一种探针底物及测定β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法

一种探针底物及测定
β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种探针底物及测定β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法。


背景技术：

2.β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-glu,ec3.1.1.31)广泛分布于生命系统中，其能催化β-葡萄糖醛酸苷水解，释放出相应的苷元。研究发现，β-glu的活性与人体的健康状态密切相关。在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、肾癌、白血病等癌症患者体内，以及尿路感染、艾滋病毒、糖尿病、神经病变和类风湿关节炎等常见疾病的患者体内，β-glu的活性都会出现异常。因此，机体β-glu活性水平的检测，可以帮助多种疾病的临床诊断。
3.值得指出的是，β-glu同时也是一些疾病防治的重要靶点。伊立替康(irinotecan,cpt-11)是肠癌的一线用药，其在体内转化为7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)发挥抗肿瘤作用。严重腹泻事伊立替康疗法的常见毒副作用，很多病患不得不因此停止用药。研究表明，肠道β-glu水解sn38葡萄糖醛酸结合物是引起腹泻作用的重要原因之一。肠道β-glu是伊立替康减毒剂的重要靶点，高效的β-glu抑制剂被证实能够显著减缓伊利替康疗法肠道副作用。
4.众所周知，细菌在环境中广泛存在，其数量的多少是卫生状况的标志。多数微生物都会分泌β-glu，如果食物、水及环境被细菌污染，那么该样品中β-glu的活性水平会增强。因此，快速的β-glu活性检测方法可以为环境中微生物的检测提供一些帮助。大肠埃希氏菌(escherichiacoli)是国际公认的卫生监测指示菌，是食品安全指标和水质卫生学指标。加拿大jean-baptisteburnet等人的实验结果证实，水体样本中的β-glu活性与大肠杆菌浓度呈现显著的相关性，且检测精度很高，误差小于5％。
5.综上，β-glu的活性检测对于人类疾病的诊断和治疗，以及食品和水等环境中卫生检测具有重要意义。当前对于β-glu的活性检测，通常采用对硝基苯酚葡萄糖醛酸苷(pnpg)这一经典底物，该化合物水解后的产物(对硝基苯酚)在碱性条件下呈现黄色，可以通过比色法测定β-glu的活性。但是，pnpg与β-glu的亲和力较低，米氏常数约为200μm。而且，该方法不够灵敏，pnp的定量限高达100μm。因此，为保证测量结果的准确性，通过pnp比色法测定β-glu活性时pnpg的用量较大，成本并不经济。
6.香豆素类化合物具有较好的荧光检测灵敏度，当前有人尝试使用4-甲基伞形酮葡萄糖醛酸结合物(4mug)为底物开发β-glu活性的荧光检测方法。但是，因为较强的内滤效应，荧光强度并不能代表β-glu的活性。为准确测定β-glu的活性，反应液首先要经过色谱分离，是实际应用中的一个不便之处。因此，基于4mug的荧光检测方法并没有获得广泛应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种探针底物及测定β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法，其以香豆素的3-苯并噻唑基衍生物为原料，借助生物转化途径获得了cbf-g，并以
cbf-g为底物开发了高效的β-glu活性的off-on荧光检测方法。
8.在本发明的一个方面，本发明提出了一种探针底物。根据本发明的实施例，所述探针底物为3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸(cbf-g)，所述3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸的结构式如下，
[0009][0010]
在本发明的另一个方面，本发明提出了一种探针底物的制备方法。根据本发明的实施例，利用3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素与脊椎动物代谢组织的微粒体代谢组织的微粒体或含有微粒体的细胞匀浆液反应制备探针底物，并将其纯化。
[0011]
另外，根据本发明上述实施例的一种探针底物的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0012]
在本发明的一些实施例中，向磷酸缓冲液中依次加入3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素甲醇贮存液、mgcl2溶液、脊椎动物代谢组织的微粒体代谢组织的微粒体或含有微粒体的细胞匀浆液、尿苷二磷酸葡糖醛酸溶液，37℃反应100分钟后，反应液直接上样spe柱，随后依次使用双蒸水、甲醇、酸化甲醇洗脱，收集酸化甲醇洗脱组分，旋蒸蒸干即得所述探针底物。其中，制备所用酶源可以使用脊椎动物代谢组织的微粒体或细胞裂解液，以及代谢组织的细胞。
[0013]
在本发明的一些实施例中，所述3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素的浓度范围为10-200μmol/l，脊椎动物代谢组织的微粒体代谢组织的微粒体或含有微粒体的细胞匀浆液的蛋白质浓度为0.1-2.0mg/ml。
[0014]
在本发明的一些实施例中，脊椎动物代谢组织的微粒体代谢组织的微粒体或含有微粒体的细胞匀浆液为大鼠肝微粒体。
[0015]
