和试验中测定的，抗体1-18、1-55、和2-12针对一组具有不同包膜序列(cd40结合位点中单氨基酸突变)的hiv-1yu2假病毒的中和活性，显示了与cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、n6、和vh1-46衍生的抗体8anc131的比较。根据hiv-1hxb2参考毒株对突变的包膜残基进行编号。40.图7显示感染hiv-1yu2(具有替换为yu2的包膜基因的包膜基因的nl4-3病毒)的人源化小鼠中hiv-1rna血浆拷贝数(顶部)和它们的log10变化(底部，与基线(第-1天的hiv-1rna血浆拷贝数)相比较)。用每抗体1mg负载剂量(loadingdose)皮下处理小鼠，然后每3-4天皮下注射每抗体0.5mg。用已知的cd4b抗体3bnc117、vrc01、或两种抗体的组合处理的小鼠显示出病毒血症的短暂降低，随后是迅速的病毒反弹。相反，用单独的本发明的抗体1-18处理的小鼠在8周的治疗期间显示出病毒血症的持续降低。黑色虚线表示平均log10变化。41.图8显示在4周的抗体治疗后，通过对图7所示的所选小鼠进行单基因组测序而从血浆获得的hiv-1序列。对应于图7的小鼠id示于左侧。序列与yu2野生型序列的比对示于顶部。与yu2野生型序列一致的氨基酸序列由点表示，与yu2野生型序列相比的突变或缺失分别由氨基酸单字母代码或虚线来表示。在用已知cd4b抗体3bnc117、vrc01、或其组合处理的小鼠中，与yu2野生型序列相比的cd4结合位点表位(环d，β23链，v5环)中的突变与病毒反弹相关，而单独地用本发明的抗体1-18治疗4周后没有观察到此类突变。42.图9显示用cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、或二者的组合预处理(如图7所示)的感染hiv-1yu2(nl4-3/yu2)的人源化小鼠中hiv-1rna血浆拷贝数(顶部)和它们的log10变化(底部，与基线(第28天的hiv-1rna血浆拷贝数)相比)。治疗4周后，将抗体1-18增加至先前的治疗方案中，并继续治疗方案。皮下施用1mg负载剂量的1-18，然后每3天至4天施用0.5mg。尽管在用其它cd4结合位点抗体预处理和循环具有cd4结合位点中的突变的病毒变体后病毒反弹(见图8)，用抗体的1-18处理导致18/19小鼠中维持的病毒抑制。43.图10显示在第0天单次静脉内注射0.5mg的抗体后(箭头所示)，通过elisa测定的nrg小鼠中人igg的血清浓度。与已知cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、和45-46g54w相比，本发明的抗体1-18、1-55、和2-12显示抗体浓度的较慢的降低，这更类似于v3环靶向抗体10-1074，其在人体内具有比3bnc117更长的半衰期(mendoza等,2018)。44.图11显示如在tzm-bl细胞假病毒试验中确定的，抗体针对具有不同包膜氨基酸序列的假病毒的选择的中和活性(ic50)。选择假病毒组作为全球性hiv-1大流行病的多样性的代表(decamp等,2014)。将本发明的抗体与vh1-46衍生的cd4结合位点抗体8anc131进行比较。45.图12显示如在tzm-bl细胞假病毒试验中确定的，抗体分别针对6545.v4.c1和89-f1_2_25hiv-1假病毒株的中和活性(ic50)。将本发明的抗体与hiv-1中和cd4结合位点抗体n6、3bnc117、vrc01、vrc07、vrc07-523-ls、8anc131、nih45-46和nih45-46g54w相比较。46.图13显示与基线(第0天)相比，感染hiv-1bal(具有替换为hiv-1毒株bal的包膜基因的包膜基因的nl4-3病毒)的人源化小鼠中hiv-1rna血浆拷贝数log10变化。用每抗体1mg负载剂量皮下处理小鼠，然后每3-4天皮下注射每抗体0.5mg。用cd4结合位点抗体3bnc117或vrc01处理的小鼠表现出病毒血症的适度短暂降低，随后是快速的病毒反弹。相反，用本发明的抗体1-18处理的小鼠在6周的治疗期间显示出病毒血症的持续降低。未处理对照小鼠。黑色条纹线表示与基线相比的平均log10变化。数字通过各自的id表示单个小鼠。右边的表表示对于各个治疗组观察到的最大平均log10hiv-1rna变化、第21天log10hiv-1rna变化、和第42天log10hiv-1rna变化。具体实施方式47.本发明人已致力于解决本发明的问题并成功地发现了新的且有用的针对hiv-1的人单克隆抗体，其克服了已知抗体的缺点和不足。48.本文中，发明人描述了新的vh1-46和vκ3-20衍生的cd4结合位点抗体，其效力和宽度超过经典vh1-46和vh1-2衍生的bnab。观察到的高活性的结构基础被认为是由共同的结构性质引起的。这些性质是基于vh1-46和vκ3-20衍生的序列类似物的组合，其由显示对于它们的活性至关重要的残基的共有序列所限定。49.特别感兴趣的是，与两种最临床试验晚期的cd4bbnab3bnc117和vrc01相比，当在hiv-1感染的人源化小鼠中测试时，根据本发明的抗体有效限制病毒逃逸并保持针对vrc01类逃逸变体的中和活性和完全的病毒抑制。因此，本发明的抗体包括用于有效治疗和预防hiv-1感染的抗体介导策略为非常有希望的候选物。50.因此，本发明提供一种单克隆人抗体或其结合片段，其针对人类免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点，其中所述抗体序列包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段，其中所述抗体包含：a)重链序列[0051][0052]和轻链序列[0053][0054]或b)重链序列[0055][0056]和轻链序列[0057][0058]其中seqidno.47至seqidno.50任意者中的x可以是任何氨基酸或无氨基酸，或与其为至少80％同一性的抗体氨基酸序列。[0059]在本发明的上下文中，在本文产生和描述的抗体可以作为完整的单克隆人抗体或其任何功能性片段或结合片段使用和要求保护。优选地，所述单克隆人抗体或其任何类型的功能性片段或结合片段应当至少包含所述人单克隆抗体的重链的互补决定区(cdr)1至3和轻链的cdr1至3。[0060]本文所述的抗体序列的cdr区优选根据imgt的编号方案定义，imgt是chothia的编号方案的改编(immunogeneticsinformationlefranc等,nar27:209-212(1999)；http://www.imgt.org)。[0061]在一个优选实施方案中，抗体是保持结合特异性和中和传染性病原体的能力的单克隆抗体或其片段。在一个优选实施方案中，抗体是lgg1、lgg2、lgg3、或lgg4抗体。例如，抗体可以是包含任何人igg同种型(例如，lgg1、lgg2、lgg3、或lgg4)的fc结构域的抗体。[0062]任选地，抗原结合化合物由fab、fab'、fab'-sh、f(ab)2、fv、双特异抗体(diabody)、单链抗体片段、或含有多种不同抗体片段的多特异性抗体组成、或包含fab、fab'、fab'-sh、f(ab)2、fv、双特异抗体、单链抗体片段、或含有多种不同抗体片段的多特异性抗体。