一种抗菌肽GW18及其应用的制作方法

一种抗菌肽gw18及其应用
技术领域
1.本发明属于抗菌肽技术领域，具体涉及一种抗菌多肽gw18及其应用。


背景技术：

2.宿主自身的天然免疫系统是其抵御外界病原体入侵的重要保障，它依靠多种免疫细胞和活性小分子物质发挥作用。抗菌肽正是动物主动防御体系中的一种重要多肽，其是由宿主基因编码，在各种生物体内分布广泛。作为天然免疫应答的重要物质基础，抗菌肽可以在宿主的获得性免疫启动之前快速对外界细菌的感染作出应答。天然的抗菌肽在水环境中溶解性良好，在极端的温度条件下和强酸强碱环境中依旧能保持结构稳定性和抗菌活性。相关研究表明抗菌肽的杀菌机制通常是作用于细菌的细胞膜表面使得细胞膜凹陷或出现孔洞导致细菌内容物外泄而引起细菌死亡，包括利用静电作用吸附在细菌细胞膜表面，然后插入其疏水区来改变膜的构象，再进一步引起离子通道开放离子外泄而杀菌。
3.抗生素是最伟大的药物发明之一，它的出现挽救了无数患者的生命，可是随着抗生素被越来越多的使用，耐药菌株的数量也随之增加，临床治疗的药物选择面临困难，因此新型抗菌药物的开发迫在眉睫。抗菌肽具有杀菌速度快、热稳定性和酸碱稳定性良好且不易产生耐药性的特点，在感染的药物开发方面有着广阔的应用前景。但是，现有抗菌肽虽然有生物学活性，但是存在溶血、细胞毒性等副作用，体内稳定性差等缺陷，很难实现临床应用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗菌多肽gw18及其应用，所述抗菌多肽gw18具有较高的抗菌效果，同时溶血活性低，无细胞毒性，稳定性高，具有较好的优势和运用前景。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种抗菌多肽gw18，所述抗菌多肽gw18的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，所述抗菌多肽gw18为直链多肽，且c末端酰胺化。
8.优选的，所述抗菌多肽gw18的分子量为2365.70da，等电点为6.84。
9.本发明提供了一种抗菌组合物，包括上述抗菌多肽gw18和辅料。
10.优选的，所述辅料包括填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和表面活性剂中的一种或多种。
11.优选的，还包括药品原料，所述药品原料包括抗生素、蛋白、多肽、植物提取物和细胞因子中的一种或多种。
12.本发明还提供了上述抗菌多肽gw18或上述抗菌组合物在制备消杀细菌的药品中的应用。
13.优选的，所述细菌包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、大肠杆菌
(escherichia coli)和鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)。
14.本发明还提供了上述抗菌多肽gw18或上述抗菌组合物在制备调节皮肤微生物的医美产品中的应用。
15.本发明还提供了一种调节皮肤微生物的医美产品，包括上述抗菌多肽gw18或上述抗菌组合物。
16.有益效果：本发明提供了一种氨基酸序列如seq id no.1所示的抗菌多肽gw18，经实施例验证，所述抗菌多肽gw18具有较强的抗菌功能，对金黄色葡萄球菌标准菌株(staphylococcus aureus，atcc2592)、大肠杆菌标准菌株(escherichia coli，atcc25922)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii，atcc22933)的最小抑菌浓度均为分别是2.38μg/ml、4.76μg/ml和9.52μg/ml；并且所述抗菌多肽gw18可直接杀灭病原菌，功能显著，作用快速；gw18溶血活性低、无细胞毒性，且稳定性较高，可以运用于抗细菌感染药物或者医美产品。
附图说明
17.图1为本发明所述抗菌多肽gw18对鲍曼不动杆菌的杀菌动力学研究结果，图中co：多粘菌素，gw：gw18；
18.图2为本发明所述抗菌多肽gw18的溶血活性测定结果；
19.图3为本发明所述抗菌多肽gw18的细胞毒活性测定结果；
20.图4为本发明所述抗菌多肽gw18的血浆稳定性结果。
具体实施方式
21.本发明提供了一种抗菌多肽gw18，所述抗菌多肽gw18的氨基酸序列如seq id no.1所示：gly-trp-gly-ala-lys-arg-trp-gly-lys-arg-gly-trp-lys-trp-lys-arg-his-trp。
22.本发明所述抗菌多肽gw18为直链多肽，且c末端酰胺化，因此完整序列为gly-trp-gly-ala-lys-arg-trp-gly-lys-arg-gly-trp-lys-trp-lys-arg-his-trp-nh2或gwgakrwgkrgwkwkrhw-nh2。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(mal di-to f)进行测定，本发明所述抗菌多肽的分子量优选为2365.70da；通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为6.84。
