一种同时检测CVB和TAV的RT-RPA双重荧光检测方法

efficiencytranscriptionkit体外反转录成rna，根据测定的浓度换算成拷贝数，采用rna稀释液10倍梯度稀释成rna标准品，浓度分别为：1.0×108拷贝/ml、1.0×107拷贝/ml、1.0×106拷贝/ml、1.0×105拷贝/ml、1.0×104拷贝/ml、1.0×103拷贝/ml，-80℃储存备用；10.引物组合的筛选：11.采用rt-rpa扩增试剂结合上述设计的cvb和tavria扩增引物进行引物探针的筛选，50μl反应体系中10×riareactionbuffer5.0μl，riaenzymemix10.0μl，riareactioncoremix13.5μl，40u/μlrnainhibitor0.5μl，200u/μlmultiscriptireversetranscriptase1.0μl，25mmdntps3.6μl，加入depc水补至46.5μl，混匀后置于冰上，分别以中浓度1.0×ꢀ106拷贝/ml和低浓度1.0×104拷贝/ml的cvb和tavrna参考品为模板，模板量2μl，再加入浓度为280mmol/l的mgoac溶液2.5μl，对上述设计的4组cvb和tav引物探针组合分别进行筛选。12.优选的，所述引物组合的筛选步骤中引物浓度为：200nmol/l、400nmol/l或600nmol/l。13.优选的，所述引物组合的筛选步骤中探针浓度为：100nmol/l、120nmol/l或150nmol/l。14.优选的，所述引物组合的筛选步骤中反应温度为：37℃、39℃或42℃。15.优选的，所述引物组合的筛选步骤中反应时间为：5min、10min或15min。16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：17.构建的cvb和tav双重实时荧光rt-rpa检测体系除了具有高灵敏度外，其对高浓度(1.0×107拷贝/ml)和低浓度(1.0×104拷贝/ml)的核酸检测重现性好；对不同菊花和植物病毒检测特异性强；整个检测时间仅需15min，为菊花病毒的检测和监测提供技术支持。附图说明18.图1为本发明cvb和tav酶切后线性dna电泳结果图；19.图2为本发明不同cvb引物组合筛选结果图；20.图3为本发明引物浓度对rt-rpa扩增的影响图；21.图4为本发明cvb浓度200nmol/l对rt-rpa扩增的影响图；22.图5为本发明cvb浓度400nmol/l对rt-rpa扩增的影响图；23.图6为本发明cvb浓度600nmol/l对rt-rpa扩增的影响图；24.图7为本发明tva浓度200nmol/l对rt-rpa扩增的影响图；25.图8为本发明tva浓度400nmol/l对rt-rpa扩增的影响图；26.图9为本发明tva浓度600nmol/l对rt-rpa扩增的影响图；27.图10为本发明cvb探针不同浓度对rt-rpa检测的影响图；28.图11为本发明tva探针不同浓度对rt-rpa检测的影响图；29.图12为本发明不同温度对cvbrt-rpa检测的影响图；30.图13为本发明不同温度对tavrt-rpa检测的影响图；31.图14为本发明不同反应时间对rt-rpa检测的影响图；32.图15为本发明特异性检测结果图。具体实施方式33.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。34.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。35.实施例：36.请参阅图1-15，本发明提供一种技术方案：37.1材料38.1.1实验标本39.菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯y病毒、马铃薯x病毒、矮化类病毒和褪绿斑驳类病毒核酸均保存于南京农业大学中国菊花种质资源中心，100株症状菊花叶片采自南京农业大学中国菊花种质资源锁石村种植基地。40.1.2主要试剂41.