一种TaqDNA聚合酶突变体及其制备方法和应用与流程

一种taq dna聚合酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于分子诊断检测技术领域，具体涉及一种taq dna聚合酶突变体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.pcr是多聚酶链式反应的简称，由k.bmullis于1985年首创，是体外酶促合成特定dna片段的一种方法，它能在一个试管内将目的基因或dna片段在数小时内扩增十万或数百万倍。这一技术在生物学的许多研究领域已得到广泛的应用。随着该技术的发展，pcr技术也存在一些问题，如非特异性扩增产物的出现、引物二聚体的形成、甚至凝胶电泳上无扩增带，从而限制了pcr技术的应用。热启动pcr技术的问世解决了这些问题，使pcr技术更加完美。
3.基于化学修饰法制备的热启动taq dna聚合酶通常是采用酸酐类化学分子同taq dna酶赖氨酸上的氨基反应；封闭效率高，属于共价修饰，非常稳定，但是往往需要较长时间的激活过程才能释放足够的taq dna聚合酶活性。因此，有些研发人员采用在化学修饰的taq dna聚合酶中添加少量未非封闭的taq dna聚合酶来弥补化学修饰taq酶释放慢的缺点，但是这也会造成一定程度的非特异性反应，相当于是牺牲一部分的特异性换取反应的速度。因此，目前的热启动taq dna聚合酶存在封闭效率低、封闭不稳定、热激活速度慢的缺点。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种taq dna聚合酶突变体，适合化学修饰，保证高封闭效率的同时能被快速热激活的目的，为核酸扩增反应提供有利的工具。
5.本发明提供了一种taq dna聚合酶突变体，在氨基酸序列如seq id no:1所示taq dna聚合酶的基础上经过k231r、k346r和k663r突变得到。
6.本发明提供了一种化学修饰的taq dna聚合酶突变体，将所述taq dna聚合酶突变体经酸酐类化学分子修饰得到。
7.优选的，所述酸酐类化学分子修饰的位点为taq dna聚合酶突变体中赖氨酸的氨基。
8.优选的，所述酸酐类化学分子包括以下至少一种：3,4,5,6-四氢苯酐、1,2,3,4-苯四甲酸二酸酐、3,6-二氯-1,2,4,5-苯四甲酸二酸酐、3,6-二甲基-1,2,4,5-苯四甲酸二酸酐和3,6-二羟基-1,2,4,5-苯四甲酸二酸酐。
9.本发明提供了所述化学修饰的taq dna聚合酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
10.将所述taq dna聚合酶突变体溶解后与酸酐类化学分子溶液混合进行酰化反应，脱盐，得到化学修饰的taq dna聚合酶突变体。
11.优选的，所述taq dna聚合酶突变体和酸酐类化学分子的质量比为(9～11)：1。
12.优选的，所述酰化反应的温度为30～34℃；
13.所述酰化反应的时间为1.5～2.5h。
14.本发明提供了所述taq dna聚合酶突变体、所述化学修饰的taq dna聚合酶突变体或所述制备方法制备的化学修饰的taq dna聚合酶突变体在扩增核酸中的应用。
15.优选的，所述扩增核酸的反应温度包括95～99℃。
16.本发明提供了一种核酸扩增试剂盒，dna聚合酶为所述化学修饰的taq dna聚合酶突变体或所述制备方法制备的化学修饰的taq dna聚合酶突变体。
17.本发明提供了一种taq dna聚合酶突变体，在氨基酸序列如seq id no:1所示taq dna聚合酶的基础上经过k231r、k346r和k663r突变得到。本发明通过特异性的突变taq dna聚合酶的赖氨酸部分基团，在保证酶活性(即封闭效率)没有显著变化的同时能够实现快速活性修复，可能是taq dna聚合酶突变体中赖氨酸的酸酐无效修饰程度低(即修饰后对封闭效率没有影响的位点)，因此脱落所需的能量降低，实现化学修饰后的taq dna聚合酶突变体快速激活。本发明试验表明，与其他种类突变体相比，本发明提供的taq dna聚合酶突变体兼具高封闭效率和快速激活(98℃下30s酶活释放)的特点，为后续核酸扩增提供了基础。
附图说明
18.图1为纯化的taq dna聚合酶突变体的sds-page；
19.图2为酸酐修饰taq dna聚合酶突变体在50℃下的封闭效率；
20.图3为酸酐修饰taqdna聚合酶突变体qpcr中的性能。
具体实施方式
21.本发明提供了一种taq dna聚合酶突变体，在氨基酸序列如seq id no:1所示taq dna聚合酶的基础上经过k231r、k346r和k663r突变得到。