23.本发明对所述抗菌多肽gw18的制备方法并没有特殊限定，优选包括直接合成、原核表达和真核表达等，实施例中通过固相合成的方法制备所述抗菌多肽gw18，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。在本发明实施例中，优选根据seq id no.1所示的序列固相合成法合成得到粗多肽，而后通过hplc反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％，再通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(mal di-to f)测定其分子量，并通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点；最后采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构是否与seq id no.1所示结构一致。
24.本发明所述hplc反相柱层析脱盐纯化的方法，优选包括：将0.1mg待测样品溶于1ml含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相a为0.1％三氟醋酸-水，流动相b为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μ
l；色谱柱为硅胶烷基键合相c18柱(4.6mm
×
300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100a)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相b在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1ml/min，检测波长215nm，25℃下测定。本发明基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的测定方法，优选包括：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/ml的溶液，取10μl与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定，经测定其分子量为2365.70da。本发明通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为6.84，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为gly-trp-gly-ala-lys-arg-trp-gly-lys-arg-gly-trp-lys-trp-lys-arg-his-trp，与seq id no.1所示的氨基酸序列一致。
25.本发明提供了一种抗菌组合物，包括上述抗菌多肽gw18和辅料。
26.本发明所述辅料优选包括填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和表面活性剂中的一种或多种。本发明所述填充剂优选包括淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇中的一种或多种。本发明所述湿润剂和粘合剂，优选包括蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的水溶液或醇溶液中的一种或多种。本发明所述崩解剂，优选包括干淀粉、甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠中的一种或多种。本发明所述润滑剂优选包括硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类和月桂醇硫酸镁中的一种或多种。本发明所述表面活性剂优选包括十二烷基硫酸钠。本发明对所述辅料的具体选择和配比并没有特殊限定，基于所述抗菌组合物的剂型和组成以及功能进行常规选择和配比即可。
27.本发明所述抗菌组合物中优选还包括药品原料，所述药品原料优选包括抗生素、其他蛋白、其他多肽、植物提取物和细胞因子中的一种或多种。本发明所述组合物中优选包括多种不同组成的药品原料和不同的辅料组合。
28.本发明所述细菌优选包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、大肠杆菌(escherichia coli)和鲍曼不动杆菌(acinetobacter.baumannii)。在本发明实施例中，利用所述抗菌多肽gw18对多株细菌的标准菌株验证其最低抑菌浓度，对金黄色葡萄球菌标准菌株(staphylococcus aureus atcc2592)、大肠杆菌标准菌株(escherichia coliatcc25922)和鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanniiatcc22933)的最小抑菌浓度均为分别是2.38μg/ml、4.76μg/ml和9.52μg/ml。本发明还证实了所述抗菌多肽gw18较多粘菌素e更强的抑菌作用，多肽gw18杀菌迅速，在1
×
mic(9.52μg/ml)时，10min内就可表现出明显的杀菌作用，在5
×
mic和10
×
mic浓度时，gw18作用1min后就几乎无鲍曼不动杆菌生长，同时gw18对细菌的作用是致命的，在3h之内细菌的数量不会再持续的增多。
