高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用

高产
β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用。


背景技术：

2.天然色素是食品添加剂的一个重要部分。其中，栀子蓝色素是一种天然水溶性色素，耐热、耐光、耐酸碱，ph适应范围广，广泛应用于食品中，如饮料、葡萄酒、甜点等。栀子蓝色素是一种长链的异戊二烯衍生物，是栀子苷在β-葡萄糖苷酶水解栀子苷得到京尼平，再与氨基酸发生聚合反应所生成的产物。β-葡萄糖苷酶是决定色素性质的关键酶。目前为止，利用枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酵母、嗜热菌海栖热袍菌的β-葡萄糖苷酶，或者在大肠杆菌中外源表达β-葡萄糖苷酶的方法转化栀子苷得到栀子蓝色素。然而，这些微生物不是完全安全的微生物，其众多外毒素使其在食品生产方面受到制约，涉及到繁琐、复杂的后续产物提取工艺。同时，目前研究的大多数产β-葡萄糖苷酶的菌株所产的酶量较低，且活性不高，满足不了工业生产的试剂需求。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用的技术方案。
4.本发明具体通过以下技术方案实现：
5.本发明的一个目的是提供一株高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，其为植物乳植杆菌s3(lactiplantibacillus plantarum s3)，已于2022年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏名称为植物乳植杆菌s3(lactiplantibacillus plantarum s3)，菌种保藏编号为cgmcc no.24649。
6.本发明的另一个目的是提供该高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌在生产β-葡萄糖苷酶中的应用。
7.本发明的另一个目的是提供该高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌在栀子苷转化成栀子蓝色素中的应用。
8.本发明的另一个目的是提供该高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌在栀子苷转化成京尼平中的应用。
9.本发明利用筛选的高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌能够高效转化栀子苷为栀子蓝色素，转化效率高，同时保证了转化过程中的安全性。可直接利用发酵方法，利用培养基中的氨基酸成分，在短时间内转化栀子苷成分，生产出高质量环保型的栀子蓝色素，可应用于栀子蓝色素工业生产中。
附图说明
10.图1为高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选图；
11.图2筛选菌株的系统树；
12.图3为高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的酶活性、生长曲线图；
13.图4为高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌水解栀子苷为京尼平的转化能力图。
具体实施方式
14.以下结合实施例来进一步说明本发明。
15.本发明实施例中所用到的培养基如下:
16.培养基的配方：
17.分离高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的培养基：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％,k2hpo
4 0.2％，柠檬酸二铵0.2％，乙酸钠0.5％，葡萄糖2％，吐温80 0.1ml,mgso4·
7h20 0.058％，mnso4·
4h2o 0.025％，琼脂2％，栀子苷1％。本文中培养基中的“％”含义指100ml培养基中含有某成分多少g。
18.实施例1：高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选
19.(1)发酵食品中高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的初筛
20.选取泡菜、酸奶两种发酵食品，分别吸取100μl泡菜汁、酸奶加入900μl 0.85％nacl溶液稀释至不同浓度(10-2
～10-4
)，涂布到平板上，做好标记，在37℃培养24h后观察并挑选菌落。结果，在泡菜和酸奶样品生长的培养基上分别挑选10个和8个单独的菌落，编号p1～p10、s1～s8。
21.(2)高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的复筛
22.栀子苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成葡萄糖和京尼平，再与氨基酸反应生成栀子蓝色素。因此，在上述分离高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的培养基平板上，划线接种初筛得到的18个菌种的稀释液，在37℃培养48h后观察其是否菌落的周围出现了蓝色物质。