[0063]在本发明中，针对hiv-1的cd4结合位点的抗体或结合片段是指与不相关表位、蛋白或蛋白区域相比，抗体以至少10倍、更优选至少50倍、特别优选至少100倍增加的亲和力与hiv-1的gp120包膜糖蛋白内的cd4结合位点区域结合。通常，本文的术语cd4结合位点是指hiv-1的gp120包膜糖蛋白内的cd4结合位点区域。[0064]此外，在本发明中，包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段的抗体氨基酸序列分别是指基于所述基因片段和/或衍生自所述基因片段的抗体氨基酸序列。本领域中通常已知如何确定哪个vh或vκ基因片段用于组装抗体氨基酸序列。尽管所述基因片段的突变通常发生在天然抗体的组装中，但通过要求使用vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段用于组成特定抗体，本领域技术人员容易地看出记载哪些一级序列需求。[0065]因此，单克隆抗体或其结合片段应优选理解为包含可天然衍生自vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段的组合的序列。这优选包括所述基因片段的天然发生程度的突变形成。[0066]为了理解这两个片段对所要求保护的抗体的整体结构基础的意义和影响，应注意，vh1-46负责根据共有序列no.1的重链中总计131个氨基酸中的104个氨基酸，和负责根据共有序列no.3的重链中总计126个氨基酸中的96个氨基酸。[0067]类似地，vκ3-20占根据共有序列no.2的轻链中总计108个氨基酸中的96个氨基酸，和占根据共有序列no.4的轻链中总计111个氨基酸中的98个氨基酸。[0068]基于发明人能够鉴定的功能性抗体的数量，还可以配制两组共有序列用于包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段且针对hiv-1的cd4结合位点的抗体。这两组似乎代表不同的一级序列途径，以实现与cd4结合位点的高度有效结合、限制病毒逃逸以及病毒中和的宽度和效力。[0069]第一组序列由用于重链的根据seqidno.47的共有序列no.1和用于轻链的根据seqidno.48的共有序列no.2组成。本文已经研究了许多符合这些共有序列的个体化序列，由此获得的结果使得共有序列与给定片段的组合给出有效的结构指导以获得一组功能性抗体是合理的。此外，与第一组序列相符的抗体组的两个代表是抗体1-18和1-55，它们已经被更详细地研究。[0070]第二组序列由用于重链的根据seqidno.49的共有序列no.3和用于轻链的根据seqidno.50的共有序列no.2组成。同样，本文已经研究了许多个体化序列作为第二组共有序列的实例，由此获得的结果也使得这些共有序列与给定片段的组合给出有效的结构指导以获得功能性抗体是合理的。此外，与第二组序列相符的抗体组的一个代表是抗体2-12，其也已经被更详细地研究。[0071]关于本文所述的共有序列，氨基酸序列中的x或xaa可以代表任何氨基酸或无氨基酸。然而，基于所要求保护的抗体应当包含vh1-46基因片段和vκ3-20基因片段的附加要求，本领域技术人员已明确，选择更受到形成了各个抗体的基础的这些基因片段的限制。[0072]通常，本文所述的单克隆人抗体或其结合片段进一步包含与如上定义的序列为至少80％同一性的抗体氨基酸序列，只要它们仍针对人免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点即可。这意味着包含具有抗体氨基酸序列的不干扰结构折叠和抗体对cd4结合位点的亲和力的不重要(trivial)突变的序列。[0073]对于技术人员来说，基于上述或公知常识来确定表现一定程度的同一性的抗体是否针对人免疫缺陷病毒hiv-1的cd4结合位点是一项微不足道的任务。[0074]根据本发明的两条序列之间的同一性百分数的确定是通过使用karlin和altschul(proc.natl.acad.sci.usa(1993)90:5873-5877)的数学算法完成的。这种算法是altschul等(j.mol.biol.(1990)215:403-410)的blastn和blastp程序的基础。用blastn程序进行blast核苷酸检索。为了获得用于比较目的的空位对齐，如altschul等(nucleicacidsres.(1997)25:3389-3402)所述使用gappedblast。当使用blast和gappedblast程序时，使用相应程序的默认参数。[0075]根据本发明的优选实施方案，抗体氨基酸序列形成本发明的一部分，其由与如上定义的和本文公开的序列为至少85％同一性、更优选至少90％同一性、甚至更优选至少95％同一性的核酸序列组成、或包含与如上定义的和本文公开的序列为至少85％同一性、更优选至少90％同一性、甚至更优选至少95％同一性的核酸序列。[0076]根据本发明的优选实施方案，本发明第一方面的选项b)的抗体包含fwr1中2aa的缺失。[0077]根据本发明的另一优选实施方案，单克隆人抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组的12种hiv-1分离参考毒株的至少11种毒株、优选所有12种毒株的中和。[0078]tzm-bl细胞假病毒中和试验是本领域和本发明所属
技术领域：
：中常用的高度标准化试验，用于分析抗体针对各种hiv-1毒株的中和效力。简言之，在添加tzm-bl靶细胞之前，将抗体和病毒株一起培养。这些细胞在成功感染的情况下表现出荧光素酶活性，导致细胞裂解后、在荧光素的存在下的可检测的发光信号。中和抗体能够防止感染并因此防止发光的产生。中和抗体的效力通过将病毒感染性降低特定量所需的抗体浓度来确定。[0079]在sarzotti-kelsoe等；jimmunolmethods.2014july；0:131–146.doi:10.1016/j.jim.2013.11.022中公开并详细记载了建立和使用该试验的标准化方法。本说明书单独地和与常见的现有技术相结合，使得本领域技术人员能够建立和确定本文所用的tzm-bl细胞假病毒中和试验的结论性读出(readout)。[0080]在decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中记载的全球性参考组包括12种hiv-1病毒变体的代表性选择。通常认为用该12种病毒组观察到的hiv-1血清中和活性的谱与用亚型匹配的病毒观察到的活性非常接近。此外，该组对于许多已知的广泛中和抗体的检测是高度灵敏的。用该组进行的研究允许可靠地预测给定抗体的中和宽度和/或效力。[0081]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，抗体或其结合片段表现广泛中和活性，例示为当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组中所包含的假病毒的至少89.9％(119中的107)、优选至少92.4％(119中的110)、更优选至少96.6％(119中的115)的中和。