22.在本发明中，所述taq dna聚合酶的氨基酸序列为mgamlplfepkgrvllvdghhlayrtfhalkglttsrgepvqavygfaksllkalkedgdavivvfdakapsfrheayggykagraptpedfprqlalikelvdllglarlevpgyeaddvlaslakkaekegyevriltadkdlyqllsdrihvlhpegylitpawlwekyglrpdqwadyraltgdesdnlpgvkgigektarklleewgsleallknldrlkpairekilahmddlklswdlakvrtdlplevdfakrrepdrerlraflerlefgsllhefgllespkaleeapwpppegafvgfvlsrkepmwadllalaaarggrvhrapepykalrdlkeargllakdlsvlalreglglppgddpmllaylldpsnttpegvarryggewteeageraalserlfanlwgrlegeerllwlyreverplsavlahmeatgvrldvaylralslevaeeiarleaevfrlaghpfnlnsrdqlervlfdelglpaigktektgkrstsaavlealreahpivekilqyreltklkstyidplpdlihprtgrlhtrfnqtatatgrlsssdpnlqnipvrtplgqrirrafiaeegwllvaldysqielrvlahlsgdenlirvfqegrdihtetaswmfgvpreavdplmrraaktinfgvlygmsahrlsqelaipyeeaqafieryfqsfpkvrawiektleegrrrgyvetlfgrrryvpdlearvksvreaaermafnmpvqgtaadlmklamvklfprleemgarmllqvhdelvleapkeraeavarlakevmegvyplavplevevgigedwlsake*(seq id no:1)。所述taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列为mgamlplfepkgrvllvdghhlayrtfhalkglttsrgepvqavygfaksllkalkedgdavivvfdakapsfrheayggykagraptpedfprqlalikelvdllglarlevpgyeaddvlaslakkaekegyevriltadkdlyqllsdrihvlhpegylitpawlwekyglrpdqwadyraltgdesdnlpgvkgigektarklleewgsleallknldrlkpairerilahmddlklswdlakvrtdlplevdfakrrepdrerlraflerlefgsllhefgllespkaleeapwpppegafvgfvlsrkepmwadllalaaarggrvhrapepykalrdlreargllakdlsv
lalreglglppgddpmllaylldpsnttpegvarryggewteeageraalserlfanlwgrlegeerllwlyreverplsavlahmeatgvrldvaylralslevaeeiarleaevfrlaghpfnlnsrdqlervlfdelglpaigktektgkrstsaavlealreahpivekilqyreltklkstyidplpdlihprtgrlhtrfnqtatatgrlsssdpnlqnipvrtplgqrirrafiaeegwllvaldysqielrvlahlsgdenlirvfqegrdihtetaswmfgvpreavdplmrraartinfgvlygmsahrlsqelaipyeeaqafieryfqsfpkvrawiektleegrrrgyvetlfgrrryvpdlearvksvreaaermafnmpvqgtaadlmklamvklfprleemgarmllqvhdelvleapkeraeavarlakevmegvyplavplevevgigedwlsake*(seq idno:2)。
23.在本发明中，所述taq dna聚合酶突变体的制备方法，包括以下步骤：1)人工合成taq dna聚合酶突变体的编码序列(seq id no:4)克隆至pet28a载体中，转化到bl21(de3)宿主菌，筛选阳性转化子；
24.2)将阳性转化子采用iptg诱导表达后，超声破菌，进行deae和肝素柱纯化，得到taq dna聚合酶突变体。
25.在本发明中，所述pet28a载体的克隆位点优选为ncoi和hindiii。所述克隆的方法优选为无缝克隆。本发明对无缝克隆的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的无缝克隆的方法即可。
26.在本发明中，所述iptg诱导表达的条件优选如下：1mm iptg 37℃诱导4h。所述超声破菌的条件优选如下：超声40％功率，开4秒关10秒，超声30分钟。超声破菌时，优选按照1g菌体30ml裂解缓冲液的比例搅拌菌体。所述裂解缓冲液优选包括以下含量组分的水溶液：50mm tris、100mm nacl、0.1mm edta、5％甘油，ph值8.0。
