粪便微生物标志物在无创识别/预警围产期脂肪肝奶牛中的应用

1.本发明涉及微生物及临床医学技术领域，具体涉及粪便微生物标志物在无创识别/预警围产期脂肪肝奶牛中的应用。


背景技术：

2.脂肪肝是围产期奶牛高发的一种代谢紊乱疾病，尤其是高产奶牛。奶牛产前21天至产后21的这段时间为围产期(drackley,1999；grummer,1995)。围产期奶牛由于采食量减少导致能量摄入减少，运动量也大幅降低，而生产和泌乳需要大量的能量支撑，这会导致脂肪动员的改变，导致机体消耗自身的脂肪，血液中游离脂肪酸(nefa)的浓度升高，肝脏摄取游离脂肪酸的速率加快，这些nefa进入肝脏后被酯化形成甘油三酯(tg)，tg可以通过水解的方式或者以极低密度脂蛋白(vldl)的形式分泌到肝脏外；但以vldl形式分泌入血的效率很低。当tg的合成速度高于运输速度的时候，就会导致tg在肝脏的积累，使脂肪在肝中积存超过肝脏的正常含量时，称为脂肪肝。奶牛脂肪肝病作为奶牛围产期常发的代谢紊乱性疾病之一，严重的还会引发酮病、产后瘫痪等，严重影响奶牛的产奶性能、繁殖性能、使用寿命。该病的发生率在奶牛围产期尤为常发，发生比例相对较高(5-10％的奶牛患重度脂肪肝，30-40％患中度或轻度脂肪肝)，对奶业造成巨大经济损失。因此，准确诊断围产期脂肪肝奶牛既有利于奶牛健康，又可以减少牧场经济损失。
3.目前，脂肪肝的检测方法主要有肝脏活检、血清生理生化、蛋白质组学和代谢组学、数字化图像技术等。其中，肝脏活检——奶牛活体取肝组织进行脂肪含量测定是肝脏代谢研究的重要检查方法；目前奶牛脂肪肝诊断的金标准是通过检测肝脏甘油三脂所占肝脏湿重的比例来确定。奶牛肝脏中tg＜1％为正常；1％＜tg＜5％为轻度脂肪肝；5％＜tg＜10％为中度脂肪肝；tg＞10％为重度脂肪肝。但该方法是一种侵入性方法，对奶牛的健康产生雪上加霜的影响，不利于动物福利；况且，预后不良还会导致并发性感染疾病。临床上也可通过血清生理生化诊断奶牛脂肪肝，目前比较认可的诊断方法为reid提出的y值法(3项血清生化指标进行计算)，但是经调研依然存在较大误差，不适用于规模化牧场。
4.前期研究中，发明人发现用粪便中的小分子代谢物作为标志物可以对脂肪肝奶牛进行无创诊断。但由于小分子代谢物的测定过程相对复杂，而且小分子代谢物的丰度和稳定性也相对偏低。因此，寻求新的用于无创识别或预警脂肪肝奶牛的粪便标志物仍是目前防治围产期奶牛脂肪肝病急需突破的瓶颈。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一组微生物标志物及其在无创识别/预警围产期脂肪肝奶牛中的应用。经诊断能力验证，本发明的微生物标记物的auc值均符合诊断学意义，具有较高的临床诊断应用价值；应用本发明的微生物标记物能够对围产期脂肪肝奶牛进行诊断、鉴别和监测，不仅成本低、操作简单，而且是一种无创且非侵入性的检测
手段，符合动物福利与健康养殖的理念，可广泛应用于奶牛的规模化养殖。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供如下1)-3)至少一项所述种的微生物作为微生物标记物在制备诊断围产期奶牛脂肪肝病的试剂或试剂盒中的用途：
8.1)假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)；
9.2)嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)；
10.3)毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)。
11.上述三种微生物标记物分离自奶牛粪便，均能准确的识别奶牛脂肪肝病，每一种微生物标记物的auc值均符合诊断学意义，具有较高的临床诊断应用价值；而且，多个联合应用时，auc比单个更接近于1，诊断效果更好；上述三个微生物标记物联合应用时，对围产期奶牛脂肪肝病的识别效果最好。
12.由此，优选的，所述微生物标记物为假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)、嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)三种的组合；
13.或者，所述微生物标记物为假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)两种的组合。
14.本发明的第二方面，提供检测奶牛代谢物中微生物标记物的试剂在制备用于非侵入性识别围产期奶牛脂肪肝病的产品中的用途；
15.所述微生物标记物为假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)、嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)中的一种或多种的组合。
16.优选的，所述微生物标记物为假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)、嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)三种的组合；
17.或者，所述微生物标记物为假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)两种的组合。
18.进一步的，所述试剂为检测奶牛代谢物中微生物标记物相对丰度的试剂。
19.优选的，所述试剂为宏基因组测序、16s测序或qpcr测序用试剂。
20.优选的，所述奶牛代谢物为粪便。
21.上述用途中，非侵入性识别围产期奶牛脂肪肝病的方法包括：