[0082]根据schoofs等,2019或schoofs等,2019中引用的更全面的组用于通过测试大量的不同假病毒(即hiv-1毒株)来精确地鉴定宽度和效力。该大组通常被认为是所有主要循环hiv-1进化枝的代表，并且提供了关于所检测的抗体的中和能力的详细信息。[0083]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段当以多至25μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对decamp等,jvirol.2014mar；88(5):2489–2507中所记载的全球性参考组的中和毒株，表现小于0.3μg/ml、优选小于0.2μg/ml、更优选小于0.15μg/ml、甚至更优选小于0.1μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml、甚至更优选0.048μg/ml、甚至更优选0.035μg/ml的中和效力(几何平均数ic50)。[0084]本文所定义的中和效力优选仅考虑那些可以明确地确定为由相应抗体中和的病毒变体。基于明确中和的变体的选择，在中和的毒株中确定几何平均数ic50。[0085]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段当以多至20μg/ml的抗体浓度在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对schoofs等,immunity,2019jun18；50(6):1513-1529.e9中所记载的119-多进化枝病毒组的中和毒株，表现小于0.2μg/ml、优选小于0.1μg/ml、更优选小于0.08μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml的中和效力(几何平均数ic50)。[0086]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，抗体或其结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对hiv-1假病毒89-f1_2_25(89-f1_2_25env基因，genbank:hm215349.1)，表现小于0.05μg/ml、优选小于0.02μg/ml、更优选至多0.01μg/ml、甚至更优选小于0.01μg/ml的中和效力(ic50)。[0087]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，抗体或其结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，针对hiv-1假病毒6546.v4.c1(6546.v4.c1env基因，genbank:hm215332.1)，表现小于10μg/ml、优选小于1μg/ml、更优选小于0.5μg/ml、甚至更优选小于0.05μg/ml、甚至更优选至多0.01μg/ml、特别优选小于0.01μg/ml的中和效力(ic50)。[0088]hiv-1假病毒89-f1_2_25似乎是最难以由已知cd4结合位点抗体中和的毒株之一。事实上，还没有先前已知的靶向cd4结合位点的抗体被证明以低于0.194μg/ml的ic50值成功中和所述假病毒。然而，根据本发明所述的抗体能够以高得多的效力中和所述毒株。[0089]hiv-1假病毒6545.v4.c1也似乎是极其难以由已知cd4结合位点抗体中和的毒株。还没有先前已知的靶向cd4结合位点的抗体被证明以低于0.091μg/ml的ic50值成功中和所述假病毒。然而，根据本发明所述的抗体能够以高得多的效力中和所述毒株。[0090]根据本发明的一个优选实施方案，抗体或结合片段在tzm-bl细胞假病毒中和试验中测试时，以小于0.1μg/ml、优选小于0.05μg/ml的ic50浓度中和所有yu2假病毒变体，所述变体包含具有包膜突变n279k、n280y、g458d、g459d、或g471r(根据hiv-1hxb2包膜基因；genbank:k03455编码残基)之一的yu2包膜基因(genbank:m93258.1)。[0091]突变n279k、n280y、g458d、和g459d已与hiv-1感染的体内模型中用cd4结合位点抗体治疗期间的病毒反弹的发展相关(即治疗失败)，并且表明针对施用的cd4结合位点抗体的病毒抗性的发生(klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43)。再次，根据本发明所述的抗体优于现有技术的已知cd4结合位点抗体，因为上述提及的yu2包膜基因中的突变不消除中和作用并且不起到针对根据本发明所述的抗体的逃逸突变的作用。[0092]根据本发明的另一优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，导致在治疗4周后、优选治疗6周后、甚至更优选治疗8周后测定时，在治疗开始时具有至少5000个拷贝/ml血浆的hiv-1rna载量的经治疗小鼠的至少70％中，血浆中hiv-1rna载量与治疗开始时相比减少至少0.8log10、优选至少1.0log10。[0093]根据本发明的另一优选实施方案，向感染hiv-1nl4-3/bal的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，导致在治疗4周后、甚至更优选治疗6周后测定时，在治疗开始时具有至少30,000个拷贝/ml血浆的hiv-1rna载量的经治疗小鼠的至少60％中，血浆中hiv-1rna载量与治疗开始时相比减少至少1.0log10、优选至少1.5log10、甚至更优选至少1.75log10。[0094]根据前述实施方案的更优选实施方案，人源化小鼠通过以下预先处理4周：一次初始皮下注射1mg的3bnc117或vrc01或二者的组合，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间定期皮下注射0.5mg的3bnc117或vrc01或二者的组合。[0095]感染hiv-1nl4-3/yu2(nl4-3骨架中yu2env，如zhang等,jvirol,2002；76:6332–6343中所记载的)的人源化小鼠在本领域提供了良好建立的模型以研究体内中和hiv-1抗体的抗病毒活性。这些小鼠可以维持稳定的病毒血症水平(即血浆中的hiv-1rna拷贝数)，并显示出与在人中观察到的相似的env基因中hiv-1序列多样性的比率(klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22)。[0096]该模型还用于研究用cd4结合位点抗体的单一疗法的效果(freund等,plospathog,2015,oct30；11(10):e1005238；klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43；freund等,scitranslmed,2017jan18；9(373).pii:eaal2144)。