27.在本发明中，在进行deae纯化时，所用的deae平衡缓冲液优选为包含以下含量组分的水溶液：50mm tris 0.1mm edta5％甘油ph8.0，洗脱液优选为包含以下含量组分的水溶液：50mm tris 0.1mm edta 500mm nacl 5％甘油ph8.0。所述肝素柱纯化时，肝素平衡缓冲液优选为包含以下含量组分的水溶液：50mm tris 0.1mm edta 5％甘油ph8.0，洗脱液优选为包含以下含量组分的水溶液：50mm tris 0.1mm edta 500mm nacl 5％甘油ph值8.0。
28.在本发明中，纯化后的taq dna聚合酶突变体用0.1m nahco3，ph值8.5的缓冲液中溶解，配制成浓度为5mg/ml的溶液。
29.本发明提供了一种化学修饰的taq dna聚合酶突变体，将所述taq dna聚合酶突变体经酸酐类化学分子修饰得到。
30.在本发明中，所述酸酐类化学分子修饰的位点优选为taq dna聚合酶突变体中赖氨酸的氨基。所述酸酐类化学分子优选包括以下至少一种：3,4,5,6-四氢苯酐、1,2,3,4-苯四甲酸二酸酐、3,6-二氯-1,2,4,5-苯四甲酸二酸酐、3,6-二甲基-1,2,4,5-苯四甲酸二酸酐和3,6-二羟基-1,2,4,5-苯四甲酸二酸酐。taq dna聚合酶突变体较野生型减少了修饰位点，使化学无效修饰程度低，脱落所需的能量降低，从而大大缩短热激活时间。
31.本发明提供了所述化学修饰的taq dna聚合酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
32.将所述taq dna聚合酶突变体溶解后与酸酐类化学分子溶液混合进行酰化反应，脱盐，得到化学修饰的taq dna聚合酶突变体。
33.在本发明中，所述taq dna聚合酶突变体和酸酐类化学分子的质量比优选为(9～11)：1，更优选为10:1。
34.在本发明中，所述酰化反应的温度优选为30～34℃，更优选为32℃。所述酰化反应
的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。
35.本发明提供了所述taq dna聚合酶突变体、所述化学修饰的taq dna聚合酶突变体或所述制备方法制备的化学修饰的taq dna聚合酶突变体在扩增核酸中的应用。
36.在本发明中，所述扩增核酸的反应温度优选包括95～99℃，更优选为87～98℃。
37.在本发明中，用酸酐修饰的taq dna聚合酶突变体，保证了制备化学修饰taq dna聚合酶高效的封闭效率及快速的酸酐脱落，从而在确保酶活不发生显著变化的情况下实现快速激活酶活的目的，保证核酸扩增反应快速完成。
38.本发明提供了一种核酸扩增试剂盒，dna聚合酶为所述化学修饰的taq dna聚合酶突变体或所述制备方法制备的化学修饰的taq dna聚合酶突变体。
39.在本发明中，所述试剂盒在98℃的扩增缓冲溶液中反应，酶活活性在30秒后释放，大大缩短酶活激活的时间，较其他种类的突变体有较大优势。
40.下面结合实施例对本发明提供的一种taq dna聚合酶突变体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
41.实施例1
42.一种taq dna聚合酶突变体的制备方法
43.taq dna聚合酶突变体(序列seq id no：2)相比于野生型的taq dna聚合酶(seq no.1)有三个突变(k231r，k346r，k663r)。对照例taq dna聚合酶突变体2(k219e，seq id no.3)。3种基因由北京德奥平合成后，经无缝克隆到pet28a载体中，挑选阳性克隆转化到bl21(de3)。
44.采用lb培养基培养转化子，培养至od540nm为0.6时候，加入1mm iptg，37℃诱导4h，12000rpm离心20min收沉淀。按照1g菌体30ml裂解缓冲液的比例(50mm tris、100mm nacl、0.1mm edta、5％甘油ph8.0)重悬菌体，超声破碎后，在12000rpm 30min离心取上清。
45.用deae平衡缓冲液(50mm tris 0.1mm edta5％甘油ph8.0)预处理1ml deae纤维素柱，1ml/min，将上清上样后，用洗脱液(50mm tris 0.1mm edta500mm nacl 5％甘油ph8.0)按照0.5ml/min速度洗脱，收集洗脱峰。用肝素平衡缓冲液(50mm tris 0.1mm edta 5％甘油ph8.0)处理2ml肝素柱，1ml/min，用洗脱液(50mm tris 0.1mm edta 500mm nacl 5％甘油ph8.0)按照0.5ml/min速度进行洗脱，收集od
280
升高的含蛋白峰洗脱液为纯化后的taq dna聚合酶突变体。
46.将纯化后的taq dna聚合酶突变体按照常规方法进行sds-page检测，结果如图1所示。由图1可知，得到目标大小条带即为taq dna聚合酶突变体。
47.实施例2
48.一种化学修饰的taq dna聚合酶突变体的制备方法