质粒小量提取试剂盒(货号：dp103)和病毒基因组dna/rna提取试剂盒(货号：dp315)购自天根生化科技(北京)有限公司；rt-rpa扩增试剂(货号：mrk001)、hotstarttaqonesteprt-pcrmix(货号：mdr-m151)购自菲鹏生物股份有限公司；ecori酶(货号：neb#r3101)和saci酶(货号：neb#r3156)购自newenglandbiolabs；megascripttmt7transcriptionkit(货号：am1334)购自thermofisherscientific。42.1.3主要仪器43.abi7500购自lifescience，genchek荧光检测仪购自杭州众测生物科技有限公司，tom-k1-10tf超纯水仪购自南京欧铠环境科技有限公司，ds-11fx 超微量紫外可见分光光度计购自美国denovix，legendmicro17离心机和appliedbiosystemsveritipcr仪购自thermoscientific，bsc-1100iib2-x生物安全柜购自济南鑫贝西生物科技有限公司，swcj-1d超净工作台购自苏净安泰。44.2方法45.2.1引物与探针的设计46.根据生物信息学分析结果结合文献报道，从ncbi数据库中分别下载cvb和tav病毒基因组序列，用mega6.06生物学软件进行比对，选择cvb和tav外壳蛋白基因的保守区域作为靶基因设计引物，利用primerpremier5.0软件参考报道的twist引物和twistexo-探针设计原则分别设计4组ria扩增引物和探针，对设计的4组引物在ncbi中进行blast，比对结果均为相应的病毒。引物和探针序列及标记见表1。47.表1引物及探针详细信息48.table1primerandprobedetails[0049][0050][0051]注：f表示fam-dt，h表示thf，q表示bhq1-dt，c3表示3’端c3间臂修饰[0052]note:fdenotesfam-dt,hdenotesthf,qdenotesbhq1-dt,c3denotesthemodificationofthe3'-terminalc3。[0053]2.2定量标准品的制备与定值研究[0054]选择cvb和tav外壳蛋白基因的保守区体外合成含有pgem-t载体的2种病毒目的基因片段的质粒，cvb和tav的目的基因片段大小分别为304bp和196bp。均采用ecori酶切下含有t7启动子的目的片段，再经saci酶切线性化，酶切产物纯化回收后用t7highefficiencytranscriptionkit体外反转录成rna，根据测定的浓度换算成拷贝数，采用rna稀释液10倍梯度稀释成rna标准品(浓度分别为：1.0×108拷贝/ml、1.0×107拷贝/ml、1.0×106拷贝/ml、1.0×105拷贝/ml、1.0×104拷贝/ml、1.0×103拷贝/ml)，-80℃储存备用。[0055]2.3引物组合的筛选[0056]采用rt-rpa扩增试剂结合上述设计的cvb和tavria扩增引物进行引物探针的筛选，50μl反应体系中10×riareactionbuffer5.0μl，riaenzymemix10.0μl，riareactioncoremix13.5μl，40u/μlrnainhibitor0.5μl，200u/μlmultiscriptireversetranscriptase1.0μl，25mmdntps3.6μl，上、下游引物浓度为400nmol/l，探针浓度100nmol/l，加入depc水补至46.5μl，混匀后置于冰上，分别以中浓度1.0×106拷贝/ml和低浓度1.0×104拷贝/ml的cvb和tavrna参考品为模板，模板量2μl，再加入浓度为280mmol/l的mgoac溶液2.5μl。反应温度设定为37℃，反应时间15min，对上述设计的4组cvb和tav引物探针组合分别进行筛选。[0057]2.4扩增体系的优化[0058]2.4.1引物浓度优化[0059]固定rt-rpa扩增体系中cvb和tav探针浓度100nmol/l，在3种不同引物浓度水平(终浓度分别为：200nmol/l、400nmol/l、600nmol/l)，用10倍梯度稀释的rna标准品(1.0×106拷贝/ml～1.0×103拷贝/ml)及阴性对照作为待测标本，经rt-rpa荧光检测，测试不同引物浓度对扩增结果的影响。