作为单一疗法给药的根据本发明所述的抗体在治疗的小鼠中导致维持的hiv-1病毒载量(load)的抑制，因此优于在抗体单一治疗期间仅观察到hiv-1病毒载量的短暂降低的其它的研究的cd4结合位点抗体。此外，1-18的体内活性优于其它cd4结合位点抗体，在这方面，在小鼠在用cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、或两者的组合预先治疗期间发生病毒反弹之后，也实现维持的病毒抑制。[0097]根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，向感染如zhang等,jvirol,2002jun；76(12):6332-43中所述的hiv-1nl4-3/yu2的人源化小鼠初始皮下注射1mg的所述抗体或其结合片段，接着在3至4天后是在每3天和每4天之间皮下注射0.5mg的所述抗体或其结合片段，不持续至少4周，导致介导对施用的抗体的抗性的cd4结合位点表位(环d，cd4结合环，β23链，v5环，和β24链)中的一种或多种突变的发生。[0098]优选地，对如用于先前实施方案的上下文中的施用的抗体的抗性可定义为，当测试由含有该突变的病毒序列产生的hiv-1假病毒时，在tzm-bl中和假病毒试验中，导致施用的抗体的ic50为至少2.5μg/ml。[0099]在其它cd4结合位点抗体的抗体单一疗法研究中已证实了导致抗体抗性和/或与病毒反弹(即治疗失败)相关的逃逸突变的发展(freund等,plospathog,2015,oct30；11(10):e1005238；klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43；freund等,scitranslmed,2017jan18；9(373).pii:eaal2144)。与这些cd4结合位点抗体相比，本发明的抗体的优势在于它们防止cd4结合位点表位中突变的发展，因此可以防止治疗失败并维持抗病毒活性。[0100]根据本发明的第一方面的另一优选实施方案，向nrg小鼠静脉内注射0.5mg的所述抗体或其结合片段导致注射后10天抗体或其结合片段的可检测血清水平为至少50μgigg/ml血清。[0101]hiv-1中和抗体的药代动力学性质可变化。在人中，目前已知的cd4结合位点抗体似乎具有比靶向v3环的抗体更短的半衰期(mendoza等,nature,2018sep；561(7724):479-484)，在小鼠模型中也进行了观察(klein等,nature,2012dec6；492(7427):118-22；horwitz等,procnatlacadsciusa,2013oct8；110(41):16538-43)。与其它cd4结合位点抗体相比，本发明的抗体是优越的，因为它们在体内较长时间维持较高的血清水平。[0102]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段不包含具有16或19个氨基酸长度的cdrh3和/或其中抗体或其结合片段包含具有18、20或21个氨基酸长度的cdrh3。[0103]根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，抗体或其结合片段不包含如freund等,sci.transl.med.9,eaal2144(2017)中所记载的抗体nc37、nc133、ac40、ac41或ac72的氨基酸序列或不由其组成。[0104]根据本发明的第一方面的优选实施方案，抗体或其结合片段包含来自包括以下的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列，特别优选抗体1-18的重链cdr1至cdr3和轻链cdr1至cdr3氨基酸序列。[0105]根据本发明的具体的优选实施方案，抗体或其结合片段包含选自包括以下的组的一种抗体的重链和轻链的组合：1-18(由seqidno.1的重链氨基酸序列和seqidno.2的轻链氨基酸序列组成)、1-21(由seqidno.3的重链氨基酸序列和seqidno.4的轻链氨基酸序列组成)、1-33(由seqidno.5的重链氨基酸序列和seqidno.6的轻链氨基酸序列组成)、1-54(由seqidno.7的重链氨基酸序列和seqidno.8的轻链氨基酸序列组成)、1-55(由seqidno.9的重链氨基酸序列和seqidno.10的轻链氨基酸序列组成)、2-10(由seqidno.11的重链氨基酸序列和seqidno.12的轻链氨基酸序列组成)、2-22(由seqidno.13的重链氨基酸序列和seqidno.14的轻链氨基酸序列组成)、2-27(由seqidno.15的重链氨基酸序列和seqidno.16的轻链氨基酸序列组成)、2-47(由seqidno.17的重链氨基酸序列和seqidno.18的轻链氨基酸序列组成)、3-59(由seqidno.19的重链氨基酸序列和seqidno.20的轻链氨基酸序列组成)、5-18(由seqidno.21的重链氨基酸序列和seqidno.22的轻链氨基酸序列组成)、8-10(由seqidno.23的重链氨基酸序列和seqidno.24的轻链氨基酸序列组成)、9-23(由seqidno.25的重链氨基酸序列和seqidno.26的轻链氨基酸序列组成)、10-7(由seqidno.27的重链氨基酸序列和seqidno.28的轻链氨基酸序列组成)、8-52(由seqidno.29的重链氨基酸序列和seqidno.30的轻链氨基酸序列组成)、9-89(由seqidno.31的重链氨基酸序列和seqidno.32的轻链氨基酸序列组成)、9-71(由seqidno.33的重链氨基酸序列和seqidno.34的轻链氨基酸序列组成)、1-23(由seqidno.35的重链氨基酸序列和seqidno.36的轻链氨基酸序列组成)、1-29(由seqidno.37的重链氨基酸序列和seqidno.38的轻链氨基酸序列组成)、2-12(由seqidno.39的重链氨基酸序列和seqidno.40的轻链氨基酸序列组成)、2-21(由seqidno.41的重链氨基酸序列和seqidno.42的轻链氨基酸序列组成)、3-07(由seqidno.43的重链氨基酸序列和seqidno.44的轻链氨基酸序列组成)、3-78(由seqidno.45的重链氨基酸序列和seqidno.46的轻链氨基酸序列组成，优选来自包括1-18、1-33、1-55、2-27、1-23、1-29、2-12、2-21、3-07和3-78的组的一种抗体的重链和轻链的组合，更优选来自包括1-18、1-55和2-12的组的一种抗体的重链和轻链的组合，甚至更优选抗体1-18或2-12的重链和轻链的组合，特别优选抗体1-18的重链和轻链的组合。[0106]在本技术的说明书中，可使用抗体命名。需要指出的是，抗体由重链和轻链组成，所述重链和轻链也构成本说明书的一部分。如果通过抗体的命名对抗体进行引用或对seqidno.进行引用，应理解，这些引用方式是可互换的。[0107]本发明进一步涉及一种药物组合物，其包含如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。优选地，所述药物组合物是用于人类受试者的疫苗组合物。