22.(1)收集来自待测围产期奶牛的粪便；
23.(2)检测奶牛粪便中的微生物标记物的相对丰度；
24.(3)基于检测到的微生物标记物的相对丰度识别待测围产期奶牛是否患有脂肪肝病。
25.本发明的有益效果：
26.(1)本发明基于宏蛋白组学技术，首次从种的水平提出了作为非侵入性识别和鉴定脂肪肝病奶牛的微生物标志物。经诊断能力验证，本发明的每一种微生物标记物的auc均较高，具有更高的临床诊断应用价值。
27.(2)利用本发明的微生物标志物对脂肪肝奶牛进行识别、鉴定和监测，不仅成本
低、操作简单，而且是一种无创且非侵入性的检测手段，符合动物福利与健康养殖的理念，未来可广泛应用于奶牛的规模化养殖，促进奶业健康、高效发展。
28.(3)本发明所使用的是粪便微生物标记物，粪便是奶牛的末端代谢物，不仅可以反映机体的代谢状况；而且可以“无创”诊断/预警奶牛的代谢状况。避免了肝活检给奶牛带来的二次伤害；也避免了血清采集时绑定牛所带来的繁琐步骤与不便。另外，与发明人前期发现的粪便小分子代谢物相比，粪便微生物标记物其丰度比小分子代谢物的丰度更高、更稳定，有利于保证标记物的特异性与灵敏度；而且粪便微生物的测定过程比小分子代谢物更加简便。
附图说明
29.图1：粪便微生物bifidobacterium pseudolongum在mflvsnorm的随机森林分析。
30.图2：粪便微生物bifidobacterium pseudolongum在sflvsnorm的随机森林分析。
31.图3：在mflvsnorm组中利用不同种粪便微生物及其组合在roc中联合分析；其中，b代表假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)，l代表毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)，p代表嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)；b l p代表假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)、毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)和嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)联合使用；b l代表假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)联合使用；b p代表假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)和嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)联合使用；p l代表嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)联合使用。
32.图4：在sflvsnorm组中利用不同种粪便微生物及其组合在roc中联合分析；其中，b代表假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)，l代表毛螺科菌(lachnospirace ae bacterium)，p代表嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)；b l p代表假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)、毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)和嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)联合使用；b l代表假长双歧杆菌(b ifidobacterium pseudolongum)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)联合使用；b p代表假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)和嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multi saccharivorax)联合使用；p l代表嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)联合使用。
具体实施方式
33.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
34.如前所述，奶牛脂肪肝病作为奶牛围产期常发的代谢紊乱性疾病之一，严重的还会引发酮病、产后瘫痪等，严重影响奶牛的产奶性能、繁殖性能、使用寿命。对奶业造成巨大经济损失。如果能提前识别或有相应的预警措施，就可以有效避免这种损失。目前唯一可靠的诊断方法就是肝脏活检——奶牛活体取肝组织进行脂肪含量测定。但该方法是一种侵入
性方法，对奶牛的健康产生雪上加霜的影响，不利于动物福利；况且，预后不良还会导致并发性感染疾病；因此，采用无创方法进行脂肪肝奶牛的早期诊断具有重要的意义与价值。
35.蛋白组覆盖范围很广泛，包括食品、海洋、土壤以及肠道等。随着近年来在样本处理以及质谱分析上的提升和发展，利用宏蛋白组与生物信息学的结合越来越成熟。宏蛋白组学在nafld引起的肠道变化在分析上也有了很高的变化。尤其是，它可以揭示肠道微生物群的分类、功能和代谢途径的变化。
36.(1)本发明采用了4d蛋白质组学技术对粪便进行宏蛋白组学分析。宏蛋白组学的优势在于对粪便中的微生物在分类和功能上进行了全面的分析。