49.1)将50mg taq dna聚合酶突变体(分别为k231r、k346r和k663r突变体)溶解到0.1mnahco3，ph8.5的缓冲液中，稀释至浓度为5mg/ml；
50.2)称取3,4,5,6-四氢苯酐5mg，溶解在二甲基亚枫中，浓度为50mg/ml，加入到1)taq dna聚合酶突变体溶液中，32℃震荡反应2h；
51.3)g25脱盐到50mm tris-hcl、50mm nacl、0.1mm edtaph7.8缓冲液中，-20℃度冻存。
52.同时野生型taq dna聚合酶和和k219e突变体也采用同样方法进行化学修饰。
53.实施例3
54.不同种类化学修饰的taq酶活性的测定
55.taq酶的活性测定方法按照taq dna聚合酶国标gb/t 35542-2017法进行测定，并计算相应的比活。
56.结果见表1。
57.表1三种不同种类化学修饰的taq酶活性结果
[0058][0059][0060]
从结果可以看出(k231r，k346r，k663r)突变体对taq dna聚合酶的活性无显著影响，但是k219e会显著降低酶比活。可见不恰当的突变会影响taq酶活性。
[0061]
实施例4
[0062]
化学修饰taq酶50℃下封闭性能测定
[0063]
实验仪器：slan全自动医用pcr分析系统-96p
[0064]
实验程序：50℃，30s，80cycle
[0065]
荧光通道：sybr
[0066]
实验步骤：见表2。
[0067]
表2根据下表配制单个反应体系
[0068][0069]
(2)配制完成的pcr8连管涡旋混匀15s，短暂离心后上机测定。
[0070]
图2为酸酐修饰taq dna聚合酶突变体在50℃下的封闭效率。由以上结果可以看出，50℃条件下扩增，酸酐化学修饰酶封闭效果较好，40min内无任何酶活释放。
[0071]
实施例5
[0072]
化学修饰taq酶98℃下封闭性能测定
[0073]
实验仪器与程序
[0074]
(1)实验仪器：slan全自动医用pcr分析系统-96p
[0075]
(2)实验程序：98℃(10s-20s-30s-60s)，50℃30s，80cycle
[0076]
(3)荧光通道：sybr
[0077]
第(2)步的释放时间分别为10s，20s，30s，60s。
[0078]
实验步骤
[0079]
表3根据下表配制单个反应体系
[0080][0081]
配制完成的pcr 8连管涡旋混匀15s，短暂离心后上机测定。选取荧光值随时间变化的曲线中成线性的一段，其斜率代表了相对活性，斜率越大活性越高，反之亦然。按照公式i计算释放率。
[0082]
释放率(％)＝化学修饰酶98℃下释放不同时间的活性/未修饰酶的活性
×
100％
[0083]
实验结果见表4。
[0084]
表4不同种类化学修饰taq酶98℃下封闭性能测定结果
[0085][0086][0087]
结果表明，98℃30s热激活，化学修饰的taq dna聚合酶突变体(k231r，k346r，
k663r)释放率高达96.6％，对照例化学修饰taq dna聚合酶突变体(k219e)的30s激活率只有12.4％，这个可能和其活性降低有关。此外野生型化学修饰taq dna聚合酶只能释放16.8％的活性，远不能满足要求。
[0088]
综上，化学修饰的taq dna聚合酶突变体具备高封闭效率及快速的热激活速度。
[0089]
实施例6
[0090]
验证化学修饰taq dna酶突变体在qpcr试剂中的性能
[0091]
实验仪器与程序
[0092]
(1)实验仪器：slan全自动医用pcr分析系统-96p
[0093]
(2)实验程序：98℃30s，(95℃5s，60℃15s)
×
45循环
[0094]
(3)荧光通道：vic
[0095]
对照试剂：全式金probe qpcr supermix(aq712)
[0096]
实验步骤：见表5。
[0097]
表5根据下表配制单个反应体系
[0098][0099]
其中，n-primer-f：gac cccaaaatcagc gaaat(seq id no:5)
[0100]
n-primer r：tct ggt tac tgc cag ttgaat ctg(seq id no:6)
[0101]
n-probe：vic-acc ccg cattac gtt tgg tggacc-bhq1(seq id no:7)。
[0102]
dna模板购自金斯瑞的含新冠n基因的质粒。
[0103]
(2)配制完成的pcr 8连管涡旋混匀15s，短暂离心后上机测定。
[0104]
实验结果见表6。
[0105]
表6两种不同酶的检测ct值
[0106]
试剂本发明全式金ct值31.1431.57
[0107]
扩增曲线见图3。由图3可知，全式金probe qpcr supermix(aq712)与本发明所述化学修饰taq酶进行qpcr检测结果具有一致性。
[0108]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。