[0108]本发明还包括一种试剂盒，其包含如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段和容器。[0109]在一方面，本发明还涉及如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段、如本文所描述的药物组合物和试剂盒用作药物、优选地用作疫苗。[0110]在另一方面，本发明还涉及如本文所定义和进一步描述的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段、如本文所描述的药物组合物和试剂盒用于治疗或预防人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病的用途，优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的用途。[0111]在另一方面，本发明还涉及治疗患有人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病的患者的方法，优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的用途，其中向所述患者施用有效量的根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段或本发明的药物组合物。[0112]在另一方面，本发明还涉及根据本发明的单克隆人抗体或其结合片段或本发明的药物组合物在制备用于治疗人类受试者中由人类免疫缺陷病毒hiv-1导致的疾病、优选地用于治疗或预防人类受试者中获得性免疫缺陷综合征(aids)的药物中的用途。[0113]如本文所描述的本发明的所有实施方案被认为可以以任意组合组合，除非本领域技术人员认为这种组合不具有任何技术意义。[0114]实施例[0115]a)实验方法[0116]单克隆抗体序列的分离[0117]根据由科隆大学的机构审查委员会批准的方案(方案13-364和16-054)获得血液和白细胞清除样品，参与者提供书面知情同意书。通过密度梯度离心分离外周血单核细胞(pbmc)，并于-150℃下贮存在90％fbs和10％dmso中。通过磁性细胞分离从pbmc分离b细胞，并在冰上用抗人cd19-af700、抗人igg-apc、dapi(bd)和hiv-1env诱饵蛋白标记30分钟。hiv-1env诱饵蛋白是bg505sosip.664-gfp(sliepen等,2015)或生物素化(ez-linksulfonhsbiotingandlabelingkit,thermofisher)yu2gp140(yang等,2000)，由链霉亲和素-pe标记。如先前所述分选env-反应性cd19 igg dapi-单细胞(ehrhardt等,2019)。在65℃下用随机六聚体引物np-40、和无rnase的h2o培养分选的细胞1分钟。然后，在rt缓冲液、dntp、dtt、h2o、rnasin、和rnaseout的存在下，使用superscriptiv产生cdna。使用taq聚合酶和先前描述的引物cg_rt(ozawa等,2006,firstpcr)、igg_internalrt(tiller等,2008,secondpcr)、和opt5/opr-primermix(kreer等,2019,bothpcrs)、通过半巢式pcr扩增抗体序列用于单细胞分析。[0118]抗体序列分析[0119]用igblast(ye等,2013)注释具有平均phred评分≥28和240个核苷酸的最小长度的第二pcr产物的序列，并从可变区的框架区(fwr)1修剪至j基因的末端。屏蔽phred评分《16的碱基判读(basecall)，并将具有大于15个屏蔽的核苷酸、移码、或终止密码子的序列排除在进一步的分析之外。为了分析序列的潜在克隆性，将所有的生产重链序列按相同的v基因分组，并确定它们的cdrh3的成对莱文斯坦(levenshtein)距离。当单个序列共享相同的v基因并且具有75％的最小cdrh3同一性时，它们被分为克隆。在随机输入序列10轮之后，选择产生最少数量的未分配(非克隆)序列的结果用于进一步的分析。研究人员手动重新验证所有克隆以便鉴定共有的突变。随后将最初分配给不同克隆但共用相同的vdj基因和氨基酸和/或沉默核苷酸突变的序列分成亚克隆。使用igblast计算与种系的核苷酸序列同一性。[0120]单克隆抗体生产[0121]为了克隆单细胞衍生的抗体，使用单细胞-pcr的第一pcr产物作为模板、并使用q5高保真聚合酶(highfidelitypolymerase)和具有用于随后不依赖于序列和连接的克隆(slic)的表达载体突出端的、类似于v区和j区各自的核苷酸序列的特异性正向引物和反向引物(tiller等,2008)进行扩增。将pcr产物通过如先前所述的slic组装(vonboehmer等,2016)克隆至人抗体表达载体(igg1，κ、或λ链)。通过使用聚乙烯亚胺转染而在hek293-6e细胞中产生抗体。5-7天后，从蛋白g培养和随后的使用0.1m甘氨酸(ph＝3.0)从层析柱中洗脱的上清液中纯化抗体。缓冲液中和后，将缓冲液更换为pbs，并过滤-灭菌，将抗体贮存在4℃下。[0122]假病毒生产[0123]如先前所述，通过与psg3δenv质粒共转染而在hek293t细胞中产生假病毒(doria-rose等,2017；sarzotti-kelsoe等,2014；hraber等,2017；seaman等,2010)。为了产生yu2假病毒突变体组，使用定点诱变将点突变引入编码yu2包膜基因的质粒中。[0124]tzm-bl细胞中和试验[0125]如先前所述进行中和试验(sarzotti-kelsoe等,2014；seaman等,2010)。小鼠白血病病毒(mulv)-假型病毒用于确定非特异性活性。一式两份地测试抗体。对于假病毒突变体和全球性参考组的试验，在添加荧光素/裂解缓冲液后确定生物发光(tris-hcl中10mmmgcl2、0.3mmatp、0.5mm辅酶a、17mmigepal(全部sigma-aldrich)、和1mmd-荧光素(goldbio))。[0126]hiv-1感染的人源化小鼠[0127]如先前所述(klein等,2012)并进行了修改，产生人源化小鼠。nod.cg-rag1tm1momil2rgtm1wjl/szj(nrg)小鼠在出生5天内和亚致死辐射后3-6小时、通过肝内注射人cd34 造血脐带血和/或胎盘组织干细胞而人源化。使用从转染的hek293t细胞的上清液收获的能够复制的重组hiv-1yu2(nl4-3骨架中yu2env(zhang等,2002))或hiv-1bal(nl4-3骨架中balenv)，通过腹膜内攻击感染人源化小鼠。[0128]hiv-1病毒载量测定[0129]使用包括柱上dnasei消化步骤的minelutevirusminispin试剂盒从edta血浆样品提取血浆rna。病毒载量通过使用先前所述的pol-特异性引物的定量实时pcr来确定(horwitz等,2013)。使用taqmanrna-to-ct1-step试剂盒在lightcycler480ii上进行qpcr。病毒载量通过包含每次qpcr运行中衍生自已知拷贝数的样品的标准曲线来定量。确定qpcr的精确度的极限值为384个拷贝/ml。