37.具体步骤如下：
38.①
蛋白提取。样品从-80℃取出，称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入粉末4倍体积酚抽提缓冲液(含10mm二硫苏糖醇，1％蛋白酶抑制剂)，超声裂解。加入等体积的tris平衡酚，4℃，5500g离心10min，取上清并加入5倍体积的0.1m乙酸铵/甲醇沉淀过夜，蛋白沉淀分别用甲醇和丙酮进行洗涤。最后沉淀用8m尿素复溶，利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。
39.②
胰酶酶解。各样品蛋白取等量进行酶解，加入适量标准蛋白，用裂解液将体积调整至一致，缓慢加入终浓度20％tca，涡旋混匀，4℃沉淀2h。4500g，离心5min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2-3次。晾干沉淀后加入终浓度200mm的teab，超声打散沉淀，以1:50的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解过夜。加入二硫苏糖醇(dtt)使其终浓度为5mm，56℃还原30min。之后加入碘乙酰胺(iaa)使其终浓度为11mm。
40.③
液相色谱-质谱联用分析。肽段用液相色谱流动相a相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用easy-nlc 1000超高效液相系统进行分离。流动相a为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相b为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-40min，5％～25％b；40-52min，25％～35％b；52-56min，35％～80％b；56-60min，80％b，流速维持在500nl/min。
41.肽段经由超高效液相系统分离后被注入nsi离子源中进行电离然后进q exactivetm plus质谱进行分析。离子源电压设置为2.1kv，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描(dda)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前10肽段母离子依次进入hcd碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(agc)设置为5e4，信号阈值设置为20000ions/s，最大注入时间设置为100ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒以避免母离子的重复扫描。
42.④
数据库搜索与比对。二级质谱数据使用maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：数据库添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(fdr)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为trypsin/p；漏切位点数设为2；first search和main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白n端的乙酰化，脱酰胺化(nq)。蛋白鉴定、psm鉴定的fdr都设置
为1％。
43.(2)宏蛋白组数据首先经过数据重复性检测和质谱质控检测，剔去不合格或不合理数据；经过皮尔森相关系数和opls-da方法验证了筛选模型的可靠性，然后筛选出在正常组和患病组间的差异表达蛋白。物种注释利用软件unipept(v.2.0.0 https://unipept.ugent.be/datasets)和质谱数据解析maxquant(v.1.5.2.8 http://www.maxquant.org/)。
44.(3)本发明中的生物标记物经过了严谨的筛选过程。
45.(4)利用宏蛋白组学，我们在31个奶牛个体进行了分析。与其他粪便微生物指标识别脂肪肝个体的方法相比，在种水平筛选的微生物具有良好的验证能力。
46.本发明最终发现了3个具有诊断价值的种水平微生物标记物：假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)、嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)。
47.本发明的3个微生物标记物在鉴别normvsmfl具有较高鉴别能力。另外发现粪便中的假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)在normvsmfl和normvssfl两组中都具有较高的鉴别能力，bifidobacterium pseudolongum与肠粘膜的厚度可能呈正相关的关系。由于粘液层在肠道保护中起着至关重要的作用，对于揭示研究粘液降解细菌对于理解肠道疾病等疾病的潜在病因和实施新的治疗策略的重要性。
48.本发明所发现的3个具有诊断价值的微生物标记物来自于粪中，利用奶牛的正常代谢产生的微生物进行识别，省时便捷，节约诊断成本；进行诊断时不需要传统的血样采集或手术穿刺，为无痛识别标记物，对奶牛的健康安全和动物福利具有重要意义；利用本发明的标记物对奶牛脂肪肝病进行识别诊断，不会影响奶牛生产，不会产生由于血样采集、手术穿刺等造成的奶牛产量下降、健康应激甚至并发感染等负作用。节约诊断和治疗成本，促进高产增效。
