识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套、设计方法及其应用

1.本发明涉及细胞学技术领域，更具体而言，涉及识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套、设计方法及其应用。


背景技术：

2.甘蓝(brassica oleracea)营养元素很丰富，是我国重要的十字花科蔬菜之一，也是“禹氏三角”的基础组成之一(c基因组)。在大多数真核生物中，着丝粒dna由高度重复的反转录转座子序列和卫星序列组成。寡核苷酸荧光原位杂交技术是一种以单链寡核苷酸为探针的新型荧光原位杂交技术，这些寡核苷酸探针是一种新型的染色体物理标记，可从已测序物种的基因组中开发从甘蓝的参考基因组中鉴定的着丝粒重复序列。开发着丝粒重复序列探针进行基因组荧光原位杂交可以有效识别芸薹属c基因组，可以实现对甘蓝c基因组材料和变异体的鉴定，对野生种与甘蓝基因组亲缘关系的鉴定，以及异源多倍体材料中芸薹属c亚基因组染色体的鉴定，以及各染色体着丝粒位置的确定。可用于甘蓝育种材料创制和遗传研究，具有重要意义。


技术实现要素：

3.为了解决上述技术问题，本发明提供识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套、设计方法及其应用，提供基于甘蓝重复序列开发的寡核苷酸探针套和一套简单易行、成本低廉且可靠的荧光原位杂交方法。
4.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
5.一种识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套，包括cy3荧光标记的op
c1
和op
c2
两个序列，具体序列为：
6.op
c1
:cy3-5'-ttttcctgtttgggaatatgacaacttcttcgtcattctt-3'；
7.op
c2
:cy3-5'-tgaaagtgggataacttcttcatgccaactcctatgagat-3'。
8.一种识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套的设计方法，包括以下步骤：
9.s1：获取甘蓝korso参考基因组中的重复单元大于500bp串联重复序列tr，并对获取结果去冗余，得到非冗余tr阵列集合，即nr-tr；
10.s2：对步骤s1获得的nr-tr统计聚类并得到甘蓝基因组的tr阵列数据；
11.s3：检测所述步骤s2获得的甘蓝基因组的tr阵列序列的同源拷贝在甘蓝 korso参考基因组中的分布情况，得到在甘蓝基因组中所有染色体富集的重复序列代表阵列；
12.s4：将所述步骤s3得到的重复序列代表阵列从头开始切割为长40bp的片段，步长为5bp的序列；
13.s5：将分割后序列分别使用blastn比对到甘蓝korso参考基因组，其参数为pident＝90，qcovhsp＝90，观察这些序列在甘蓝基因组各染色体上的富集情况，最终得到包含op
c1
和op
c2
两个序列的甘蓝基因组探针套。
14.一种识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套的应用方法,包括以下步骤：
15.a1、甘蓝雌蕊处理：采集新鲜未开放的花序，于卡诺溶液中固定脱色12h， 70％乙醇保存。取固定材料，将处于有丝分裂前期的雌蕊从花蕾中剥出，37℃酶解12h，ddh2o洗净后室温低渗4h；
16.a2、甘蓝有丝分裂相制片：将雌蕊置于干净载玻片上，加20μl 60％冰乙酸，37℃烘片机上涂片，卡诺固定液清洗玻片，烘干后滴加20μl 5％dapi染液在显微镜下观察，选取较好片子用流水冲掉盖玻片及染液，55℃烘箱烘片过夜；
17.a3、染色体片变性：在染色体片上滴加70％的去离子甲酰胺30μl，盖上盖玻片，于80℃烘片机上变性5min，立即转入-20℃条件下进行梯度脱水，每次3min，取出室温干燥；
18.a4、杂交染液配制：每张制片滴加所述识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套溶液各0.5μl、50％去离子甲酰胺15μl、20％硫酸葡聚糖6μl、10％2
×
ssc溶液3μl，ddh2o 5μl，共30μl，于99℃下变性10min，迅速转入冰水混合物中并放入-20℃冰箱内10min。所述甘蓝染色体探针套溶液的浓度为1μg/μl；
19.a5、杂交：每张制片加变性杂交液30μl，盖上盖玻片，置于80℃烘片机上变性3min，37℃杂交6h；
20.a6、染色：轻磕掉盖玻片，于2
×
ssc中洗涤3次，每次5min，最后ddh2o 流水冲洗一遍，黑暗条件下烘干，每张制片加抗荧光淬灭封片剂配制的5％dapi 染液20μl，加盖玻片，染色10min，镜检、拍照。
21.优选的，所述2
×
ssc缓冲液由0.3m的柠檬酸三钠c6h5na3o7·
2h2o和3m 的nacl组成。
22.本发明与现有技术相比，具有的有益效果是：