假定拷贝数为383个拷贝/ml来计算病毒载量《384个拷贝/ml的log10变化。[0130]hiv-1感染的人源化小鼠的抗体治疗[0131]皮下注射稀释于pbs中的抗体。在1mg负载剂量后，每3-4天注射0.5mg的剂量。[0132]人源化小鼠中hiv-1的单基因组测序[0133]为了确定在hiv-1感染的人源化小鼠的抗体治疗期间hiv-1env基因中潜在逃逸突变的发展，提取的血浆rna用于使用superscriptiv和反义引物yb383产生cdna(horwitz等,2017)，随后进行rnaseh培养。然后，使用taq聚合酶和引物yb383和yb50用于第一pcr、和引物yb49和yb52用于第二pcr，进行有限稀释巢式pcr以扩增单基因组envcdna(schoofs等,2019)。如先前所述(kryazhimskiy等,2014；schoofs等,2016)并进行了修改，对稀释度《30％pcr效率的阳性pcr反应使用illumina染料测序进行测序。在标记(tagmentation)、通过有限循环pcr来添加标签(indices)和接头、以及纯化之后，在illuminamiseq上测序pcr产物并组装读出(gaebler等,2019)。分析了具有少于10个模糊度(读出中《75％核苷酸同一性)的全长env序列。[0134]确定对于hiv-1env结合的竞争的elisa[0135]使用ezlinksulfonhs生物素和标记试剂盒(thermofisher)，根据制造商的说明，将抗体1-18、1-55和2-12生物素化，然后将缓冲液更换为pbs。在4℃下用2μg/ml的抗-6xhis标签抗体将高结合elisa板包被过夜。在37℃下用pbs中3％bsa封闭孔60分钟，在37℃下用pbs中2μg/ml的bg505sosip.664-his(sanders等,2013)培养60分钟。在室温下以起始于pbs中32μg/ml的浓度以1:3稀释培养竞争抗体60分钟。将感兴趣的生物素化抗体在pbs中3％bsa中稀释为0.5μg/ml，并在室温下培养60分钟，然后过氧化物酶-链霉亲和素在pbs中在1％bsa/0.05％tween20中1:5,000稀释。在添加abts溶液后，在微孔板读板机上确定415nm处的吸光度。在各个步骤之间用pbs中0.05％tween20洗涤板。[0136]体内抗体药代动力学分析[0137]用200μlpbs中0.5mg的抗体静脉内注射nrg小鼠。如先前所述(klein等,2012)并进行了略微的修改，通过elisa确定人igg的总血清浓度。简言之，在室温下以2.5μg/ml的浓度用抗人igg将高结合elisa板包被过夜。然后，用封闭缓冲液(pbs中2％bsa、1μmedta、和0.1％tween20)封闭孔。在室温下培养人igg1κ标准物(一式两份)和pbs中血清样品的系列稀释90分钟，随后在室温下用封闭缓冲液中1:1,000稀释的hrp-缀合的抗人igg培养90分钟。在添加abts之后，使用微孔板读板机确定415nm处的光密度。在各个步骤之间用pbs中0.05％tween20洗涤板。在抗体注射前获得的血清样品用于确证基线不存在人血清igg。[0138]b)本发明的抗体的具体实例[0139]实施例i-来自hiv-1感染的精英中和剂(eliteneutralizer)的广泛且强力的vh1-46衍生的hiv-1中和抗体的分离[0140]从先前在体外试验中鉴定为具有优异的针对hiv-1的血清中和活性的hiv-1感染个体分离出对hiv-1包膜蛋白具有反应性的人b细胞。[0141]为此，用荧光染料标记的可溶性hiv-1env蛋白(yu2gp140或bg505sosip.664)培养分离的b细胞，并进行单细胞分选(ehrhardt等,2019)。该方法使得随后能够通过pcr从单个hiv-1env-反应性b细胞扩增重抗体基因片段和轻抗体基因片段。这允许将pcr产物克隆至表达载体中用于重组生产由单个b细胞编码的相应抗体，使得能够进行抗体的功能试验。[0142]从对hiv-1-env反应性b细胞的序列的分析，可以鉴定扩增的vh1-46衍生的b细胞克隆。这些克隆之一的特征在于6个氨基酸(aa)插入重链cdr1区，该克隆表示为重链(seqid:47)和轻链(seqid:48)的共有序列。鉴定了三种另外的b细胞克隆，它们彼此之间以及与前述克隆之间共有相似性。这些另外的克隆不携带6aacdrh1插入，但在其轻链的框架区1中显示2aa缺失。这些克隆表示为重链(seqid:49)和轻链(seqid:50)的分别的共有序列。[0143]产生了代表所鉴定的vh1-46衍生的b细胞克隆的总计23种抗体作为单克隆抗体。为了确定它们的整体中和效力和宽度，在tzm-bl细胞中和试验中，针对称作“全球性组”的12种hiv-1假病毒株的参考组，测试这些抗体的中和活性(图1)。该假病毒组先前设计为全球性hiv-1流行病的多样性的代表，并且使得能够进行中和抗体的活性的标准化评价。[0144]值得注意的是，所有分离的vh1-46衍生的抗体针对12种hiv-1参考毒株的至少11种表现出高中和活性(图1)。由seqid47和48表示的vh1-46衍生的抗体证明了针对所有测试毒株的活性。除了它们的中和宽度以外，测试的vh1-46衍生的抗体也表现出高的中和效力。中和效力通常由50％抑制浓度(ic50)表示。当针对“全球性组”进行试验时，所有测试的vh1-46衍生的抗体针对中和的病毒株具有高活性，几何平均数ic50为0.2μg/ml以下(图1)。[0145]实施例ii-cd4结合位点作为本发明的抗体的靶标的鉴定[0146]为了确定根据本发明抗体的表位，研究了在已知特异性的抗体的存在下，代表性抗体1-18、1-55、和2-12对bg505sosip.664的hiv-1包膜三聚体的结合。检测了cd4结合位点抗体3bnc117、n6和vrc01的干扰(图2)。这表明本发明的抗体靶向cd4结合位点以及与cd4结合位点结合的其它抗体的表位重叠的表位。[0147]实施例iii-抗体1-18、1-55、和2-12的高效力和宽度[0148]为了证实分离的vh1-46衍生的hiv-1抗体的中和效力和宽度，如schoofs等,2019中先前试验的，针对119种hiv-1假病毒的扩展组单个地测试了代表性抗体1-18、1-55和2-12。该假病毒组代表了在seaman等,2010中详细描述的假病毒组的发展。它提供了hiv-1env变体的遗传和全球多样性的代表。它包括不同进化枝或亚型的hiv-1变体，包括分离自传播/初始病毒和难以中和病毒的变体。[0149]值得注意的是，在对119-假病毒多进化枝组进行试验时，测试的本发明的vh1-46衍生的抗体表现出高的中和效力和宽度(图3)。特别地，当以多至20μg/ml的抗体浓度测试时，抗体1-18中和了96.6％的测试的假病毒，并针对中和的假病毒显示0.048μg/ml的几何平均数ic50(图3)。该宽度和效力高于其它同样靶向cd4结合位点的hiv-1中和抗体，所述抗体衍生自vh1-2-基因片段，并处于临床试验的晚期(3bnc117和vrc01)(图3)。而且，119-多进化枝组中抗体1-18的效力高于临床试验中另一种vh1-2衍生的cd4结合位点抗体n6的效力(图3)。