23.测定结果：如图1所示，s3菌落周围蓝色最明显，说明该菌株的β-葡萄糖苷酶活性高。
24.实施例2：高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的鉴定
25.将筛选得到的菌株通过测试16s rrna测序做菌株的鉴定。测序序列结果与ncbi数据库中进行blast同源序列比对，以确定菌株的种属，同源性超过99％即可鉴定至种。与同源性较高的菌株利用软件mega-x中的临位相连法构建系统进化树。
26.测定结果：筛选菌株的16s rrna测序结果如下。
27.筛选菌株s3的16s rrna的基因序列(如seq id no.1所示)：
28.[0029][0030]
如表1所示，筛选菌株s3菌株为lactiplantibacillus plantarum，与标准菌株lactobacillus plantarum imau98319有99.79％的同源性。
[0031]
表1高产β-葡萄糖苷酶植物乳植杆菌鉴定结果
[0032][0033]
如图2所示，筛选菌株lactiplantibacillus plantarum s3与lb.plantarum imau98319的进化距离最小，与其他的lb.plantarum spp.,lb.plantarum sourdough,
lb.pentosus的进化距离相对远。
[0034]
同时，将该菌株lactiplantibacillus plantarum s3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏名称为植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)，保藏时间为：2022年04月06日，菌种保藏编号为cgmcc no.24649。
[0035]
实施例3：lactiplantibacillus plantarum s3的生长曲线及β-葡萄糖苷酶活性曲线
[0036]
pnpg(对硝基苯酚葡萄糖苷)作为底物，测定lactiplantibacillus plantarum s3的β-葡萄糖苷酶活性及生长曲线。在mrs培养基中培养24h，离心(7000g，15min，4℃)收集细胞，在pbs溶液(50mm，ph 7.0)超声细胞，得到粗酶。将粗酶(0.1ml)添加到1ml底物溶液中(2mm pnpg在pbs缓冲液中，ph 7.0)，使用酶标仪在405nm测定o.d值。酶活性定义为每分钟产生1μmol pnp所需的酶量。在600nm测定生长曲线(图3)。
[0037]
测定结果：lactiplantibacillus plantarum s3菌株在生长3h后进入对数生长期，菌体急剧增加，12h～24h达到生长稳定期，此时活菌数保持相对稳定。其酶活性在培养大约9h后开始有酶活性，酶活性随着时间增加，最高达到1.01unit/ml。
[0038]
实施例4：lactiplantibacillus plantarum s3对49种碳水化合物利用能力
[0039]
利用api 50ch测定lactiplantibacillus plantarum s3对碳水化合物的利用能力。菌株在mrs培养基中培养24h活化，制备两个麦氏浊度的悬浮液，然后将悬浮液加到试剂条上的50个微生化管中。当细菌可利用底物中的不同物质为唯一碳源时，如细菌能够利用或生长，颜色就改变，以阳性( )表示，颜色稍有改变，以(
±
)表示，如细菌不能利用碳源，颜色没有改变，以阴性(-)表示。
[0040]
测定结果：lactiplantibacillus plantarum s3能够利用48种碳水化合物，不能利用葡萄糖酸酯(gluconate)(表2)
[0041]
表2 lactiplantibacillusplantarum s3对不同碳水化合物及衍生物的发酵能力
[0042][0043]
实施例5：lactiplantibacillus plantarum s3对栀子苷的转化能力
[0044]
将活化好的菌株经过离心(7000g，10min)后将上清液丢弃，用缓冲溶液(50mm phosphate溶液)洗涤，得到活菌(浓度达到50mg/ml)。加入栀子苷进行24h的转化。分别于0、1、2、3、6、12、24h取样2ml，离心后取上清液，0.22μm过滤待用。
[0045]
高效色谱检测，色谱条件如下：色谱柱：tc-c18(250
×
4.6mm,5μm)；检测器：紫外检测器；检测波长：238nm；流动相：甲醇：水＝45:55，流速：0.8ml/min。
[0046]
对产生的栀子蓝色素，利用色差仪测定色素的色差(a，b，l值)。
[0047]
测定结果：如图4所示，lactiplantibacillus plantarum s3菌株24h转化之后，所有的栀子苷转化为京尼平和栀子蓝色素。6h，栀子苷转化率达到64％；12h，栀子苷转化率达到92％；24h，栀子苷的转化率达到100％。产生的栀子蓝色素的色差为：l值44.44；a值-0.25；b值-4.02。