23.1、本发明通过生物信息学方法分析串联重复序列，设计了甘蓝染色体的寡核苷酸探针套，可有效快速地识别甘蓝(芥蓝，cc，2n＝18)的全部染色体，建立了涂染甘蓝染色体的技术，该技术能够批量涂染甘蓝染色体材料。
24.2、本发明基于甘蓝korso参考基因组中重复序列开发的寡核苷酸探针套和一套简单易行、成本低廉且可靠的荧光原位杂交方法。
附图说明
25.图1为甘蓝染色体的寡核苷酸探针套在korso参考基因组中的分布；
26.图2为用甘蓝染色体的寡核苷酸探针套对甘蓝(芥蓝，cc，2n＝18)染色体的染色结果。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.如图1-2所示，一种识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套的设计方法
29.利用tandem repeats finder(trf,v4.09)软件，搜索甘蓝korso参考基因组(https://figshare.com/authors/zhangjun_fei/9345701)中重复单元大于500bp的串联
重复序列(tandem repeats,tr)，使用tr-tookit软件对trf 输出结果去冗余，得到非冗余tr阵列(nr-tr)集合。对获得的nr-tr统计聚类得到甘蓝染色体的tr阵列统计数据。
30.甘蓝染色体寡核苷酸探针套的设计方法：使用本地blastn检测上述tr阵列序列的同源拷贝在甘蓝korso参考基因组中的分布情况，结果发现了一个重复单元长度为601bp的代表阵列，其重复单元序列的同源拷贝特异地均匀富集于甘蓝所有染色体的着丝粒区域。将所得重复序列代表阵列的全长序列从头开始切割为长40bp，步长为5bp的寡核苷酸片段。将寡核苷酸序列分别提交至本地blastn比对到甘蓝korso参考基因组(参数为pident＝90，qcovhsp＝ 90)，观察其是否在甘蓝所有染色体富集，若在甘蓝所有染色体富集则保留，在部分染色体不富集则丢弃。结果获得了包含两个序列的甘蓝染色体寡核苷酸探针套，该探针套在甘蓝所有染色体的着丝粒区域均有分布(图1)，进一步用 cy3荧光标记为op
c1
和op
c2
，获得识别甘蓝基因组的寡核苷酸探针套，如表1所示。
31.表1
[0032][0033]
由图1可知，寡核苷酸探针套覆盖了甘蓝所有染色体，呈现富集状态。
[0034]
实施例2、一种识别甘蓝染色体的寡核苷酸探针套的应用方法
[0035]
a1、甘蓝雌蕊处理：采集新鲜未开放的花序，于卡诺溶液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)中固定脱色12h，70％乙醇保存。取固定材料，将处于有丝分裂前期的雌蕊从花蕾剥出，37℃酶解12h，ddh2o洗净后室温低渗4h。
[0036]
a2、甘蓝有丝分裂相制片：将雌蕊置于干净载玻片上，加20μl 60％冰乙酸，37℃烘片机上涂片，卡诺固定液清洗玻片，烘干后滴加20μl 5％dapi染液(ddh2o配制)，在显微镜下观察，选取较好片子用流水冲掉盖玻片，55℃烘箱烘片过夜。
[0037]
a3、染色体片变性：在染色体片上滴加70％的去离子甲酰胺30μl，盖上盖玻片于80℃烘片机上变性5min，后立即转入-20℃条件下进行梯度脱水(75％， 85％，100％)，每级3min，取出室温干燥。
[0038]
a4、杂交染液配制：每张制片滴加上述甘蓝染色体探针套溶液各0.5μl、 50％去离子甲酰胺15μl、20％硫酸葡聚糖6μl、10％2
×
ssc溶液3μl，ddh2o 5μl，共30μl，于99℃下变性10min，迅速转入冰水混合物中并放入-20℃冰箱内10min。所述甘蓝染色体探针套溶液的浓度为1μg/μl。
[0039]
a5、杂交：每张制片加变性杂交液30μl，盖上盖玻片，置于80℃烘片机上变性3min，37℃杂交6h。
[0040]
a6、染色：磕掉盖玻片，于2
×
ssc中洗涤3次，每次5min，最后ddh2o 流水冲洗一遍，
黑暗条件下烘干，每张制片加5％dapi染液(抗荧光淬灭封片剂配制)20μl，加盖玻片，染色10min,镜检、拍照(图2)。
[0041]
通过甘蓝染色体的寡核苷酸探针套识别甘蓝(芥蓝，cc，2n＝18)染色体的染色结果，如图2所示，其中(a)(蓝色)为甘蓝(芥蓝，cc，2n＝18)染色体的dapi染色(染液中未含甘蓝染色体的寡核苷酸探针套)，可清晰观察到 18条蓝色信号染色体；(b)(红色)为甘蓝染色体的寡核苷酸探针套对甘蓝(芥蓝，cc，2n＝18)染色体着丝粒位置的染色结果，可清晰观察到红色信号标记的18条染色体着丝粒；(c)为甘蓝染色体的寡核苷酸探针套识别甘蓝(芥蓝， cc，2n＝18)染色体的染色合成图，可清晰观察到18条混合红色着丝粒信号的蓝色染色体，这表明本发明设计的甘蓝染色体的寡核苷酸探针套可高效准确识别甘蓝(芥蓝，cc，2n＝18)的全部染色体的着丝粒位置。
[0042]
上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化，各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。