[0150]另外，当与其它靶向cd4结合位点的vh1-46衍生的hiv-1中和抗体相比较时，对于针对总计62种相同hiv-1假病毒的结果为可获得的(yoon等,2015)，本发明的代表性vh1-46衍生的抗体表现出更高的效力和宽度(图4)。[0151]实施例iv-针对其它cd4结合位点抗体不良中和的假病毒的中和活性[0152]尽管cd4结合位点抗体可实现高水平的中和宽度(即，具有针对大量不同hiv-1env变体的活性)，但存在抗体抗性hiv-1变体。因此，鉴定针对此类hiv-1变体为高活性的新的cd4结合位点抗体是重要的。[0153]与在临床试验的晚期阶段中的cd4结合位点抗体(n6、3e3nc117、vrc01)相比，本发明的抗体以高得多的效力(即它们具有较低的ic50)中和几种毒株(代表性成员1-18、1-55和2-12示于图5)。[0154]例如，当以多至20μg/ml的浓度在tzm-bl假病毒中和试验中测试时，包括病毒株89-f1_2_25的hiv-1env蛋白的假病毒不被临床试验中的cd4结合位点抗体(n6、3bnc117、vrc01)中和(即，这些抗体没有达到针对该特定病毒的ic50)(图5)。此外，中和抗体数据库catnap(yoon等,2015)中列出的30种cd4结合位点igg抗体中，89.7％(26/29)的抗体根本不能中和该病毒(即ic50》20μg/ml)。在中和该病毒的三种抗体中，nc37的ic50为17.7μg/ml，vrc16的ic50为3.12μg/ml，vh1-69基因衍生的抗体vrc13的ic50为0.19μg/ml。相反，本发明的代表性抗体(1-18、1-55、和2-12)以非常高的效力(ic50分别为0.007、0.014、和0.006μg/ml)中和hiv-1假病毒89-f1_2_25，本发明的所有其它抗体也是如此(所有抗体的ic50在0.006和0.025μg/ml之间，参见图12)。对共同的cd4结合位点抗体为高度抗性的另一病毒株是毒株6545.v4.c1。该毒株对75％的中和抗体数据库catnap(yoon等,2015)中列出的43种cd4结合位点igg抗体具有抗性。最重要的是，处于晚期的cd4结合位点抗体都不能够有效(ic50《10μ/ml)中和该毒株(n6的ic50：16.23；3bnc117的ic50：》20；vrc01的ic50：》20；vrc07-523-ls的ic50：》20)。相反，本发明的所有抗体以0.008和9.37μg/ml之间的ic50强力中和该毒株(图12)。[0155]因此，本发明的抗体提供了通过cd4结合位点抗体对病毒89-f1_2_25和6545.v4.c1的不良中和的解决方案。当针对89-f1_2_25进行试验时，本发明的抗体比前述的针对该病毒的最佳cd4结合位点抗体更强力约1log10。[0156]实施例v-针对具有赋予对其它cd4结合位点抗体抗体的抗性的cd4结合位点突变的假病毒的中和活性[0157]由cd4结合位点逃逸突变的发展介导的抗体抗性导致hiv-1感染的抗体治疗的治疗失败(klein等,2012)。因此，关键是鉴定不受这些逃逸突变影响的cd4结合位点抗体以提供用于携带这些突变的hiv-1变体的治疗选择。[0158]在tzm-bl细胞中和试验中，针对具有特定cd4结合位点突变的yu2假病毒变体组测试cd4结合位点抗体(图6)。cd4结合位点中的突变影响先前已知的cd4结合位点抗体的活性(图6)。例如，cd4结合位点抗体vrc01和8anc131针对野生型yu2假病毒的ic50分别为0.107μg/ml和0.256μg/ml，但是针对任何测试的环d突变体没有观察到中和(即，在多至2.5μg/ml的测试抗体浓度下无ic50)。另一种cd4结合位点抗体n6受到突变n279k的影响(图6)。相反，测试的本发明的代表性抗体(1-18、1-55和2-12)针对测试的yu2假病毒变体维持高中和活性(图6)。[0159]因此，本发明提供了对针对具有cd4结合位点中突变的病毒变体的cd4结合位点抗体的抗性的解决方案。[0160]实施例vi-hiv-1感染的体内模型中通过抗体单一疗法维持病毒抑制[0161]感染hiv-1yu2(zhang等,2002)的人源化小鼠提供了一种研究体内中和hiv-1抗体的抗病毒活性的模型。为了产生人源化小鼠，出生后的第一天内对免疫缺陷型nrg小鼠进行照射，并肝内注射人造血cd34 干细胞。这导致可被能够复制的hiv-1感染的人淋巴细胞的发育。这些小鼠可维持稳定的病毒血症水平(即血浆中hiv-1rna拷贝数)，并显示出与在人中观察到的类似的hiv-1序列多样性的比率(klein等,2012)。该小鼠模型先前已经用于确定作为体内单一疗法给药的几种cd4结合位点抗体的抗病毒活性(179nc75：freund等,2015；3bnc117：horwitz等,2013；45-46g54w：klein等,2012；nc37：freund等,2017)。在所有这些研究中，仅观察到对病毒载量的短暂效果，并且病毒反弹(即病毒血症恢复至基线水平)迅速发展。此外，这种病毒反弹与抗体靶位点中的突变的发展有关。因此，需要在作为单一疗法给药时能够维持病毒抑制的新的cd4结合位点抗体。[0162]当用cd4结合位点抗体3bnc117、vrc01、或其组合治疗hiv-1yu2感染的人源化小鼠时(皮下(s.c.)给药每抗体1mg负载剂量，随后每3-4天皮下给药0.5mg)，仅观察到hiv-1rna拷贝数的短暂减少，并且在大多数小鼠中，病毒血症在2-3周内恢复至基线水平(图7)。相反，当根据相同的给药方案用本发明的代表性抗体1-18治疗小鼠时，在8周的治疗期间、在所有治疗的小鼠中，观察到与治疗开始时的病毒拷贝数相比较的病毒抑制(图7)。在≥80％的小鼠中，hiv-1rna血浆拷贝数降低至低于所用试验的精确度极限(384个拷贝/ml)的水平。[0163]因此，本发明的抗体即使在作为单一疗法给药时，能够在hiv-1yu2感染的人源化小鼠中有效维持病毒抑制。[0164]而且，当如上所述用cd4结合位点抗体3bnc117或vrc01治疗hiv-1bal感染的人源化小鼠时，仅观察到hiv-1rna拷贝数的略微且短暂的减少，并且在大多数小鼠中，在2周内病毒血症恢复至基线水平(图13)。相反，当根据相同的给药方案用本发明的代表性抗体1-18治疗小鼠时，在6周的治疗期间、在所有治疗的小鼠中，观察到与治疗开始时的病毒拷贝数相比较的病毒抑制(图13)。[0165]因此，本发明的抗体即使在作为单一疗法给药时，能够在hiv-1bal感染的人源化小鼠中有效维持病毒抑制。[0166]实施例vii-防止抗体单一治疗期间cd4结合位点中病毒突变的发展[0167]由cd4结合位点抗体的抗体单一治疗期间的病毒反弹通常与抗体靶位点中病毒序1-specificbcellresponses.j.exp.med.[0180]ehrhardtetal.,(2019)polyclonalandconvergentantibodyresponsetoebolavirusvaccinervsv-zebov.natmed.25,1589-1600.[0181]freund,n.t.,etal.(2015).anewglycan-dependentcd4-bindingsiteneutralizingantibodyexertspressureonhiv-1invivo.plospathog.11,:e1005238.