[0060]2.4.2探针浓度优化[0061]根据优化的cvb和tav引物浓度，设置3种不同探针浓度水平(终浓度分别为：100nmol/l、120nmol/l、150nmol/l)，分别用1.0×104拷贝/ml和[0062]1.0×103拷贝/ml的两种低浓度的cvb和tavrna参考品和阴性对照作为待测标本，经rt-rpa荧光检测，测试不同探针浓度对扩增结果的影响。[0063]2.5扩增条件摸索[0064]2.5.1反应温度试验[0065]根据优化的rt-rpa扩增体系，设置3种不同的rt-rpa反应温度梯度，分别为37℃、39℃和42℃，用低浓度的1.0×104拷贝/ml的cvb和tav参考品及阴性对照作为待测标本，经rt-rpa荧光检测，测试不同反应温度对低浓度的rna参考品检测结果的影响。[0066]2.5.2反应时间试验[0067]根据优化的rt-rpa扩增体系，设置3种不同的rt-rpa反应时间，分别为5min、10min和15min，用低浓度的1.0×104拷贝/ml的cvb和tav参考品及阴性对照作为待测标本，经rt-rpa荧光检测，测试低浓度的rna参考品检测阳性结果所需的时间。[0068]2.6性能评价[0069]2.6.1敏感性试验[0070]以2种病毒的低浓度rna标准品(1.0×104拷贝/ml、1.0×103拷贝/ml和5.0×102拷贝/ml)及阴性对照为待测标本，分别以本研究构建的rt-rpa体系和本实验室过往构建的rt-qpcr体系对上述3种rna标准品进行20次重复检测，以95％的检出率作为cvb和tav的检测灵敏度，比较rt-rpa和rt-qpcr的检测灵敏度区别。[0071]2.6.2特异性试验[0072]采用本研究构建的cvb和tav双重rt-rpa检测体系对南京农业大学中国菊花种质资源保存中心留存的菊花b病毒、番茄不孕病毒、菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯y病毒、马铃薯x病毒和褪绿斑驳类病毒病毒核酸进行检测。[0073]2.6.3重复性试验[0074]分别以高浓度1.0×107拷贝/ml和低浓度1.0×104拷贝/ml的cvb和tavrna参考品及阴性对照为待测标本进行重复性检测，每个浓度10次重复。统计不同浓度水平下出峰时间t(荧光信号值≥1000的时间)的变异系数cv％。[0075]2.7标本检测试验[0076]用本研究构建的2种菊花病毒双重荧光rt-rpa检测体系对实验室过往检测的100例标本进行检测，并将rt-rpa检测结果与实验室过往rt-qpcr检测结果进行统计分析，比较二者的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率。[0077]2.8统计学方法[0078]采用spss18.0进行数据的统计分析，计量资料以“均数±标准差”表示；组间计量资料的比较采用t检验，p《0.05为差异有统计学意义。[0079]结果[0080]1rna标准品的构建结果[0081]人工合成的含有pgem-t载体的质粒dna经psti酶切和saci内切酶酶切后，割胶回收目的片段dna，电泳结果见图1，形成片段大小分别约为300bp和200bp目的片段，片段大小均符合预期，结果表明实验成功构建了cvb和tav的线性化dna。如图1所示。[0082]注：m代表d2000marker,cvb和tav分别代表菊花b病毒(chrysanthemumvirusb，cvb)和番茄不孕病毒(tomatoaspermyvirus，tav)[0083]2引物组合筛选结果[0084]本研究设计了4组引物探针组合，通过ncbi的blast，cvb和tav的4对引物仅对cvb和tav有扩增，特异性好。cvb和tav的4对引物组合对1.0ꢀ×106拷贝/ml的rna参考品均有阳性扩增；对1.0×104拷贝/ml的rna参考品，仅cvb-f2r2、cvb-f3r3和tav-f2r2、tav-f3r3有阳性扩增，其中cvb-f2r2和tav-f2r2引物组合扩增的荧光强度响应值和扩增线型均较cvb-f3r3和tav-f3r3引物组合好，确定cvb-f2r2和tav-f2r2作为最优引物组合进行[0085]rt-rpa双重荧光检测体系的优化，具体序列见表1。如图2-3所示。[0086]3扩增体系优化结果[0087]3.1引物浓度优化结果[0088]不同引物浓度对rt-rpa的检测灵敏度和平台期的荧光强度有影响。