49.本发明所采用的生物标记物来自于粪，是奶牛肠道中的微生物，可以很好地指证奶牛的代谢情况，对于奶牛的脂肪肝可以精确地通过粪便中微生物相对丰度含量的变化指示奶牛的代谢状况。
50.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
51.本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
52.实施例1：候选标记物的筛选和发现——肝活检诊断群体的代谢物差异标记物的筛选与发现
53.首先选取31头奶牛作为discovery set，通过肝组织活检，将其分为正常组(norm，n＝10)和中度脂肪肝组(mfl，n＝9)重度脂肪肝组(sfl，n＝12)。
54.采集奶牛的粪便，通过质谱分析技术检测蛋白在每个样本中对应信号丰度，通过非标定量计算方法得到蛋白在每个样本中的lfq intensity，根据不同样本之间蛋白lfq intensity得到每个样本的相对定量值。
55.第一步计算比较组中两个样本间蛋白的差异表达量，首先计算出每个样本在多次重复中定量值的平均值，然后再计算两个样本之间平均值的比值，该比值作为比较组最终
的差异表达量。
56.第二步计算该蛋白在两个样本中的差异表达显著性p-value，首先将各个样本的相对定量值取log2(以使得数据符合正态分布)，然后用双样本双尾t检验方法计算p-value。当p-value《0.05时，以差异表达量变化超过1.5作为显著上调的变化阈值，小于1/1.5作为显著下调的变化阈值。
57.本项目所有差异表达的蛋白汇总数据参见表1。
58.表1：差异表达蛋白统计信息
[0059][0060]
实施例2：在正常组(norm)和患病组中变化倍数最大的蛋白几乎所有都来自微生物bifidobacterium pseudolongum。
[0061]
在mflvsnorm中宏蛋白组筛选到218个差异表达蛋白蛋白，筛选上调变化倍数最大的十个蛋白，其中变化倍数最大的蛋白a0a0a7icf4达到70.48，且这些蛋白全部来自bifidobacterium pseudolongum(如表2)所示。同样我们在sflvsnorm组中观察到变化倍数前十的蛋白中变化倍数最大的蛋白f3bbl3来自lachnospiraceae bacterium变化倍数达到48.37。另一个蛋白来自treponema paraluiscuniculi，剩余的蛋白都来自bifidobacterium pseudolongum(如表3)所示。
[0062]
表2：在mflvsnorm组中变化倍数排前10的蛋白
[0063][0064]
表3：在sflvsnorm组中变化倍数排前10的蛋白
[0073][0074]1注：奶牛粪便微生物种水平丰度前20的微生物。
[0075]
我们利用spss中的roc进行分析，在种水平上的微生物在组别mflvs norm和sflvsnorm中发现微生物bifidobacterium pseudolongum，在两个组别中的曲线下面积(auc)都大于0.7，且在mflvsnorm中高达0.867(表4)，具有较高的验证能力。在sflvsnorm中曲线下面积也达到了0.725(表5)。
[0076]
实施例4：微生物在norm-mfl-sfl三组中的丰度变化
[0077]
在roc曲线中微生物假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)、嗜糖普雷沃氏菌(prevotella multisaccharivorax)和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)丰度变化如(表6)所示，毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)丰度在norm为3.55e 10，在mfl中丰度升高接近一倍。同样假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)在mfl和sfl两种状态下丰度提高接近10倍，尤其在mfl中提高较多。
[0078]
其中毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)丰度在norm中占比55.78％，在mfl丰度占比66.00％。假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)在norm中丰度占比0.73％，在mfl和sfl升高到6％(表7)。
[0079]
表6：在种水平上丰度前20的微生物(平均值
±
标准差)
[0080][0081][0082]
表7：不同代谢状态奶牛粪便微生物种水平丰度相对比例的变化(平均值
±
标准差)1[0083][0084]1注：正常状态(norm)下奶牛粪便微生物丰度前20的微生物占比100％的前提下，这些微生物的比例。
[0085]
实施例5：微生物与微生物的联合分析提高验证能力
[0086]
为了提高微生物在组间的验证能力，我们将3种微生物进行联合分析。利用spss中的二元logistic回归，将三个微生物变量进行不同排列组合，拟合出组合后的预测值，再进行roc分析。
multisaccharivorax)都同时增加时，就要预警围产期奶牛可能存在罹患脂肪肝的风险，应及时调整饲养方案或采取调整措施，避免损失。该生物标记物为未来无创检测、诊断奶牛脂肪肝病提供了新技术和新方法。
[0094]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。