[0182]freund,n.t.,etal.(2017).coexistenceofpotenthiv-1broadlyneutralizingantibodiesandantibody-sensitivevirusesinaviremiccontroller.scitranslmed.9,eaal2144[0183]gaebler,c.,etal.(2019).combinationofquadruplexqpcrandnext-generationsequencingforqualitativeandquantitativeanalysisofthehiv-1latentreservoir.j.exp.med.[0184]horwitz,j.a.,etal.(2013).hiv-1suppressionanddurablecontrolbycombiningsinglebroadlyneutralizingantibodiesandantiretroviraldrugsinhumanizedmice.proc.natl.acad.sci.usa110,16538-16543.[0185]horwitz,j.a.,etal.(2017).non-neutralizingantibodiesalterthecourseofhiv-1infectioninvivo.cell170,637-648e610.[0186]hraber,p.,etal.(2017).panelsofhiv-1subtypecenvreferencestrainsforstandardizedneutralizationassessments.j.virol.91.[0187]klein,f.,etal.(2012).hivtherapybyacombinationofbroadlyneutralizingantibodiesinhumanizedmice.nature492,118-122.[0188]kreer,c.,etal.(2019).openprimerformultiplexamplificationofhighlydiversetemplates.biorxiv.https://doi.org/10.1101/847574[0189]kryazhimskiy,s.,etal.(2014).microbialevolution.globalepistasismakesadaptationpredictabledespitesequence-levelstochasticity.science344,1519-1522.[0190]mendoza,p.,etal.(2018).combinationtherapywithanti-hiv-1antibodiesmaintainsviralsuppression.nature561,479-484.[0191]pietzsch,j.,etal.(2010).humananti-hiv-neutralizingantibodiesfrequentlytargetaconservedepitopeessentialforviralfitness.j.exp.med.207,1995-2002.[0192]sanders,r.w.,etal.(2013).anext-generationcleaved,solublehiv-1envtrimer,bg505sosip.664gp140,expressesmultipleepitopesforbroadlyneutralizingbutnotnon-neutralizingantibodies.plospathog.9,e1003618.[0193]sarzotti-kelsoe,m.,etal.(2014).optimizationandvalidationofthetzm-blassayforstandardizedassessmentsofneutralizingantibodiesagainsthiv-1.j.immunol.methods409,131-146.[0194]schoofs,t.,etal.(2016).hiv-1therapywithmonoclonalantibody3bnc117elicitshostimmuneresponsesagainsthiv-1.science352,997-1001.[0195]seaman,m.s.,etal.(2010).tieredcategorizationofadiversepanelofhiv-1envpseudovirusesforassessmentofneutralizingantibodies.j.virol.84,1439-1452.[0196]sliepen,k.,etal.(2015).engineeringandcharacterizationofafluorescentnative-likehiv-1envelopeglycoproteintrimer.biomolecules5,2919-2934.[0197]tiller,t.,etal.(2008).efficientgenerationofmonoclonalantibodiesfromsinglehumanbcellsbysinglecellrt-pcrandexpressionvectorcloning.j.immunol.methods329,112-124.[0198]vonboehmer,l.,etal.(2016).sequencingandcloningofantigen-specificantibodiesfrommousememorybcells.nat.protoc.11,1908-1923.[0199]yang,x.,etal..(2000).characterizationofstable,solubletrimerscontainingcompleteectodomainsofhumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteins.j.virol.74,5716-5725.[0200]ye,j.,etal.(2013).igblast:animmunoglobulinvariabledomainsequenceanalysistool.nucleicacidsres.41,w34-40.[0201]yoon,h.,etal.(2015).catnap:atooltocompile,analyzeandtallyneutralizingantibodypanels.nucleicacidsres.43,w213-219.[0202]zhang,y.j.,etal.(2002).envelope-dependent,cyclophilin-independenteffectsofglycosaminoglycansonhumanimmunodeficiencyvirustype1attachmentandinfection.j.virol.76,6332-6343.当前第1页12当前第1页12
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