当cvb-f2r2p和tav-f2r2p组合引物浓度为200nmol/l时，对浓度为1.0×103拷贝/ml的rna参考品检测结果均为阴性，对浓度1.0×104拷贝/ml及以上的rna参考品检测结果均为阳性；当引物浓度为400nmol/l时，1.0×103拷贝/ml的cvb和tavrna参考品检测结果均为阳性，但tav荧光强度偏低；当引物浓度为600nmol/l时，1.0×103拷贝/ml的cvb检测结果为阳性，tav检测结果为阴性(见图3)。因此，确定rt-rpa检测体系中cvb和tav的引物浓度均为400nmol/l。如图4-9所示。[0089]3.2探针浓度优化结果[0090]不同探针浓度对cvb和tav的检测灵敏度和荧光强度有影响。cvb在探针浓度为100nmol/l时，对1.0×104拷贝/ml和1.0×103拷贝/ml的rna检测结果均为阳性，荧光强度高；tav在探针浓度为100nmol/l时，对1.0×104拷贝/ml的rna检测结果为阳性，而对1.0×103拷贝/ml的rna检测结果为阴性；cvb和tav在探针浓度为120nmol/l和150nmol/l时，对1.0×103拷贝/ml的rna检测结果均为阳性，扩增曲线一致。确定rt-rpa检测体系中cvb和tav的探针浓度分别为100nmol/l和120nmol/l。如图10-11所示。[0091]4扩增程序优化结果[0092]4.1不同反应温度[0093]rt-rpa反应体系在3种不同反应温度下(37℃、39℃、42℃)对1.0×104拷贝/ml的cvb和tav参考品检测结果均为阳性，反应温度为39℃时的平台期荧光强度较37℃和42℃高(见图5)，确定39℃最为最优反应温度。如图12-13所示。[0094]4.2不同反应时间[0095]1.0×104拷贝/ml的2种rna参考品在反应时间为5min时检测结果为阴性；在反应时间为10min时，2种病毒检测结果均为阳性，但扩增荧光信号未达到平台期；反应时间为15min时，2种病毒扩增荧光信号均达到平台期，确定15min作为最终反应时间。如图14所示。[0096]4性能评价[0097]4.1敏感性[0098]本研究构建的cvb和tavrt-rpa双重荧光检测方法对1.0×104拷贝/ml和1.0×103拷贝/ml的cvb和tavrna检出率均为100％，对5.0×102拷贝/ml的rna检出率分别为60％和40％，说明cvb和tav双重rt-rpa检测体系的最低检测限均为1.0×103拷贝/ml；与rt-qpcr最低检测限相同(见表2)，均具有较高的检测敏感性。[0099]表2敏感性检测结果[0100]table2detectionresultsofsensitivity[0101][0102]4.2特异性[0103]采用cvb和tavrt-rpa双重荧光检测方法对菊花b病毒、番茄不孕病毒、菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯y病毒、马铃薯x病毒和褪绿斑驳类病毒病毒核酸进行检测。仅cvb和tav检测结果成阳性，其他病毒核酸检测结果均为阴性，说明rt-rpa检测体系特异性好。如图15所示。[0104]注：tav、cvb、csvd、tmv、cmv、pvy、pvx和cchmvd分别代表番茄不孕病毒、菊花b病毒、菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯y病毒、马铃薯x病毒和褪绿斑驳类病毒[0105]note：tav、cvb、csvd、tmv、cmv、pvy、pvxandcchmvddenotechrysanthemumvirusb,tomatoaspermyvirus,chrysanthemumstuntviroid,tobaccomosaicvirus,cucumbermosaicvirus,tobaccopotatovirusy,tobaccopotatovirusxandchrysanthemumchloroticmottleviroid,respectively[0106]4.3重复性[0107]cvb在1.0×107拷贝/ml和1.0×104拷贝/ml的rna参考品中检测结果为阳性时的出峰时间(荧光强度达到1500时对应的拐点时间)t值变异系数分别为1.28％和3.50％；tav在1.0×107拷贝/ml和1.0×104拷贝/ml的rna参考品中检测结果为阳性时的出峰时间t值变异系数分别为1.15％和3.45％，均低于5％，表明本研究建立的rt-rpa双重荧光检测体系具有误差小、重复性好的优点。