29.本发明利用红细胞和所述抗菌多肽gw18共孵育的方法测定所述抗菌多肽的溶血活性，经测定，即使抗菌多肽gw18的浓度达到320μg/ml时，gw18溶血活性也较低。本发明还利用人胚肾细胞株hek293t测定所述抗菌多肽gw18的细胞毒性，即便抗菌多肽gw18的浓度达到200μg/ml时，所述抗菌多肽gw18也不表现出细胞毒性。本发明还利用所述抗菌多肽gw18与血清进行孵育，共孵育10小时以上，仍然可以检测到抗菌活性，表明所述抗菌多肽gw18的抗菌性能稳定，可将其应用于制备具有消杀细菌的药物，或制备调节皮肤微生物的医美产品。
30.本发明还提供了上述抗菌多肽gw18或上述抗菌组合物在制备消杀细菌的药品中的应用。
31.本发明对所述药品的剂型并没有特殊限定，且所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
32.本发明还提供了上述抗菌多肽gw18或上述抗菌组合物在制备调节皮肤微生物的医美产品中的应用。
33.本发明对所述医美产品的类型并没有特殊限定，优选包括涂抹用、洁面用和/或面膜等。
34.本发明还提供了一种调节皮肤微生物的医美产品，包括上述抗菌多肽gw18或上述抗菌组合物。
35.本发明所述医美产品优选与上述相同，在此不再赘述。
36.下面结合实施例对本发明提供的一种抗菌多肽gw18及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.实施例1
38.抗菌多肽gw18的固相合成
39.1、根据设计的氨基酸序列：gly-trp-gly-ala-lys-arg-trp-gly-lys-arg-gly-trp-lys-trp-lys-arg-his-trp-nh2，用固相合成法合成得到粗多肽；
40.2、将粗多肽通过hplc反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；
41.hplc纯化及鉴定方法：将0.1mg待测样品溶于1ml含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相a为0.1％三氟醋酸-水，流动相b为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μl；色谱柱为硅胶烷基键合相c18柱(4.6mm
×
300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100a)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相b在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1ml/min，检测波长215nm，25℃下测定。
42.3、通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(mal di-to f)测定其分子量为2365.70da；
43.方法：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/ml的溶液，取10μl与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。
44.4、通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为6.84，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为gly-trp-gly-ala-lys-arg-trp-gly-lys-arg-gly-trp-lys-trp-lys-arg-his-trp。
45.实施例2
46.实施例1制备得到的抗菌多肽gw18的抗菌活性
47.实验采用二倍梯度稀释的方法，测定最小抑菌浓度即能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。
48.1、mic值测定
49.具体实验操作如下：准备好新鲜菌液，使用紫外分光光度计检测菌液的od
600
，按照
sulfoxide)100μl，将96孔板放在摇床上缓慢摇晃10分钟待结晶溶解，用酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。结果如图3所示，所述抗菌多肽gw18无细胞毒性。
60.实施例4
61.实施例所述抗菌多肽gw18的稳定性
62.用无菌注射器获取10ml人体血液储存于抗凝管中，在4℃、3500rpm的条件下离心30min，小心吸取黄色上清，即为所需血浆。用无菌生理盐水将上述血浆稀释一倍，并将抗菌多肽gw18加入其中，控制抗菌多肽gw18的终浓度为10mg/ml。随后，把溶有抗菌多肽gw18的血浆放入37℃的恒温培养箱中进行孵育，分别在0、1、2、3、6、10、12、24小时等8个时间点各取10μl，用抑菌圈法检测抗菌多肽gw18与血浆共孵育后其对鲍曼不动杆菌的抗菌活性，每个时间点设置两个重复。结果如图4所示，所述抗菌多肽gw18与血清孵育10小时以上，仍然可以检测到抗菌活性。
63.结合实施例2～4的结果可知，本发明所述抗菌多肽gw18可直接杀灭病原菌，功能显著，作用快速；抗菌多肽gw18溶血活性低、无细胞毒性，且稳定性较高，可以运用于抗细菌感染药物或者医美产品。
64.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。