在本发明的另一个方面，本发明提出了一种快速测定β-葡萄糖醛酸苷酶活性(β-glu)的荧光检测方法。根据本发明的实施例，采用3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸作为探针底物，所述3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸的结构式如下，
[0016][0017]
本发明的方法可检测的β-glu来源于但不限于包括体外重组表达β-glu酶、人源细胞及人源组织的β-glu、以及食品和水等环境中的β-glu。
[0018]
另外，根据本发明上述实施例的一种快速测定β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0019]
在本发明的一些实施例中，所述3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸在β-葡萄糖醛酸苷酶的催化下糖苷键断裂，生成3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素，3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素具有良好的荧光特性。通过检测单位时间内的荧光强度变化，获得探针底物减
少量或葡萄糖醛酸苷链水解反应产物生成量，实现对于β-glu酶活性的检测。
[0020]
在本发明的一些实施例中，所述β-葡萄糖醛酸苷酶活性测定时所用的反应时间为5-60min，探针底物浓度为1-200μmol/l。
[0021]
在本发明的一些实施例中，使用荧光检测器检测荧光强度时，定量荧光检测参数为激发波长451nm，发射波长487nm。因为cbf的最大激发波长为451nm，最大发射波长为487nm。而cbf-g在激发波长451nm时无荧光。
[0022]
在本发明的一些实施例中，所用酶促反应缓冲液ph为6.0-8.0，反应温度为10-60℃。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0024]
(1)高亲和性：本发明中所用荧光探针底物cbf-g与β-glu的反应符合米氏动力学，其单位时间荧光强度变化可用于定量测定不同来源的β-glu酶的活性，cbf-g与β-glu的亲和性好于经典底物pnpg，经实验测定，其米氏常数为40μmol/l。
[0025]
(2)高转化率：cbf-g通过β-glu转化为β-glu的效率高，2μmol/l的cbf-g在含有0.1u的β-glu反应体系中孵育20分钟，转化率可达75％以上，高转化率赋予本发明具有较高的灵敏性。
[0026]
(3)易于制备：香豆素类荧光化合物作为分子探针底物应用时间久，制备工艺成熟，其母核的化学制备方法简单；cbf-g生化制备的方法高效、简易，所用酶的来源多样丰富，反应液过spe柱(c18aex)一次纯度就可以达到95％以上。
[0027]
(4)检测便携：反应液无需经过分离纯化，可直接进行检测β-glu的活性，在临床应用中，无需另行购买昂贵的分离设备。
[0028]
(5)本发明克服了香豆素类化合物的内滤效应，以香豆素的3-苯并噻唑基衍生物为原料，借助生物转化途径获得了cbf-g，并以cbf-g为底物开发了高效的β-glu活性的荧光检测方法。
附图说明
[0029]
图1为本发明实施例1中3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)和3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素(cbf)的uplc谱图；
[0030]
图2为本发明实施例1中3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)的质谱图；
[0031]
图3为本发明实施例2中3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)与3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素(cbf)的荧光强度对比；
[0032]
图4为本发明实施例2中3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素(cbf)的标准曲线；
[0033]
图5为本发明实施例2中β-glu水解3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)荧光光谱随时间变化图；
[0034]
图6为本发明实施例3中苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)与β-glu的酶解动力学曲线图；
[0035]
图7为本发明实施例4中糖二酸－1，4－内酯的抑制β-glu的双倒数动力学图；
[0036]
图8为本发明实施例5中和厚朴酚对β-glu的抑制曲线图；
[0037]
图9为本发明实施例6中苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)监
测大肠杆菌生长图。
具体实施方式
[0038]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]
实施例1
[0040]
3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)的制备方法，利用3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素(cbf)与大鼠肝微粒体反应制备cbf-g，并将其纯化，具体步骤如下：
[0041]