[0108]4.4样本测试[0109]对实验室留存的100例菊花标本分别采用rt-rpa和rt-qpcr进行同步检测，结果两种方法均检测出6例菊花b病毒和4例番茄不孕病毒，其余90例标本两种方法测结果均为阴性，说明两种方法的阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为100％，进一步证明了检测体系的准确性。[0110]结论与讨论[0111]逆转录酶重组酶恒温核酸扩增(rt-recombinasepolymeraseamplification,rt-rpa)是在恒温条件下，反应体系的m-mlv逆转录酶将rna直接逆转录为cdna后进行后续的重组酶扩增反应，rna的逆转录与dna的扩增在同一个反应体系和条件下进行，实现目的片段“一步法”扩增检测。影响rpa灵敏度的关键因素是引物和探针的设计，rpa的引物长度一般为30～35bp，以便于ssb结合，扩增产物长度通常控制在500bp以内，以100～200bp为宜，能够保证检测的反应速度和敏感性。此外，5′端3～5bp应当避免出现多个g；3′端尾端最好选择gc，为聚合酶提供稳定的结合区域；避免连续出现多个相同核苷酸；gc含量在30％～70％之间，避免引物形成二聚体和二级结构。探针长46～52个碱基，在第30个碱基附近的两个t碱基分别用一个荧光报告基团(fam-dt)和荧光淬灭基团(bhq-dt)替代t碱基，两个t碱基之间添加一个脱碱基位点(dspacer)取代所在位置碱基，探针5’端离dspacer至少30个碱基，探针3’端离dspacer至少15个碱基，同时3’端用c3-spacer进行封闭。此探针结构完整时，检测不到荧光基团发出的信号，随着扩增的进行，大肠杆菌核酸外切酶ⅲ可以识别并切割酶解thf残基，使荧光集团和淬灭基团分离，发出的荧光信号随着扩增产物同步积累。本研究参考上述引物探针的设计原则分别设计了4组不同长度的引物，采用中等浓度1.0×106拷贝/ml和低浓度1.0×104拷贝/ml的cvb和tavrna参考品进行不同引物探针组合筛选，结果表明不同rpa引物为对低浓度的核酸模板扩增能力存在一定的差异性，设计多个rpa引物组合并筛选最优组合可能是提高rpa检测灵敏度的关键因素之一。[0112]rt-rpa技术已经被广泛应用于各种病毒的检测中，目前的研究结果表明rt-rpa方法对单一病毒的检测具有较高的灵敏度和特异性。abdelwahed等建立中东呼吸综合征冠状病毒rt-rpa法检测，只需要3～7min就能检测最低10个拷贝的rna分子。escadafal等建立了lfd-rpa法检测黄热病病毒的方法，整个反应在20min内完成，检出限达到20个拷贝/反应；teoh等用rt-rpa方法检测登革热病毒，检出限为10个拷贝/反应。moore等建立了针对人类诺如病毒株gⅱ型的rt-rpa检测方法，该方法成功地从多个病例中检测到诺如病毒rna，检出限为log10(3.40±0.20)基因组拷贝；吕继洲等建立了一种新型冠状病毒s基因以及n基因的双重逆转录rpa检测方法，其分析敏感度s基因可达10拷贝/反应，n基因分析敏感度可达102拷贝/反应，分析特异性好。本研究基于rt-rpa方法建立了cvb和tav双重实时荧光检测技术，对cvb和tav的检测灵敏度均为2拷贝/反应，与实验室前期基于qpcr研究结果一致，实现了cvb和tav的单拷贝双重实时荧光检测，且对其他菊花病毒感染无交叉反应，表明本研究构建的cvb和tav双重实时荧光rt-rpa检测方法具有较强的应用价值。[0113]本研究所构建的cvb和tav双重实时荧光rt-rpa检测体系除了具有高灵敏度外，其对高浓度(1.0×107拷贝/ml)和低浓度(1.0×104拷贝/ml)的核酸检测重现性好；对不同菊花和植物病毒检测特异性强；整个检测时间仅需15min，为菊花病毒的检测和监测提供技术支持。[0114]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。[0115]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12当前第1页12