向105ml100mmol/lol/l磷酸缓冲液(ph7.0)中依次加入1.5mlcbf甲醇贮存液(10mmol/l)，15mlmgcl2溶液(40mmol/l)，10mlbrij58活化后的大鼠肝微粒体(5mg/ml)，15ml尿苷二磷酸葡糖醛酸溶液(10mmol/l)；37℃反应100分钟后，反应液直接上样spe柱(型号c18aex)；随后依次使用30ml双蒸水淋洗，30ml甲醇淋洗，10ml酸化甲醇(5％甲酸)洗脱，收集酸化甲醇洗脱组分，旋蒸蒸干得2.3mg固体即为cbf-g。
[0042]
cbf-g的hplc谱图如图1所示，质谱数据如图2所示，核磁氢谱数据如下：1hnmr(400mhz,dmso)δ9.23(s,1h),8.19(d,j＝8.1hz,1h),8.10
–
8.02(m,2h),7.61
–
7.55(m,1h),7.50
–
7.46(m,1h),7.27(d,j＝2.2hz,1h),7.15(dd,j＝8.7,2.3hz,1h),5.32(d,j＝6.8hz,1h),4.05(m,2h),3.35(m,1h),3.33(m,1h)。
[0043]
实施例2
[0044]
3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)荧光特性检测方法如下：
[0045]
当荧光检测器的激发波长设定为451nm、发射波长设定为487nm时，50μm的cbf-g溶液无荧光，其和cbf的荧光强度对比如图3所示。配置不同浓度的cbf溶液，并在激发波长451nm、发射波长487nm时进行荧光检测，获得cbf的标准曲线如图4所示，cbf的定量限低至1μm。向388μl磷酸缓冲液(ph7.0,100mmol/l)依次加入β-glu4μl(1u/μl)，cbf-g8μl(5mmol/l)，在37℃下进行孵育。每隔2分钟取10μl加入90μl甲醇进行终止反应，并使用荧光分光光度计在激发波长451nm、发射波长487nm时进行荧光检测，β-glu水解cbf-g荧光光谱随时间变化如图5所示。通过图5可以看出，在20分钟反应时间内，反应液的荧光在不断增强，即反应产物cbf的含量在不断增加，且最高峰所在波长稳定保持在487nm附近，证明该检测方法具有良好的稳定性。
[0046]
实施例3
[0047]
β-glu水解3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)动力学参数的确定：
[0048]
向98μltris-hcl缓冲液(50mmol/l，ph7.0)中依次加入1μlβ-glu(1u/μl)，1μlcbf-g的甲醇贮存液(1-80mmol/l)；37℃反应20分钟后，加入100μl甲醇终止反应，随后直接进荧光分光光度计检测分析，激发波长设定为451nm，发射波长为487nm。利用米氏方程对动力学数据进行非线性拟合，km和vmax的值分别为37μm和7.5nmol/min/mg，动力学曲线如图6所示。
[0049]
实施例4
[0050]
糖二酸－1，4－内酯的抑制β-glu的动力学测定：
[0051]
糖二酸－1，4－内酯是β-glu的参考抑制剂，本发明利用3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)开展了其抑制β-glu的动力学测定。具体步骤如下：向96孔板中依次加入1μl糖二酸－1，4－内酯的二甲基亚砜贮存液(0-20mmol/l)，1ulβ-glu(1u/μl)，1μlcbf-g的甲醇贮存液(1-10mmol/l)，97μl磷酸缓冲液(20mmol/l，ph7.0)；随后转移至荧光酶标仪中，37℃保温振荡，采集每孔的动力学数据，采集时间5min。利用竞争性抑制方程方程对动力学数据进行非线性拟合，糖二酸－1，4－内酯抑制β-glu的ki值为38μmol/l，与公开报道的数值接近，双倒数动力学作图如图7所示。
[0052]
实施例5
[0053]
和厚朴酚(honokiol)抑制β-glu的测定：
[0054]
本发明提供了一种利用3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)筛选β-glu的抑制剂的实例，具体步骤如下：向196μltris-hcl缓冲液(50mmol/lol/l，ph7.0)中依次加入2μlβ-glu(1u/μl)，1μl的和厚朴酚甲醇贮存液(0-20mmol/l)，1μlcbf-g的甲醇贮存液(4mmol/l)；37℃反应10分钟后，加入100μl甲醇终止反应，随后直接进荧光分光光度计检测分析，激发波长设定为451nm，发射波长为487nm。和厚朴酚抑制β-glu的具体情况如图8所示，抑制ic50值为45μmol/l。
[0055]
实施例6
[0056]
大肠杆菌生长情况的检测：
[0057]
大肠杆菌能够分泌β-glu，β-glu的活性检测可能会对大肠杆菌的数量检测提供一些帮助。本发明提供了一种利用3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素葡萄糖醛酸结合物(cbf-g)对大肠杆菌生长情况进行检测的方法。步骤如下：在超净工作台中，将培养基中的大肠杆菌单菌落取一环菌苔接种到大肠杆菌选择性培养基中进行培养，作为种子培养液。吸取种子培养液进行接种培养。接种后每隔一小时取100μl检测其吸光度(600nm)，用活菌计数法对其进行细菌计数，并超声后离心取上清液作为酶源，以cbf-g为底物反应20min检测其荧光强度。结果如图9所示，随着大肠杆菌的生长，以其上清液作为酶源，cbf-g为底物进行反应，所得反应液的荧光强度与大肠杆菌的数量呈现强相关性，且与大肠杆菌的生长规律相符。以对数生长期末期为例，在8小时左右大肠杆菌生长进入对数生长期末期时，大肠杆菌的数量增长和反应液的荧光强度增加均呈现停滞状态，证明该探针可以用于大肠杆菌生长和含量的检测。
[0058]
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。